最新卫生化学——第5章荧光分析法.

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1、1第第 五五 章章荧荧 光光 分分 析析 法法Fluorometry2概述概述某些化合物在受到光辐射后，除了吸收某种某些化合物在受到光辐射后，除了吸收某种波长的光之外，还会发射比原来所吸收的波波长的光之外，还会发射比原来所吸收的波长更长的光长更长的光光致发光现象光致发光现象光致发光光致发光荧光荧光磷光磷光分子荧光分子荧光原子荧光原子荧光荧光分析法：荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及强根据物质的荧光谱线位置及强度进行物质鉴定和含量分析的方法。度进行物质鉴定和含量分析的方法。34FLU与与UV-Vis的比较的比较FLUUV-Vis光谱性质光谱性质发射光谱发射光谱吸收光谱吸收光谱被测物的性质被测物

2、的性质很强的紫外很强的紫外-可见光吸收可见光吸收有紫外有紫外-可可见光吸收见光吸收灵敏度灵敏度高，高，10-1010-12g/ml一般一般选择性选择性高高低低但在光谱分析中，荧光分析法不及紫外但在光谱分析中，荧光分析法不及紫外-可可见分光光度法普遍，这主要是由于有机分见分光光度法普遍，这主要是由于有机分子的结构所决定的子的结构所决定的能发荧光的物质较少能发荧光的物质较少5NNNNNNNOHOHNHOHOH3COOOHCH3双嘧达莫双嘧达莫萘普生萘普生几个常见的发荧光的药物几个常见的发荧光的药物6 黄曲霉毒素结构7苯并(a)芘 世界公认的三大强致癌物质是 黄曲霉毒素、苯并芘和亚硝胺 8NNNHN

3、CH3H3COOOHOHOHOH核黄素核黄素NOCOOHFHNN环丙沙星环丙沙星9第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理 一）一）、荧光的产生荧光的产生 分子内部能量之间的关系分子内部能量之间的关系 物质对光的选择性吸收与分子内量子化的物质对光的选择性吸收与分子内量子化的内部运动紧密相关：内部运动紧密相关： E总总=E电电+E振振+E转转E电电为为电子运动的能级；位于紫外可见光区域电子运动的能级；位于紫外可见光区域E振振为分子振动的能级；主要用于红外光谱分析为分子振动的能级；主要用于红外光谱分析E转转为分子转动能级，很微弱，难以测到纯粹的为分子转动能级，很微弱，难以测到纯粹的E

4、转转一一 分子荧光的产生分子荧光的产生10基态：电子自旋配对，基态：电子自旋配对，多重度多重度=2s+1=1，为单，为单重态，以重态，以S0表示。表示。激发单重态：分子吸收能激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单为单重态，称为激发单重态，以重态，以S1，S2表示表示激发三重态：分子吸收能激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三为三重态，称为激发三重态，以重态，以T1，T2.表示。表示。三重态能级低于单重态三重态能级低于单重态(Hund规则规则)112分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程 分

5、子的电子能态的激发包含了电子从基态轨分子的电子能态的激发包含了电子从基态轨道跃迁到激发轨道，分子的能量随着增加。道跃迁到激发轨道，分子的能量随着增加。 大多数分子含有偶数个电子，处于基态时，大多数分子含有偶数个电子，处于基态时，电子成对地填在能量的最低各轨道上。电子成对地填在能量的最低各轨道上。根据根据Pauling不相容原理不相容原理：一个给定轨道的两个：一个给定轨道的两个电子，自旋方向一定相反，自旋量子数为电子，自旋方向一定相反，自旋量子数为1/2 与与 -1/2，总自旋量子数，总自旋量子数S=0。 分子的多重性分子的多重性M=2S+1=1. 此种情形称为此种情形称为单重基态单重基态(S0

