《CTAB法提取植物基因组DNA》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CTAB法提取植物基因组DNA（5页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、CTAB法提取植物基因组DNACTAB 法原理CTAB （Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵 ，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。当降低溶 液盐浓度到一定程度 （0.3 mol/L NaCl ）时，CTAB- 核酸的复合物从溶液中沉淀 ，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀 DNA ，而 CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中 (0.7mol/L NaCl) ， CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复
2、合物， 不能沉淀核酸。 CTAB 溶液在低于 15时会形成沉淀析出 ，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15。另外，它还能保护 DNA 不受内源核酸酶的降解。主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿异戊醇（ 241）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液： CTAB 20g/LNaCl（ 58.44） 1.4 mol/L （81.816g）EDTA （292.25） 10 mmol/L （2.9225g）Tris （121.14） 100 mmol/L （12.114g）pH 8.01 TE 缓冲液： EDTA
3、（292.25） 1 mmol/L （0.29225g）Tris （121.14） 10 mmol/L （ 1.2114g）pH 8.0NaAC 溶液： NaAC （82.03） 3mol/L （246.09g）pH 4.0植物总 DNA 的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加 PVP（聚乙烯吡咯烷酮 K30）少许，成粉末后转入 10mL 的离心管中，放入液氮或 -80冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的 DNA 量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。2、将（ 200ml） CTAB 溶液放于 65水浴锅中预热。3、加 4ml 巯基乙醇到预热的
4、 200mlCTAB 中。4、速加 3ml 预热的 CTAB 到装有粉末的 10mL 离心管中，之后放入 65水浴锅中，保温3060min，期间轻摇数次 （一般 20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动， 之后的晃动一定要轻柔）。5、加入 34ml氯仿异戊醇 （24 1）（在通风橱中操作） ，轻摇混匀至乳白色 （ 100200 次，剧烈晃动会使 DNA 机械切割）。6、1520， 11000 rpm离心 15min（CTAB 配平，相对应的离心管，质量相差0.03g）。7、取上清（ 用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA 链弄断。 ），加 0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，
5、可放入4冰箱过夜）。8、用毛细玻璃管将 DNA 絮状物挑出（ DNA 絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的 DNA 也增多）（或 4， 10000 rpm离心 5min，弃上清），放入新的离心管中，用 70%乙醇漂洗 2次，放置超净台中吹干。9、加入 2ml 1TE缓冲液溶解，可放入 4冰箱保存（酶活性在 4或 65水浴中最低，防止酶降解 DNA ）。10、未溶解的，可放入 65水浴中促其溶解， 10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。11、加入 2.5ul RNaseA（ RNaseA提前拿出融化），10离心，升至 4000 rpm即停，使 RNaseA
6、和溶液充分混合。12、37水浴，保温 1h。13、加入 1ml Tris- 苯酚、 1ml氯仿异戊醇（ 241），摇均配平， 4， 11000 rpm离心10min。14、取上清，加1TE补至 2ml，加 2ml氯仿异戊醇（ 241）摇均配平， 4，11000 rpm 离心 10min 。15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。16、取上清，加 0.1倍上清液体积的 NaAC，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入 -20 冰箱），摇均，放入 -20冰箱沉淀 30min。17、用毛细玻璃管将 DNA 挑出（或用无水乙醇配平， 4，10000 rpm离心 4min，弃上清），放入新的离心管中
7、，用 70%乙醇漂洗 2次，转入 1.5ml离心管，放置超净台中吹干。18、将 DNA溶于适量的 1TE缓冲液中，短期 4保存，长期 -80冰箱中储存。19、取少量 DNA 溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为 0.8%，检测其完整性。并用紫外分光光度计测其浓度。注解：1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。2、CTAB ：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；3、NaCl：提供一个高盐环境，使DNA 充分溶解，在于液相中；4、EDTA ：螯合 Mg2+ 或 Mn2+离子，抑制 DNas
8、e 活性；5、Tris (pH8.0) ：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；6、-巯基乙醇：是抗氧化剂 ，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚容易去除。7、苯酚： 使蛋白质变性， 同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断 ,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。使用酚的优点： （1）有效变性蛋白质；（2）抑制了 DNase 的降解作用。缺点：（1）能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly(A)RNA 。（2）不能完全抑制 RNase 的活性。8、氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。最
9、后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中） 。9、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。基因组 DNA 提取常见问题：1、DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质：重新纯化 DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀 DNA 。2、DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：让酒精充分挥发，增加 70% 乙醇洗涤的次数 (2-3 次 )3、DNA 中有 RNA 的存留：加入RNase降解 RNA 。4、材料不新鲜或反复冻融：尽量取
10、新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。5、未很好抑制内源核酸酶的活性：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。6、提取过程操作过于剧烈，DNA 被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。7、外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。8、反复冻融。将DNA 分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。冰冻材料提出高质量的基因组DNA ，应确保以下几点：1、确保采样后立即投入液氮中保存。2、在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温，否则会 DNA 降解得很厉害。装管的时候，先将几个离心管放入一个装有液氮的容器内，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。
CTAB法提取植物基因组DNA
