2019年三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法

《2019年三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2019年三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法（4页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、三色法流式细胞术检测CD4、CD25调节性T细胞Foxp3的方法王琦 1 张行 1 邵雁 2 陈大方 1 陈萍 1 曹江 1目的 为探讨甲状腺患者外周血中Foxp3+ / CD4 T细胞的表达及在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后的临床意义。方法建立流式细胞术检测 CD4、CD25调节性T细胞Foxp3的方 法。 结果 外周血中Foxp3+/CD4 T细胞平均比例，体检健康组为3.7629 ± 1.9996%，甲状腺恶性肿瘤术前组为 9.1492±6.4704%，术后组为 7.4435±6.3587%。结论 甲状腺恶性肿瘤 患者Foxp3+/ CD4 T细胞平均比例

2、明显高于体检健康者（PV 0.05 ）。而甲状腺恶性肿瘤患者术后Foxp3+/CD4 T细胞平均比例则低于术前。关键词 : 流式细胞术、甲状腺癌、 Foxp3CD4、CD25调节性T细胞是天然产生的调节性 T细胞的重要亚群之一，在稳定的自身免疫环境中发挥重要的作用 1。 Foxp3 特异性地表达在 CD4+、 CD25+Treg 细胞上，并在该细胞 的发育和功能维持中起很重要的作用，进而提示Foxp3可能是CD4、CD25Treg细胞的一个特征性标志。近几年的研究发现调节性 T细胞有可能以某种机制抑制着机体对肿瘤的免疫 应答，从而导致肿瘤的发生 ，目前调节性T细胞与肿瘤免疫机制及治疗的研究逐渐

3、成为 热点。甲状腺癌是最为常见的内分泌恶性肿瘤之一，占头颈部肿瘤的首位，本研究为探讨Foxp3+ / CD4 T细胞在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后外周血中的表达，我们建立三色 法流式细胞术检测 CD4、CD25调节性T细胞Foxp3的方法，并讨论其临床意义。1 材料与方法1.1临床资料与分组：收集甲状腺癌患者（2007年11月2008年2月期间本院住院患者）外周血共 41 例，术前 24例， 其中的 17例患者术后 7天取外周血， 行流式细胞术检测 CD4+、 CD25调节性T细胞Foxp3检测，所有患者手术标本均经组织病理学诊断。健康对照组21例,为本院体检中心体检健康者。1.2主要试剂

4、和仪器：淋巴细胞分离（国药集团化学试机有限公司），CD4-FITC、CD25-PE购自 Caltag 公司， Foxp3-PE-Cy5、 IgG2a- PE-Cy5、 Foxp3 破膜试剂盒等均购自 eBioscience 公司，正常大鼠血清购自杭州联科有限公司。低温高速离心机（HERAEUS D-37520德国）,流式细胞仪 EPICS XL 型 （Beckman Coulter 美国）。1.2 方法：1.2.1 外周血单个核细胞( PBMC )分离取患者外周静脉血 4ml以EDTA抗凝，充分混匀。取10ml离心管，将4ml全血缓慢加 在 4ml 淋巴细胞分离液上部，2000 转 /分钟室温

5、离心 20 分钟。轻轻吸取中间白色的淋巴细胞层至另一管，2000转/分钟室温离心 5分钟，去上清。加 2ml PBS混匀，2000转/分室温 离心 5 分钟，去上清。计数细胞后调整细胞浓度至1X106ml-1。1.2.2 流式样本制备取2001上述单细胞悬液，在对照管和实验管中分别加入100卩,且在两管中均加入CD4-Pcy5、CD25-FITC 各 5 门 4C避光孵育 30 分钟。力口 1ml Flow cytometry Staining buffer , 混匀。2000转/分钟室温离心5分钟，去上清。对照管和实验管中各加入2ml破膜剂。4C避光孵育 45-60 分钟。 2000转/分钟

6、，离心 5分钟，去上清。对照管和实验管中各加入 2ml Permeabilization Buffer ， 2000 转/分钟，室温离心 5 分钟，去上清。重复 Permeabilization Buffer 洗细胞步骤一次。对照管和实验管各加入100卩Permeabilization Buffer，充分混匀，再加正常大鼠血清2 M, 4 C避光孵育15分钟。无需Permeabilization Buffer清洗细胞，直接在对照 管中加入IgG1-PE 2.5，实验管中加入 Foxp3-PE 20 d。4C避光孵育至少 30分钟。对照管 和实验管中各加入 2ml Permeabilizatio

7、n Buffer， 2000转/分钟，室温离心 5分钟。去上清， 重复 Permeabilization Buffer 清洗步骤一次。加 400ul Permeabilization Buffer 上机检测。1.3统计学分析：采用 SPSS11.5软件进行统计学分析，组间差异以LSD法进行两两比较，PV0.05为有显著性差异。2. 结果2.1甲状腺恶性肿瘤手术前、后外周血中CD4/ CD25 T细胞的平均比例：流式细胞术检测体检健康者外周血中CD4/CD25T细胞的平均比例为 22.4048 ± 7.5827%，甲状腺恶性肿瘤术前外周血中 CD4/CD25 T细胞的平均比例为19.7