6、)，这些分子放在，这些分子放在磁场中，没有发生能级分裂。磁场中，没有发生能级分裂。即基态没有净自旋即基态没有净自旋。电子轨道电子轨道12当基态的一个电子吸收光辐射后被激发到较高当基态的一个电子吸收光辐射后被激发到较高的电子能态时，通常电子不发生自旋方向的改的电子能态时，通常电子不发生自旋方向的改变，此时两个电子的自旋方向仍然相反，净自变，此时两个电子的自旋方向仍然相反，净自旋旋s=0，这时分子处于，这时分子处于激发单重态激发单重态(S*)。某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自旋某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向方向的改变，这时分子的两个电子的自旋

7、方向相同，自旋量子数都是相同，自旋量子数都是1/2，总自旋量子数，总自旋量子数s=1， 这时分子的多重性这时分子的多重性M=2S+1=3，称为激发三重态称为激发三重态(T*)。13根据根据洪特规则洪特规则(Hund principle)，处于分立轨，处于分立轨上的非成对电子，平行自旋要比自旋成对更稳上的非成对电子，平行自旋要比自旋成对更稳定，因此，定，因此，三重态总是比相应的激发单重态具三重态总是比相应的激发单重态具有更低的能量。有更低的能量。3. 分子吸收辐射的特点分子吸收辐射的特点 分子吸收辐射是一种激发过程，根据波尔兹分子吸收辐射是一种激发过程，根据波尔兹曼曼(Boltzmann)分布，

8、当分子吸收了紫外分布，当分子吸收了紫外-可见可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的各个不同振动态的各个不同振动-转动能级，转动能级，不能直接跃迁到不能直接跃迁到激发三重态的各个能级上激发三重态的各个能级上。14单重态和三重态的电子分布模式图单重态和三重态的电子分布模式图A 单重基态单重基态 B 激发单重态激发单重态 C 激发三重态激发三重态EABC不是不是直接直接的跃的跃迁！迁！15激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态磁性磁性抗磁抗磁顺磁顺磁平均寿命平均寿命10-8s 10-4s-1s跃迁情况跃迁情况允许跃迁允许跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁 能能

9、量量高一些高一些低一些低一些 激发单重态与激发三重态的比较激发单重态与激发三重态的比较164. 分子对所吸收到的辐射的处理分子对所吸收到的辐射的处理根据根据能量最低原理能量最低原理：由于激发单重态的分子能：由于激发单重态的分子能量较高，因而激发态的分子是不稳定的，所以量较高，因而激发态的分子是不稳定的，所以会通过辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放出多会通过辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放出多余的能量而返回到基态余的能量而返回到基态去激发过程去激发过程，在去激在去激发过程中以速度最快、激发态的寿命最短的途发过程中以速度最快、激发态的寿命最短的途径占优势。径占优势。去去极极化化过过程程无辐射无辐射 跃跃

10、 迁迁辐射跃迁辐射跃迁振动弛豫振动弛豫(vibrational relaxation)内部转换内部转换(internal conversion)外部转换外部转换(external conversion)系间穿越系间穿越(intersystem crossing)荧光荧光(fluorescence)磷光磷光(phosphorescence) 17分子中能级变换模式图分子中能级变换模式图(Jablonski)S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫185. 相关名词术语相关名词术语vibra

11、tional relaxation 振动弛豫：振动弛豫：处于激发态的处于激发态的各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分能量释放出来，其电子则返回到同一电子部分能量释放出来，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程激发态的最低振动能级的过程只能发生在同只能发生在同一电子能级内的不同振动能级之间一电子能级内的不同振动能级之间internal conversion 内部能量转换：内部能量转换：当两个电子当两个电子激发态之间的能量相差较小以致振动能级发生激发态之间的能量相差较小以致振动能级发生重叠时，受激发分子常由高电子能级以无辐射重叠时，受激发分

