大鼠小肠缺血再灌注后血中NO和SOD浓度与肺损伤的相关性研究

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1、大鼠小肠缺血再灌注后血中NO和SOD浓度与肺损伤的相关性研究 作者：李纪鹏董光龙王为忠项红军【摘要】 目的：探讨大鼠小肠缺血再灌注后血中一氧化氮（NO），超氧化物歧化酶（superoxide diamutase, SOD）的浓度变化与肺组织中Bax、Bcl-2、p53的表达及肺组织超微结构变化的相关性。方法：建立小肠缺血再灌注模型，分为对照组，再灌注后0、30 min，1、2 h，1、3、7 d共8组，于各时相点检测血中NO和SOD的浓度，用免疫组织化学SP法观察肺组织中Bax、Bcl-2、p53的表达情况，透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构变化。结果：大鼠小肠缺血再灌注后0 min NO浓

2、度升高，但至再灌注2 h时则明显降低，其后又持续升高，至再灌注7 d时达高峰。SOD浓度在再灌注0 min明显下降，再灌注2 h时升高，随后持续下降，至再灌注7 d时达最低水平。Bax、Bcl-2免疫阳性细胞主要位于肺组织中血管内皮细胞和肺泡上皮细胞。再灌注0 min，Bax、Bcl-2阳性细胞表达率升高，30 min时其阳性细胞表达率均分别升高为17.1%和78.1%，Bcl-2表达高于Bax（P0.01）。2 h时降低，其后升高，7 d时阳性细胞表达率达到高峰，分别为94.1%和83.4%，Bax表达明显高于Bcl-2（P0.01）。透射电子显微镜显示肺组织细胞超微结构损伤改变。结论：血中

3、NO、SOD浓度变化和肺组织中超微结构的改变说明小肠缺血再灌注后可引起肺组织细胞凋亡和损伤，而大鼠小肠缺血再灌注后Bax、Bcl-2、 p53在肺组织细胞中的阳性表达均有明显改变并可能引起细胞凋亡和损伤。 【关键词】 缺血再灌注损伤小肠肺损伤一氧化氮超氧化物歧化酶 【ABSTRACT】 Objective: To study the changes of concentration of NO, SOD in serum and the expression of Bax, Bcl-2, P53 and the changes of ultrastructure in the lung. Me

4、thods: Models of ischemia reperfusion of small intestine were established at 0, 30min, 1, 2h, 1, 3, 7d after reperfusion. The concentration of NO, SOD in the serum was examined at the same time .The expressions of Bax, Bcl-2 and P53 in the lung were observed by immunohistochemical SP method and the

5、changes of ultrastructure in the lung were observed by transmission electron microscopy. Results: The concentration of NO increased apparently 0 minute after reperfusion, but decreased after two hours, then increased gradually to a peak at seven days. The concentration of SOD decreased 0 minute afte

6、r reperfusion, increased after two hours, and decreased to the lowest level at seven days. The Bax ,Bcl-2, P53 positive cells were observed in lung tissue The ratio of positive cells of Bax, Bcl-2 and P53 began to increase after 0 min and increased continuously after reperfusion 30min, with the rate

7、 of positive cells of Bcl-2 higher than that of Bax（P<0.01）.But they decreased apparently at 2h, then increased and reached the peak 7d after reperfusion, with the rate of Bax higher than that of Bcl-2（P<0.01）.Transmission electron microscopy showed injuries in the lung. Conclusion: The change

8、s of concentration of NO, SOD and the ultrastructural changes suggest the apoptosis and injuries in the lung. 【KEY WORDS】 Reperfusion injuryIntestine，smallLung injuryNitric oxideSuperoxide dismutase 缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）是临床上常见的一种损伤现象，缺血再灌注（ischemia reperfusion, IR）所产生的反应性氧中间产物激活炎

9、症免疫细胞，产生全身炎性反应，随后早期即可引起远处器官如肺、肝、肾等损伤，有研究表明严重的肢体缺血再灌注（limb ischemia reperfusion, LIR） 可致急性肺损伤（acute lung injury, ALI）1。这种ALI的病理组织学变化主要为肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛受损，但其确切机制和损伤方式仍不十分清楚2。本研究通过建立大鼠小肠IR模型，研究血清中超氧化物歧化酶（superoxide diamutase, SOD）的表达及肺中Bax、Bcl-2、p53的表达及电子显微镜下组织超微结构的变化情况，探讨小肠IRI后对于肺的损伤及其机制，为研究不同因素引起的IR对

10、远处器官的次级损害的机制和防治建立基础。 1材料与方法 1.1实验材料采用由第四军医大学实验动物中心提供的雄性Wistar大鼠64只，体质量200300 g。随机分成正常对照组，IR后0、30 min，1、2 h和1、3、7 d共8组。 1.2主要试剂Bcl-2、Bax和p53鼠单克隆抗体（MBI公司），SP免疫组织化学染色超敏试剂盒（福州迈新生物技术公司），DAB显色试剂盒（Sigma公司），速眠新（购自长春农牧大学兽医研究所）。 1.3制备模型以速眠新（0.5 mL/kg）肌肉注射麻醉后，仰卧位固定于操作板上，按无菌手术操作开腹、提出小肠，于肠系膜根部分离肠系膜上动脉，用10号丝线结扎阻断

