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1、项目名称 +实验步骤编号 2016PEDV-0101-DC试验名称pet28a -PEDV-epitopes试验类型预实验对照试验产品研发试验替补试验复核试验目的意义原核表达线性表位抗原，配合酵母，杆状病毒表达的蓝耳非线性表位抗原，混合配苗使用研究内容构建表达载体，表达蓝耳线性表位抗原，用于动物评价pet28a -PEDV-epitopes合成的 PEDV质粒 pet28aBamH 、 Hind PEDV 基因片段（ 1557 bp ）技术路线BamH 、 Hind Solution 连接，转化质粒 pet28a-PEDV-epitopespet28a 载体片段（ 5172 bp）提质粒，酶切
2、鉴定后，送测序摇瓶表达， SDS-PAGE 检测、 WB 检测人员安排内容时间表达载体构建，测序验证2016年 9月 15日 -9月22日进度安排蓝耳预表达，可溶性检测2016年 9月 22日 -9月25日蛋白纯化（ 5mg左右纯度 90%以上的目的蛋白）2016年 9月 25日-2016 年 9 月 31 日1. 质粒 pet28a ( 武汉实验室 )2. 合成的 PEDV-puc573. 限制性内切酶 BamH、 Hind 4. 连接酶 Solution 5. 大肠杆菌菌株： DH5， BL21(DE3)6. 合成的 puc-57-PEDV epitopes 经过 BamH、 Hind 双
3、酶切后与线性载体连接Cgcggatccggcggtggcagcgccaaatttgttgccgcatggaccctgaaagccgcagcaggtggcggcagtgcacaggt试验材料tatcaacaccaacagcctgagcctgctgacccagaacaatttaaataaaagccaaagtgcactgggtaccgccatcgaacgtct gagcagcggcctgcgcatcaacagcgccaaagacgatgcagccggtcaggccatcgccaatcgctttaccgccaatattaaggg cctgacacaggcaagccgcaatgccaatgatggcat
4、cagcattgcacagacaacagagggcgcactgaacgaaatcaacaacaa cctgcagcgtgttcgcgaactggccgttcagagcgccaacagcacaaacagccagagcgatctggatagcattcaggccgaaat cacccagcgcctgaatgaaatcgaccgtgtgagcggccaaacccagttcaacggcgttaaggttctggcccaggataacaccct gaccatccaagttggcgccaacgacggcgagaccatcgacatcgacctgaagcagatcaacagccaaaccctgggcggtgc
5、acc tgttgatccggcaagcccgtggaccgaaaatccgctgcagaaaatcgatgccgccttagcacaggtggatgcactgcgtagcga cctgggcgcagttcagaatcgcttcaacagtgccatcaccaacctgggcaataccgttaataacttaagcgaagcccgcagccg cattgaggatagcgactatgccaccgaggtgagtaacatgagccgtgcccagattctgcagcaggcaggcacaagcgttctggc ccaagcaaatcaggtgccgcagaatgtgctgagtctgttac
6、gcggtggcggcagcctcgaggtgaccctgccgagtttcaatga ccatagctttgtgaatattaccgttagcgcctcttttggcggtcatagcggtgccaacctgatcgccagcgacaccaccatcaacggtttcagcagcttttgcgtggatacccgccagtttaccatcagcctgttctacaatgttaccaatagctatggttatgtgagcaaaagccaggatagtaactgcccgttcaccctgcagagtgtgaatgactacctgagctttagcaagttctgtgtgagcaccagtctg
7、ctggccagcgcctgcacaatcgacctgtttggttacccggaattcggcagcggcgtgaaatttaccagtctgtattttcagttcacaaaaggtgagctgatcaccggcacccctaagccgctggaaggtgtgaccgatgtgggtggcggcagctacagcaacatcggtgtgtgtaaaggcggtgggtcgagccagagcggccaggtgaagattggcggtgggtcgggtcctcgcctgcagccgtatggcggtgggtcgtgggcattctatgtgcgcggcggcggcagcacagccaaaagc
8、aaaaagtttccgagttataccgccacctatcagtttggcggtgggtcggctagcggtaccaaggacgaattaggtacctaatgaaagcttctgcga(PEDV:1572bp)1.用 BamH、 Hind 分别双酶切质粒pet28a （胶回收 6620 bp 的 pet28a 载体片段）和合成的 PEDV（胶回收 1557 bp 的 PEDV基因片段）。2. 用 Solution 连接胶回收的 pet28a 载体片段和 PEDV基因片段， 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。3.提取质粒，酶切鉴定后送测序，测序正确的质粒即为重组质粒pet28a -PED
9、V-epitopes 。4.质粒 pet28a -PEDV-epitopes 转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态。试验方法5. 接种单菌落至加有适量相应抗生素的 LB 液体培养基， 37 200 rpm 培养至 OD600 0.6, 加入诱导剂诱导目的蛋白表达。6. 诱导结束后，收集菌体。7.适当缓冲液重悬菌体后，超声波破菌。离心分离破菌后上清和沉淀，SDS-PAGE检测、 WB检测蛋白表达情况。8.蛋白纯化结果汇总分析结果复核检验样品编号保存条件和数量样品保存样品保存人保存位置和日期样品理论保存时间样品详细备案执行人 / 日期执行人 / 日期复核人 / 日期复核人 / 日期执行人 / 日期复核人 / 日期制卡人发卡人接卡人执行人收卡人归档人注：制卡人指方案制定人员；发卡人指对该流程卡终审确认签字人，两人签字有效；接卡人指项目主管或助管；执行人指参与实验操作的人员；收卡人必须是部门主管或助管和发卡人共同签字；归档人由学术委员会常务委员任命二人共同负责签字。
猪流行性腹泻PEDV亚单位疫苗表达流程卡