12、子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程方式转移至低电子能级的过程容易发生容易发生 19external conversion 外部能量转换：外部能量转换：激发态的激发态的分子与溶剂分子或其它溶质分子发生碰撞而将分子与溶剂分子或其它溶质分子发生碰撞而将部分能量以热能的形式释放出来部分能量以热能的形式释放出来降低荧光强降低荧光强度度intersystem crossing 体系间跨越：体系间跨越：处于激发态处于激发态的分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性的分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生改变的过程。如发生改变的过程。如S1*的最低振动能级同的最低振动能级同T1*的最高振动能

13、级重叠时，的最高振动能级重叠时，则有可能发生则有可能发生S1* T1*使荧光强度降低甚至熄灭使荧光强度降低甚至熄灭容易发生在容易发生在含有重原子分子含有重原子分子或或溶液中存在溶液中存在O2等等顺磁性顺磁性物质中物质中。20fluorescence emission：激发单重态激发单重态 内部转换或振动弛豫内部转换或振动弛豫 S1*的最低振动能级的最低振动能级发射发射h S0的任一振动能级的任一振动能级荧光荧光特点：特点：1. 不是单一的过程，借助了振不是单一的过程，借助了振 动弛豫和内部转换的过程动弛豫和内部转换的过程 2. 持续过程为持续过程为10-910-7s 3. 发射出来的波长大于吸

14、收的发射出来的波长大于吸收的 激发波长激发波长 4. 呈现带状的光谱呈现带状的光谱21phosphorescence emission：体系间跨越体系间跨越 S*T1*的最低的最低振动能级振动能级振动弛豫振动弛豫 发射发射h S0的任一振动能级的任一振动能级磷光磷光特点：特点：1. 不是单一的过程，借助了振不是单一的过程，借助了振 动弛豫和体系间的跨越动弛豫和体系间的跨越 2. 波长大于荧光的波长波长大于荧光的波长 3. 持续过程为持续过程为10-410s 4. 低温条件下才可见低温条件下才可见区别荧光和磷光？区别荧光和磷光？22二、二、 荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱荧光物

15、质分子具有两个特征光谱：荧光物质分子具有两个特征光谱：1.激发光谱激发光谱(excitation spectrum) 表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。波长荧光的相对效率。 固定发射波长，用不同波长的激发光来激固定发射波长，用不同波长的激发光来激发荧光物质，记录荧光强度。发荧光物质，记录荧光强度。2. 发射光谱发射光谱(emission spectrum) 荧光光谱荧光光谱(fluorescence spectrum) 表示所发射的荧光中各种波长的相对强度。表示所发射的荧光中各种波长的相对强度。 固定激发波长，扫描该波长激发所引起荧

16、光固定激发波长，扫描该波长激发所引起荧光物质分子发射不同波长的相对强度。物质分子发射不同波长的相对强度。23荧光光谱的性质荧光光谱的性质1.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift) 荧光发射波长总是大于激发波长。荧光发射波长总是大于激发波长。原因：原因：无辐射跃迁，使能量发生了损失。无辐射跃迁，使能量发生了损失。300400500nmFab硫酸奎宁的激发光谱硫酸奎宁的激发光谱( (a) )和发射光谱和发射光谱( (b) )242. 荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关原因：原因：荧光光谱只有一个发射带荧光光谱只有一个发射带从从S1*的最低的最低 振动能级向基态回

17、落过程中发射辐射振动能级向基态回落过程中发射辐射。3. 荧光光谱与激发光谱呈镜像关系荧光光谱与激发光谱呈镜像关系F280 360 440 520 600nm激发激发光谱光谱荧光荧光光谱光谱b b4 4b b3 3b b2 2b b1 1b b0 0c c1 1c c2 2c c3 3c c4 4c c0 025s0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4s1*V=4V=3V=2V=1V=0V=4V=3V=2V=1V=0E4E1E3E2E3E4E2E1蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁26二二 荧光与分子结构荧光与分子结构1.荧光寿命与荧光效率荧光寿命与荧光效率 荧光寿命荧光寿命(fluorescence

