SDS-PAGE电泳常见问题解答

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1、1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDS PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 TrisHCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用 的Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH环境呈弱酸性，因此 甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而 CL 离子却很 高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起， 浓缩为一狭窄的区带。 当样品进入分离 胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增 加，直接紧随氯离子之后， 同时由于分离

2、胶孔径的缩小，在电场的作 用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排 除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处 理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原 SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT （或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白 相结合的分子，在电泳中， 只根据分子量来分离。一般电泳均按这种 方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5

3、min， 再离心加样。2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸 胺可捕集过量的 DTT ，而防止银染时的纹理现象。 100ul 样品缓冲液 中 10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温 30min 。3）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只 用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不 可作为测定分子量来使用。3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用： 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体， 其凝 固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

4、制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9，选择tris HCL 系统， TEMED 与 AP： AP 提供自由基， TEMED 是催化剂， 催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）:阳离子去污剂,作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠。4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法：待 凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致 SDS 结晶。一般 凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有

5、氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染 料又各自不同的染色方法, 具体可参照郭尧君编著的 蛋白质电泳技 术手册 P82-103。5. “ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致， 多出现于较厚的 凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中， 一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时

6、间过长，重新配制；降低凝胶浓度。8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。9. 什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带” 就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时， 常会出现 在泳道顶端 （有时在浓缩胶中） 的一些大分子未知条带或加样孔底部 有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性， 致使原 来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分 子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标 条带有相同的免疫学活性， 在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 B

7、eta 巯基乙 醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未 跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer ；降低分离胶的浓度。11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正 确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。 比如电压 50v 以上，可电流却在5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确

8、装配，电流未形成通路。包 括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比 如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中， 一般对电泳不会有太大的影响。 前者 主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致； 后者是由于在解除制胶的 夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED ，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被 氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是 APS和TEMED用

9、量过多，此 时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15. 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误，即缓 冲系统地 PH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强 度太高。我们实验室的传统也是将倒完的胶放在冰箱内过夜凝聚， 第二天跑胶 效果非常好。我想主要原因并不在于低温，而在于过夜时间长，让胶 凝聚得非常充分而且均匀。反之，在 37 温箱内虽然凝得很快，但是 容易出现胶脆，凝聚不均匀等情况。我想只要你得配液没问题，那么 适当延长凝胶时间肯定效果会好些！ 温度的高低决定了胶聚合的速度：高温有助于胶的聚合。但是，胶聚 合得越快，其脆性也越大。因此，一般把胶的聚合时

10、间控制在 40-60 分钟左右为宜。 当然，灌胶后放入 4 度聚合，其聚合时间会大大延长， 但是其脆性也会大大降低上层的浓缩胶用的是 Tris-HCL 缓冲液， PH6.8， HCL 的解离度大， 几乎全部成 CL- ，CL-在电场中移动最快。而电泳槽中含有甘氨酸，在PH6.8时只有少量解离，在电场中移动的最慢。蛋白质（被夹在中间）就在由快慢离子形成的电位梯度中被浓缩了。下层的分离胶用的是Tris-甘氨酸缓冲液，PH8.8,在此PH下，甘 氨酸解离度增大，泳动速度增加并超过了蛋白质， 原先的电位梯度消失， 大小形状不同 的蛋白质在电场中分离。电泳结果的好坏肯定和电泳的条件有关 ,我认为应该注意

11、以下几点 :1, 样品的纯度高 ,杂质含量少 ,选择的 Loading 要正确;2, 就是胶的浓度要控制好 ,看你跑的条带大小来选择胶的浓度 ,特别是 分离胶的浓度 !3, 就是电压的选择 ,当样品在浓缩胶里时 ,可以把电压调小点 ,当到分离 胶时,电压可以加大 ,这样跑的条带就清晰 !4, 点样品的量要控制好 ,不能太多 ,否则就跑成团状 ,也不能太少 ,条带 不清晰!至于样品和 Marker 显色问题 ,那要看你用的 Marker 是预染 Marker 还 是非预染Marker,如果用的是预染 Marker,那就是跑胶时，Marker条带 先显现出来！如果是非预染Marker,那条带就和样

12、品一起染色时显现出 来!SDS-PAGE经验集锦：极其好用2009-06-28 00:17蛋白SDS-PAGE电 泳及定量在蛋白质技术手册 5基础上，根据实验条件的方便修改。 请仔细看各种细节改良，各种操作效果经本实验室 5 年验证。【一】 储存液配制(注意配方和实际测定参数！ ！)(1) 2 M Tris-HCI (实测 pH 8.9 0.1, 25C) 500 mL: 121 g Tris base 加350 mL双蒸水溶解，以玻璃棒搅拌约1 min,缓慢加入浓盐酸(11.8 M)20 mL,继续搅拌均匀，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入适 量双蒸水至500 mL,倒入无色玻璃试剂瓶中

13、，4C冰箱保存。(2) 100 g/L SDS 溶液： 10 g SDS (要求高纯度,其质量明显影响 电泳效果)加 100 mL 双蒸水,于洁净的 250 mL 烧杯中进行微波加 热溶解,注意不要爆沸,间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解,完全溶解后的溶液应清澈透明无色。倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱保存。冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化。(3) 75% (v/v)甘油：于500 mL量筒中倒入分析纯甘油 300 mL,加双蒸水100 mL,以一次性塑料手套封口，颠倒量筒使甘油完全溶解，然后倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱保存。(4) 10 g/L溴酚蓝溶液：500 mg溴酚蓝加双蒸水50 mL,搅