11、30 min后松开恢复血流。于开放后0（动脉开放即刻）、30 min，1、2 h，1、3、7 d分别切取肺组织块置入40 g/L戊二醛固定；并取其组织以4%多聚甲醛磷酸缓冲液（0.01 mol/L PBS, pH=7.4）固定。 1.4NO和SOD的测定NO测定：设空白管（不加标本和亚硝酸钠）、标准管（加入20 mol/L亚硝酸钠）和测定管（加入0.3 mL待测血清）。各管混匀放置10 min，3 5004 000 r/min离心10 min，取上清液0.8 mL。加入显色剂0.4 mL混匀，15 min后测其吸光度值。在提前制备的标准曲线（亚硝酸钠系列溶液）查找相应NO浓度。SOD测定：按测

12、试盒要求设测定管和对照管，测试管中加入各种反应液和待测血清混匀。37 恒温水浴40 min，加显色剂混匀，10 min后倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，用酶标仪于波长550 nm比色。按公式SOD活力（NU/mL，亚硝酸盐单位/毫升）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度2稀释液倍数，计算SOD活力。对照管中不加血清样本，其他同测定管。 1.5免疫组织化学方法Bax、Bcl-2和p53测定：组织块脱水、石蜡包埋3 m厚切片。切片经脱蜡水化后，PBS漂洗10 min，依次以氧化酶阻断剂和非免疫血清室温孵育10 min，PBS漂洗15 min后，切片分别滴加Bcl-2、Bax和p53

13、单克隆抗体室温孵育60 min，PBS漂洗，再依次滴加生物素标记第二抗体和链霉菌抗生物素蛋白（三抗）室温孵育10 min，最后以DAB反应510 min，自来水终止反应及PBS漂洗。以苏木精复染后，切片经乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片光镜下观察。用PBS分别代替第一、二、三抗体做阴性对照。结果判定：细胞质内出现棕黄色颗粒或匀质样棕黄色结构为Bcl-2、Bax免疫反应阳性细胞；p53免疫阳性细胞细胞核呈深染棕黄色颗粒，部分细胞质也有少许染色。各例切片连续观察5个高倍视野，计数每100个细胞中的阳性细胞数为阳性细胞率。 1.6电子显微镜观察规定时间内取肺组织切成1 mm1 mm1 mm组织块，置4

14、0 g/L戊二醛固定4 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）漂洗；10 g/L四氧化锇固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗，常规丙酮脱水。Epon 812包埋，70 、8 h聚合。LKBNOVA型超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅电子染色，JEM-2000EX电子显微镜观察并拍摄照片，加速电压10 kV。 1.7统计学处理采用SPSS11.0统计软件包进行分析，所得数据以xs表示，进行组间方差分析（F检验）。P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1NO和SOD的浓度改变大鼠小肠IR后NO浓度在再灌注0 min明显升高，但至再灌注2 h时明显降低，其后又持续升高，至再灌注

15、7 d时达高峰；SOD浓度在再灌注0 min明显下降，再灌注2 h时升高，随后持续下降，至再灌注7 d时达最低水平（表1）。 2.2肺组织中Bax、Bcl-2和p53的表达再灌注0 min，Bax、Bcl-2和p53阳性细胞表达率开始升高，再灌注30 min，Bax、Bcl-2和p53阳性细胞表达率均明显升高，分别为17.1%和78.1%和7.12%（表2），Bcl-2阳性细胞率明显高于Bax阳性细胞率，两者差异有统计学意义（P0.01）。但至2 h时明显降低，其后持续升高，7 d时阳性细胞率达到最高水平，分别为94.1%和83.4%和39.7%（见表2），Bax阳性细胞更为密集，其阳性细胞率

16、明显高于Bcl-2阳性细胞率，两者差异有统计学意义（P0.01，图1）。 2.3肺组织超微结构的改变肺泡间隔略有增宽，毛细血管可见大量中性粒细胞并附壁，基膜完整，肺泡型细胞排空明显，并脱落至肺泡腔，变性坏死明显（图2）。 3讨论 小肠IR后可引起氧自由基损伤、钙离子超载、炎性损伤、细菌易位及细胞凋亡等，主要表现为中性粒细胞聚集、微血管收缩、血小板及中性粒细胞黏附聚集、血流降低等3-4，其中氧自由基的改变，可激活相关酶系统及凋亡相关基因，诱导细胞凋亡5-6，造成组织细胞功能和形态上的损伤,引起肺脏和肝脏的次级损伤，因此表明小肠IR除引起肠组织本身损伤外，引起的远隔脏器的次级损伤十分明显，并发现与