18、 life time)当除去激当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的度的1/e时所需的时间。时所需的时间。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合组分的分析。混合组分的分析。-KtteFF0-K0/eefFF0f设设t= 时，时，Ft为为F0的的1/e , 则则0tlnfFtF1Kf该公式可以表征荧光寿命。该公式可以表征荧光寿命。27 荧光效率荧光效率(fluorescence efficiency)指激发指激发态分子发射荧光的光量子数与基态分子吸收态分子发射荧光的光量子数与基态分子吸收激发光的光

19、量子数之比。激发光的光量子数之比。f =发射荧光的光子数发射荧光的光子数吸收激发光的光子数吸收激发光的光子数如果荧光物质从激发态回到基态过程中没有其如果荧光物质从激发态回到基态过程中没有其他去极化过程与发射荧光相竞争，那么荧光分他去极化过程与发射荧光相竞争，那么荧光分子就可以将所吸收的辐射全部以荧光的形式发子就可以将所吸收的辐射全部以荧光的形式发射出来。射出来。此时其荧光效率为此时其荧光效率为1。282. 有机化合物分子结构与荧光的关系有机化合物分子结构与荧光的关系 A. 强的紫外强的紫外-可见光吸收可见光吸收 分子中含有长的共轭分子中含有长的共轭键键(不饱和度高不饱和度高)，则，则容易发生跃

20、迁，且共轭性越强，荧光强容易发生跃迁，且共轭性越强，荧光强 度越大。度越大。B. 较高的荧光效率较高的荧光效率 具有刚性平面，共共平面性越强，则容具有刚性平面，共共平面性越强，则容易可保持较高的荧光效率。易可保持较高的荧光效率。另外，一个有机物能否发荧光以及荧光的另外，一个有机物能否发荧光以及荧光的强弱还受取代基团的影响。强弱还受取代基团的影响。29 苯苯ex=205nmem=278nmf 0.11 萘萘ex=286nmem=321nmf 0.29f 0.36 蒽蒽ex=356nmem=404nm30f 0.29联苯联苯f1.0芴芴芴分子中的两个苯环不能自由旋转，为刚性分子芴分子中的两个苯环不

21、能自由旋转，为刚性分子31NOHAl3+8-8-羟基喹啉羟基喹啉8-8-羟基喹啉铝羟基喹啉铝荧光增强荧光增强NONONOAl32CCHHCCHH反反-1,2-1,2-二苯乙烯二苯乙烯顺顺-1,2-1,2-二苯乙烯二苯乙烯荧光荧光荧光荧光33取取代代基基增强增强电子共轭程度电子共轭程度使荧光波长长移使荧光波长长移NH2-, OH-, OCH3-等等减弱减弱电子共轭程度电子共轭程度使荧光减弱或熄灭使荧光减弱或熄灭COOH-, NO2-, -C=O, SH-及卤素原子等及卤素原子等不影响不影响键键对荧光基本没有影响对荧光基本没有影响如如R-, SO3H-等等第一类为给电子基团第一类为给电子基团第二类

22、为吸电子基团第二类为吸电子基团343. 荧光试剂荧光试剂 在荧光分光光度法中，常使用某些荧光试剂，在荧光分光光度法中，常使用某些荧光试剂，使之与被分析物质发生反应，生成荧光效应使之与被分析物质发生反应，生成荧光效应强的物质强的物质提高分析的灵敏度和选择性提高分析的灵敏度和选择性OOO荧光胺荧光胺能与伯氨基反应，能与伯氨基反应，生成的衍生物生成的衍生物Ex=390nm, Em=480nm35CHOCHON(CH3)2SO2Cl邻苯二甲醛邻苯二甲醛常作为氨基酸含量测常作为氨基酸含量测定的荧光反应试剂定的荧光反应试剂丹磺酰氯丹磺酰氯N(CH3)2SO2NH2NH2丹磺酰肼丹磺酰肼能与伯、仲胺基及酚能