14、拌溶解， 倒入棕色玻璃试剂瓶中，4 C冰箱保存。不用过滤。用时注意吸取上 层澄清液，不要吸到沉淀。【二】电泳工作液配制(省劲好用！ ！)(1) Acr-Bis液(丙烯酰胺溶液)500 mL:于800 mL洁净的烧杯中， 依次称取双丙烯酰胺4 g,丙烯酰胺146 g,缓慢倒入双蒸水约350 mL, 以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。 注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中， 所以要称重时注意周围空气流速, 称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双 丙烯酰胺掩盖。玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺 浮起并扩散到空气中。 完全溶解的溶液应清澈无色透明。 待溶解完全 后补加双蒸水至500 mL,倒入无色玻璃试剂

15、瓶中，4C冰箱可保存10 个月。(2) 4X分离胶缓冲液，500 mL :于500 mL洁净的量筒中，依次加入 375 mL 2 M Tris-HCI (实测 pH 8.9 0.1, 25C),100 g/L SDS 溶液(冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化)20 mL,最后加入适量双蒸水至500 mL。倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱最少可保存12 个月。有时冰箱温度过低会使储存液混浊, 微波略微加热使其澄清后 即可使用。( 3) 100 g/L 过硫酸铵溶液 (ammonium persuIfate, AP)20 mL: 2g 过 硫酸铵加20 mL双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4C冰箱最

16、少可保 存10个月。注意配胶时不要交叉污染 TEMED，可以以5 mL分装到 4 个无色塑料试剂瓶中分别保存。(4) TEMED成品液：购买后分装成2或5 mL小管装使用可避免母 液受到污染。(5) 5X样品缓冲液，100 mL:依次加入50 mL 75% (v/v)甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液， 10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液， 5 mL 2 M Tris-HCI (实测 pH8.9士 0.1, 25C), 5 mL 巯基乙醇，9 mL 双蒸水。 混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4C冰箱至少可保存12个月。可分 装成 10 mL 使用，不会使母液受到蛋白污染。(6) 1

17、0X 电泳缓冲液，1000 mL: 称取 10 g SDS, 30 g Tris base,144g 甘氨酸(事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色的产品)于1000 mL的烧杯中，加水约700 mL溶解，可微波炉加热(Seperati ng gel buffer1 mL pH8.9H2O2.3 mL100 g/L AP30 LTEMED （ A% *10mL ） /30% mL2.5 mL pH8.9补 足 10mL其中的H20补足10mL,所用的计算公式为:10mL-2.5mL- （A% *10mL）/30% mL 。例如 6%的配方中，30% Acr-Bis solution2

18、mLH2O5.5 mL例如 12.5%的配方中，30% Acr-Bis solution4 mLH2O3.5 mL例如 15%的配方中，30% Acr-Bis solution5 mLH2O2.5 mL四】 考马斯亮蓝染色和脱色（极其好用！ ！）考马斯亮蓝染色液 1000 mL：先称取考马斯亮蓝 R250 1.0 g 于 1000 mL 试剂瓶内，加入甲醇 450mL 溶解，再加冰醋酸 100 mL 和双蒸水 450 mL 至大约 1000 mL。 室温可放置 12 个月以上。染色液可倒入专用的回收试剂瓶，届时加 入适量甲醇、考马斯亮蓝和大约10 g/L的三氯乙酸后可重复使用。考马斯亮蓝脱色液

19、 10 L：于10 L洁净塑料桶内装入工业乙醇 2 L ,冰醋酸500 mL ,加入去离 子水至10 L,混匀，室温可放置12个月以上。蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色： 凝胶的染色和脱色于合适体积的微波炉盒中进行。 电泳后的凝胶加入 染色液（以刚没过凝胶即可），于微波炉加热约40-70 sec至染色液刚 刚沸腾（注意塑料盒的盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸出） ，然后 于脱色摇床上继续染色约 10 min 即可。染色液请倒入专用的回收容 器内。以自来水小心地淋洗凝胶冲去剩余染料， 然后倒入适量的脱色 液，微波加热至刚沸腾后于染色摇床上摇动约10 min，倒掉脱色液，此时凝胶的蛋白条带即可看清。 重复以上脱色步骤一次， 即可看清电 泳条带。扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色， 这需要重新换上 脱色液室温摇床脱色 2 h 以上。五】 蛋白上样量的选择 要根据具体情况决定， 对于考马斯亮蓝染色， 如果样品为菌体蛋白样 品，有至少50条以上的条带要显出来，需要上样量在15卩g左右即 可，如果蛋白条带少于 6 条，如蛋白 Marker 或纯化阶段后期的蛋白 样品，上样量可减少至2卩g即可显出清晰的条带。【简化成大肠杆菌上样， 大约等于 5.0 个 OD600 上样 10-15 uL 左右】【本内容由华东理工大学鲁华生物技术研究所提供， 尊重作者劳动成 果，转帖请注明】