8、725 ± 7.9942%，术后组为21.5765 ±9.1018%。无显著性差异(P>0.05 )。2.2甲状腺恶性肿瘤组术前Foxp3+/CD4T细胞的平均比例(9.1492 ± 6.4704%),明显高于体检健康者(3.7629 ± 1.9996%),二者相比有显著性差异(Pv 0.05 )。2.3 甲状腺恶性肿瘤组进行肿瘤切除术后，外周血中的Foxp3+/ CD4T 细胞的平均比例7.4435 ±6.3587%),而体检健康者为( 3.7629± 1.9996%),二者相比有显著性差异(Pv0.05 ）。2.4甲状腺恶性

9、肿瘤术后组外周血中的Foxp3+/CD4T细胞的平均比例(7.4435 ± 6.3587%)低于术前组(9.1492 ± 6.4704%),无显著性差异(P> 0.05 )3. 讨论 :肿瘤的发生是肿瘤细胞逃避免疫监测的结果,在肿瘤宿主体内许多可以被自体T 细胞识别的肿瘤相关抗原目前已经被证明是自身的正常组分。通过外周耐受抑制自身反应性T细胞活性的机制, 也同样影响着对肿瘤相关的自身抗原的应答, 从而参与肿瘤在宿主体内发 生和发展，而具有免疫调节潜力的 CD4 CD25调节性T细胞就是限制自身免疫反应的重要因 素之一 3、4。甲状腺肿瘤是较常见的内分泌腺肿瘤,临床最初

10、多表现为无痛性甲状腺结节, 在总人群中的发病率为4%7%其中大多数为良性，但约有5%为恶性5。甲状腺癌发生、发展及预后是多种基因相互或独立作用的结果, 了解各种类型甲状腺癌及其不同病程阶段的 基因和编码蛋白表达变化,对于分析病变相关分子生物学具有重要的意义6。本研究收集甲状腺恶性肿瘤患组 24例,甲状腺切除术后组 17例,体检健康组 21例, 用三色法流式细胞术检测外周血中CD4 / CD25 T细胞、Foxp3+ / CD4T细胞的平均比例。结果表明,甲状腺恶性肿瘤术前组、术后组和体检健康组三组间CD4+/ CD25+ T 细胞的平均比例经统计学处理无显著性差异。而甲状腺恶性肿瘤组无论术前、

11、术后Foxp3+/ CD4T细胞的平均比例均高于体检健康者(PV 0.05 )。目前国内外有报道肿瘤患者外周血和肿瘤组织中CD4/CD25调节性T细胞升高，并且在肿瘤组织切除后外周血中CD4/ CD25调节性T细胞的水平有所下降。本实验中甲状腺恶性肿瘤术后组外周血中的Foxp3+ / CD4T细胞的平均比例(7.4435±6.3587%)低于术前组( 9.1492±6.4704%),呈下降趋势,与国内外相关报道 一致。为临床提供了观察患者手术疗效的一个有效指标。流式细胞仪在分析细胞群体时具有速度快、 多参数、 细胞数量大等优点, 此方法检测外 周血在临床上应用非常广泛，本实

12、验建立三色法检测外周血中CD4、CD25调节性T细胞Foxp3的方法，可及时了解患者外周血中调节性T细胞表达水平的变化，为临床观察手术、药物及基因治疗等疗效提供一定的依据,也可作为对患者预后的判断和随访治疗的参考。参考文献：1. 吕凌。介导CD4 +、CD25+调节性T细胞发育与功能的一个关键基因-Foxp3J 。国际免疫学杂志, 2006, 29(2)：65-68。2. Fontenot JD, Gavin EW , Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+、 CD25 + regulatory T ce

13、llsJ . Nat Immunol, 2003, 4（4）:330-336.+ +3. 崔永生，李欣，于春雷等肺癌和乳腺癌患者外周血中CD4 CD25 T细胞及Foxp3 mRNA的变化特点及临床意义 J. 吉林大学学报（医学版） ， 2006， 32（5）：843-846 。4. Sakaguchi S. Regulatory T cells : key controllers of immunologic self-toleranceJ.Cell, 2000, 101: 455-458.5. 许晨，赵文川 . 甲状腺分子标记物研究进展 J. 现代肿瘤医学， 2006， 14（3）：357-360。6. 钟宇华 . 甲状腺癌相关基因研究进展 J. 广西医科大学学报， 2007， 24（3）： 482-484。作者单位 1 浙江大学邵逸夫临床医学研究所 2 浙江大学医学院附属邵逸夫医院头颈整形 联合外科联系地址：杭州市庆春东路 3 号 浙江大学医学院附属邵逸夫医院邮编 310016 联系电话 13588100233 E-mail wq_hangzhou