23、与伯、仲胺基及酚羟基的生物碱反应，羟基的生物碱反应，产生比较强的荧光产生比较强的荧光36三三 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素1. 温度温度 T，荧光效率和荧光强度，荧光效率和荧光强度 。原因：原因：分子间的碰撞加强，消耗了部分能量。分子间的碰撞加强，消耗了部分能量。2. 溶剂溶剂 极性极性，荧光波长，荧光波长，且荧光强度，且荧光强度。 黏度黏度，荧光强度荧光强度原因原因: : 极性溶液中，荧光分子极性溶液中，荧光分子* *的的E 分子间的热碰撞几率降低分子间的热碰撞几率降低那么磷光呢？那么磷光呢？373. 酸度酸度 溶剂的溶剂的pH值会使分子的结构发生改变，如双值会使分子的结构发

24、生改变，如双键位移，从而使光谱性质发生变化。键位移，从而使光谱性质发生变化。想想酸碱滴定中指示剂为什么会随着想想酸碱滴定中指示剂为什么会随着pH值的改变值的改变而颜色发生变化呢？而颜色发生变化呢？4. 荧光熄灭剂荧光熄灭剂(1)(1)发生分子碰撞损失了荧光物质的能量；发生分子碰撞损失了荧光物质的能量；(2)(2)O2分子的顺磁性，促进了体系间的跨越，分子的顺磁性，促进了体系间的跨越， 诱发诱发S1*T1* (3) 荧光物质溶液浓度过大时荧光物质溶液浓度过大时(1g/L)，产生，产生 自熄灭自熄灭385. 散射光散射光(1)(1)瑞利散射光瑞利散射光( (Reileigh scattering

25、light) ) 光子与物质分子发生弹性碰撞，没有能量光子与物质分子发生弹性碰撞，没有能量的交换。的交换。(2)(2)拉曼光拉曼光( (Raman scattering light) ) 光子与物质分子发生非弹性碰撞，光子与光子与物质分子发生非弹性碰撞，光子与物质分子间有能量的交换物质分子间有能量的交换干扰荧光测定干扰荧光测定 尤其是波长比入射光更长的拉曼光，因其尤其是波长比入射光更长的拉曼光，因其与荧光接近，因此必须采取措施消除。与荧光接近，因此必须采取措施消除。选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰39强强度度320448Ex=320nm硫酸喹宁硫酸喹宁3

26、50448强强度度320360Ex=320nm0.1mol/LH2SO4350400Ex=350nm硫酸喹宁硫酸喹宁Ex=350nm0.1mol/LH2SO4无干扰无干扰 有干扰有干扰 Raman光谱有何特点？光谱有何特点？40第二节第二节 荧光定量的分析方法荧光定量的分析方法溶液中物质的荧光强度与该物质溶液中物质的荧光强度与该物质吸收光量子的吸收光量子的程度程度以及以及荧光效率荧光效率有关有关成正相关关系成正相关关系I0FI一般在垂直方向观一般在垂直方向观察或测量荧光强度察或测量荧光强度溶液中荧光的测定溶液中荧光的测定1. 荧光强度与物质浓度的关系荧光强度与物质浓度的关系荧光分光光度计的设计

27、原理荧光分光光度计的设计原理41有关计算有关计算设溶液中荧光物质浓度为设溶液中荧光物质浓度为C，液层厚度为，液层厚度为L。荧光强度正比于被测荧光物质吸收的光强度，荧光强度正比于被测荧光物质吸收的光强度， 即：即：F(I0-I), F=K (I0-I) K 为常数，其值取决于荧光效率。为常数，其值取决于荧光效率。 根据根据Beer定律：定律：I=I0 10-ECl-ECl-2.3ECl00=kI (1-10)=kI (1-e)F230230(-2.3ECl)(-2.3ECl)(-2.3ECl)=I 1-(1+)1!2!3!(-2.3ECl)(-2.3ECl)I-)2!3!=2.3EClFKK 即