17、患者术后1周内发生的多脏器功能衰竭及并发症等有关。 近年来的一些体内外研究表明: IR、缺血、缺氧等除引发肺泡上皮细胞坏死外,还使肺泡上皮细胞发生凋亡7。许多炎症介质和细胞因子均影响凋亡过程。内源性NO升高在LIR后引起的ALI中起拮抗作用。其机制可能与NO降低血管的反应性，维持器官的血液灌流、抗血小板和白细胞聚集，清除氧自由基、抑制脂质过氧化和改善微循环有关。本研究中，小肠IR后0 min，NO水平明显升高（P0.01）。此后开始下降，至2 h降至最低，说明在小肠IR早期，血流恢复过程中，NO机体反应性合成增加，对于小肠具有保护作用。随后由于分解作用，与氧自由基的结合而持续降至最低，但是随着

18、小肠IR时间的延长，NO的合成逐渐增加，至7 d时明显超过正常（P0.01）。有研究显示NO的过量生成将会损伤组织细胞8。NO将参与中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的毒性作用，同时与O2结合生成过氧亚硝基，过氧亚硝基可直接或通过分解成许多小分子毒性物质损伤细胞。NO通过这些毒性作用可直接损伤细胞的DNA或作用于细胞的凋亡的信号通路或协同其他细胞因子诱导细胞凋亡9，同时在凋亡细胞中，一氧化氮合酶mRNA表达明显增强，说明NO能够诱导凋亡10-11。小肠IR后0 min， SOD由于清除氧自由基消耗而出现下降（P0.01），随着血流的恢复合成增加，至2 h SOD浓度虽然有所恢复，但是随着再灌注时间

19、的延长，氧自由基的增加，SOD由于清除作用消耗而再次持续降低，至7 d时明显低于正常（P0.01）。以上NO和SOD浓度的改变均提示血中氧自由基增加，以及氧自由基对组织细胞的损伤作用。 既往研究较多的是自由基损伤和细胞内钙超载及过度的炎症反应所致的肺组织细胞坏死12,近年来体内外大量研究表明许多影响因素均可引起肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡13，而细胞因子的产生则是导致细胞凋亡的重要因素之一。在本研究中，小肠IR后30 min，肺组织中Bax、Bcl-2、p53表达较正常明显增加（P0.01），Bcl-2的表达明显高于Bax （P0.01），存活基因Bcl-2的表达增加阻抑肺组织细胞凋亡过程

20、，但随着再灌注时间的延长，Bax 和p53的表达增强，Bcl-2表达降低，但Bax的表达明显高于Bcl-2（P0.01）。Bax是重要的异二聚体伴分子，与Bcl-2共存于线粒体，Bax可与Bcl-2结合成杂二聚体抑制Bax的促凋亡作用14。Bcl-2必须结合Bax才能发挥其作用，Bcl-2的过度表达与Bax形成异二聚体而阻抑凋亡15-16，p53是Bax和Bcl-2基因的调节物，其基因产物p53蛋白是一个转录激活蛋白，可引起细胞周期阻滞，诱导凋亡促进分化17，说明肺组织细胞内凋亡相关基因明显被激活，将可能引起各远处器官组织的损伤。 电子显微镜下观察到肺组织中大量中性粒细胞在毛细血管中堆积并阻塞

21、毛细血管，中性粒细胞介导的细胞凋亡作用也比较明显，肺泡型细胞变性坏死，脱落至肺泡腔。肺组织超微结构的改变中，线粒体是细胞代谢的中心场所，线粒体的正常呼吸功能和ATP生成对组织器官功能及细胞结构的完整性至关重要，而细胞核是真核细胞内最大的细胞器，是遗传物质储存、复制、转录的场所，是生命活动的控制中心。有研究显示，细胞核内染色质边集、固缩、凝集成块状被认为是caspase活化的DNA酶进入细胞核内使染色体的DNA断裂而引起细胞死亡和凋亡的表现。线粒体对缺血、缺氧非常敏感，组织在血流恢复或复氧后其损伤度不但没有改善，反而进一步加重，这与细胞钙超载、氧自由基等因素有直接的关系。黄嘌呤氧化酶和中性白细胞

22、是氧自由基的两个重要来源，缺血和再灌注均可产生较多超氧化物，引起组织损伤，线粒体也是IR期间活性氧产生的重要器官。线粒体是联系钙超载、氧自由基和细胞凋亡的中心环节。 本研究进一步说明小肠IR后不仅有小肠组织本身的损伤，还可对肺组织造成严重的次级损害，而细胞凋亡在其中具有举足轻重的作用, 如何有效的抑制细胞凋亡的发生，将会减轻IR对肺组织的损伤，减少患者术后多脏器功能衰竭及并发症的发生具有重要的意义。【参考文献】 1 高丹，孔小燕，董淑云，等.肢体IR后的肺损伤和细胞凋亡及NO的效应J.中国病理生理杂志，2007，23（11）：2214-2221.2 Shinbori T, Walczak H,

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