28、42若浓度若浓度C很小，很小，ECl也很小，当也很小，当ECl0.05时时230(-2.3ECl)(-2.3ECl)I-)2!3!=2.3EClFK 上式中括号中第二项以后的各项可以忽略。上式中括号中第二项以后的各项可以忽略。 得得 F=2.3KI0ECl=KC因此，因此，在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比质的浓度成正比荧光定量分析的依据。荧光定量分析的依据。注意：注意：当荧光物质溶液的浓度太高时，则荧光当荧光物质溶液的浓度太高时，则荧光 响应值与浓度之间就偏离了线性关系。响应值与浓度之间就偏离了线性关系。432. 定量方法定量方法(1) 校正曲

29、线法校正曲线法 以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，建立以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，建立线性方程。线性方程。 在绘制标准曲线时，常采用系列中某一对照在绘制标准曲线时，常采用系列中某一对照品浓度作为基准，将空白溶液的荧光强度读数品浓度作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调至调至0，将该对照品溶液的荧光强度调至，将该对照品溶液的荧光强度调至100%或或50%，然后测定对照品系列中其他溶液的荧，然后测定对照品系列中其他溶液的荧光强度光强度F。 A. 每次校正的样品应采用同一对照品溶液。每次校正的样品应采用同一对照品溶液。 B. 如果对照品对光不稳定，则可以用另外一如果对照品对光不稳定，则可以用另外

30、一个与被测物荧光光谱相近的物质作基准来校正个与被测物荧光光谱相近的物质作基准来校正仪器。仪器。44(2) 比例法比例法 如果标准曲线能够通过原点，则可以直接进如果标准曲线能够通过原点，则可以直接进行对比测定。行对比测定。FCxxFCssFFCxxFFCss00如果空白溶液的如果空白溶液的F不能调至不能调至0，则按，则按(3) 联立方程式法联立方程式法 用于多组分混合物的荧光分析。用于多组分混合物的荧光分析。45NCH2CH3OCOOHFFHNNCH3HCl盐酸洛美沙星盐酸洛美沙星200 285 323 400 350 445 600 FF激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱46测定法：测定法： 用

31、用0.1mmol/L的盐酸配制浓度为的盐酸配制浓度为1.5ug/mL的的溶液，进行光谱扫描，得知其最大吸收波长为溶液，进行光谱扫描，得知其最大吸收波长为285nm，发射波长为，发射波长为485nm。同时用。同时用HCl溶液作溶液作空白对照。空白对照。 测得该浓度的洛美沙星的荧光值为测得该浓度的洛美沙星的荧光值为Fs , 另另按该法配制供试品溶液，同法测定荧光响应值按该法配制供试品溶液，同法测定荧光响应值Fx ，按照比例法公式，计算，即得供试品溶液，按照比例法公式，计算，即得供试品溶液的药物浓度。的药物浓度。xxssFCCF其中其中Cs=1.5ug/mL47第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光光

32、度计1. 荧光分光光度计荧光分光光度计 由光源、激发单色器、发射单色器、样品由光源、激发单色器、发射单色器、样品池和检测系统组成。池和检测系统组成。激发单色器激发单色器样品池样品池吸吸收收物物发射单色器发射单色器检测器检测器放大器放大器指示器指示器记录器记录器Xe灯灯482. 仪器的校正仪器的校正 A. 灵敏度：灵敏度：直接影响方法的检出限直接影响方法的检出限。一般用。一般用1ug/mL的硫酸奎宁进行检查。的硫酸奎宁进行检查。 B. 波长波长 C. 光谱：光谱：影响测定的灵敏度和准确度影响测定的灵敏度和准确度。原因：原因：光源强度不稳定；光源强度不稳定； 检测器对波长的感应不呈线性。检测器对波

33、长的感应不呈线性。采用双光束光路，即用一个参比光来抵消测量采用双光束光路，即用一个参比光来抵消测量误差。误差。49第四节第四节 荧光分析新技术荧光分析新技术1.激光荧光分析激光荧光分析(laser fluorometry) 优点：优点：单色性好、强度大、稳定性高单色性好、强度大、稳定性高2. 时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析(time-resolved fluorometry) 原理：原理：利用不同物质的荧光寿命的不同，在激利用不同物质的荧光寿命的不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，以实现分别检发和检测之间延缓的时间不同，以实现分别检测的目的。测的目的。抗干扰性强，可用于复杂的多组分抗干扰性

34、强，可用于复杂的多组分的分析。的分析。504. 同步荧光分析同步荧光分析(synchronous fluorometry) 原理：原理：在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值择一适宜的波长差值 （通常为（通常为ex与与em之之差差)，同时扫描发射波长和激发波长，得到同步，同时扫描发射波长和激发波长，得到同步荧光光谱。荧光光谱。 Fsp(ex ,em)=KCFexFem 灵敏度很高灵敏度很高。3. 荧光免疫分析荧光免疫分析(fluoroimmunoassay) 原理：原理：利用荧光标记的抗原与抗体之间的反应利用荧光标记的抗原与抗体之间的反应进行分析

35、。用于生物化学、免疫学、遗传学和进行分析。用于生物化学、免疫学、遗传学和分子生物学中蛋白及多肽的分析。分子生物学中蛋白及多肽的分析。515. 胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析(micellar sensitized fluorometry ) 原理：原理：利用表面活性剂利用表面活性剂(SDS)，形成胶体溶液，形成胶体溶液，来减弱被分析物由于分子热运动所造成的能量损来减弱被分析物由于分子热运动所造成的能量损失甚至荧光熄灭现象。失甚至荧光熄灭现象。特特点点适用范围广适用范围广灵敏度高灵敏度高稳定稳定52学习要求学习要求1、熟悉分子内部能级跃迁的模式及相关的概念熟悉分子内部能级跃迁的模式及相关的概念

36、2、理解荧光发射和磷光发射的过程理解荧光发射和磷光发射的过程3、理解激发光谱与荧光光谱的含义，掌握荧光理解激发光谱与荧光光谱的含义，掌握荧光 光谱的特点光谱的特点4、熟悉荧光寿命与荧光效率的含义熟悉荧光寿命与荧光效率的含义5、掌握影响有机物质荧光强度的因素掌握影响有机物质荧光强度的因素6、掌握荧光定量分析的方法依据掌握荧光定量分析的方法依据53练习题练习题一、一、选择题选择题1. 根据下列结构，那种物质的荧光效率最大根据下列结构，那种物质的荧光效率最大 A 苯苯 B 联苯联苯 C 蒽蒽 D 萘萘2. 下列物质中，哪个的荧光强度最大下列物质中，哪个的荧光强度最大 A. 苯酚苯酚 B. 硝基苯硝基

37、苯 C. 苯甲酸苯甲酸 D. 苯甲醛苯甲醛543. 影响荧光强度因素有影响荧光强度因素有 A 分子结构的稳定性分子结构的稳定性 B. 分子的取代基团分子的取代基团 C 溶液的温度溶液的温度 D. 溶剂的性质溶剂的性质 E. 分子量的大小分子量的大小4. 光和物质分子发生碰撞，不发生能量的交换，仅光和物质分子发生碰撞，不发生能量的交换，仅 是光子运动的方向发生改变，这种光是是光子运动的方向发生改变，这种光是 A. 荧光荧光 B. 磷光磷光 C. 拉曼光拉曼光 D. 瑞利光瑞利光5.分子荧光法与紫外分子荧光法与紫外-可见光光度法的主要区别是可见光光度法的主要区别是 A. 分析方法完全不同分析方法完

38、全不同 B. 仪器结构不同仪器结构不同 C. 灵敏度不同灵敏度不同 D. 光源不同光源不同 E. 光谱性质不同光谱性质不同6.下列关于荧光光谱的说法中不正确的是下列关于荧光光谱的说法中不正确的是 A. 可分为分子荧光光谱和原子荧光光谱可分为分子荧光光谱和原子荧光光谱 B. 影响因素多影响因素多 C. 当激发光停止后，持续的时间比磷光长当激发光停止后，持续的时间比磷光长 D.可进行定性分析和定量分析可进行定性分析和定量分析557. 下列说法正确的是下列说法正确的是 A 荧光物质的浓度加大，荧光强度增大荧光物质的浓度加大，荧光强度增大 B 在稀溶液中，荧光物质浓度加大，荧光强度增大在稀溶液中，荧光

39、物质浓度加大，荧光强度增大 C 溶液温度升高，荧光效率增加溶液温度升高，荧光效率增加 D 溶液温度升高，则溶液黏度降低，荧光增强溶液温度升高，则溶液黏度降低，荧光增强8. 下列去极化过程属于无辐射跃迁的是下列去极化过程属于无辐射跃迁的是 A. 外部能量转换外部能量转换 B. 体系间跨越体系间跨越 C. 磷光磷光 D. 振动弛豫振动弛豫 E. 荧光荧光9. 下列关于紫外光谱与荧光光谱的比较不正确的是下列关于紫外光谱与荧光光谱的比较不正确的是 A. 都属于分子光谱都属于分子光谱 B. 都有较高的灵敏度都有较高的灵敏度 C. 都是吸收光量子后发生能级的跃迁都是吸收光量子后发生能级的跃迁 D. 光谱均

40、位于紫外光区域光谱均位于紫外光区域 56三三、判断题、判断题1. 分子的外层电子在辐射能的作用下，吸收能量跃分子的外层电子在辐射能的作用下，吸收能量跃 迁至激发态，再以无辐射弛豫转入最低的激发三迁至激发态，再以无辐射弛豫转入最低的激发三 重态，然后再跃迁回基态的各个振动能级上并产重态，然后再跃迁回基态的各个振动能级上并产 生辐射，这种发光现象称为分子荧光（）生辐射，这种发光现象称为分子荧光（）2. 荧光物质吸收了某种波长的紫外线，才能发射荧荧光物质吸收了某种波长的紫外线，才能发射荧 光，吸收愈强，发射荧光也愈强，因此二者图谱光，吸收愈强，发射荧光也愈强，因此二者图谱 完全重叠（）完全重叠（）3

41、. 由于荧光物质浓度过高而引起的荧光减弱或消失由于荧光物质浓度过高而引起的荧光减弱或消失 的现象称为自熄灭现象（）的现象称为自熄灭现象（）4. 电子的共轭程度越大，则荧光强度越大，荧光电子的共轭程度越大，则荧光强度越大，荧光 波长向短波方向移动（）波长向短波方向移动（）5. 将分子中能发射荧光的基团称为荧光团。荧光团将分子中能发射荧光的基团称为荧光团。荧光团 一定是发色团，但发色团不一定是荧光团（）一定是发色团，但发色团不一定是荧光团（）实例：荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量取供试样品20片（31.538.5g/片），研细，用无水乙醇溶解，转移至250ml容量瓶，水浴加热30min，取出，放冷至室温，用无水乙醇稀释至刻度，过滤，弃去初滤液，取续滤液5.00ml，稀释至10ml，作为供试品，另取对照品适量，在285nm,307nm测定样品与标准的荧光强度。将炔雌醇标准品乙醇溶液的浓度配成1.4g/ml，在同样测定条件下，测得荧光强度，计算可得含量，从而可以鉴定产品是否合格问题：为何将炔雌醇标准品乙醇溶液的浓度配成1.4g/ml这样低的浓度才测定其荧光强度？测定时是否应控制温度保持一致？为什么？