益生菌与益生素

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1、南昌大学中德联合研究院南昌大学中德联合研究院曹郁生曹郁生1. 简介简介2. 肠道菌群和营养代谢肠道菌群和营养代谢3. 益生菌的功能益生菌的功能4. 益生菌的选择益生菌的选择5. 小结小结 1.1 发展概况发展概况 1.1.1 古老的文明古老的文明 1.1.2 年轻的领域年轻的领域 1.2 几个概念几个概念 1.2.1 益生菌（益生菌（probiotics） 1.2.2 益生素（益生素（prebiotics） 1.2.3 合生元（合生元（synbiotics） 1.1 发展概况发展概况 1.1.1 古老的文明。古老的文明。 微生物在食品中的应用可以追溯到微生物在食品中的应用可以追溯到数千年以前，

2、其中人们最熟悉的应当数千年以前，其中人们最熟悉的应当是酒、酸奶和其他发酵饮料，这是人是酒、酸奶和其他发酵饮料，这是人类文明的一个组成部分，也是益生菌类文明的一个组成部分，也是益生菌制剂悠久历史的见证。制剂悠久历史的见证。 1.1.2 年轻的领域年轻的领域 益生菌在理论上的概念是在二十世纪益生菌在理论上的概念是在二十世纪初期才提出来的，而将其作为一个专门初期才提出来的，而将其作为一个专门的科学领域进行研究开发，则是二十世的科学领域进行研究开发，则是二十世纪纪80年代以来的事情。年代以来的事情。 1 1）梅契尼科夫）梅契尼科夫 的理论的理论 2）酸奶风靡欧亚）酸奶风靡欧亚 3）肠道菌群的秘密）肠道

3、菌群的秘密1.2 几个概念几个概念1.2.1 益生菌益生菌 (probiotics) Havenaar（1992年）：年）：“益生菌是益生菌是单个或多种微生物的活菌培养物，当用单个或多种微生物的活菌培养物，当用于动物或人时，可通过促进天然微生物于动物或人时，可通过促进天然微生物菌群的特性而对宿主产生有益的影响菌群的特性而对宿主产生有益的影响” 。 EC（1999）：用做食品成分、有益）：用做食品成分、有益健康的活的微生物。健康的活的微生物。 1.2.2 益生素（益生素（prebiotics） 益生素是一类宿主不能消化的食物成益生素是一类宿主不能消化的食物成分，能选择性地促进肠道某种或某些有益分

4、，能选择性地促进肠道某种或某些有益微生物生长，从而产生有益的影响。目前微生物生长，从而产生有益的影响。目前最常用的是功能性低聚糖，如大豆低聚糖最常用的是功能性低聚糖，如大豆低聚糖（Soybean oligosaccharide）、低聚果糖）、低聚果糖（Fructooligosaccharide）、乳酮糖）、乳酮糖（Lactulose）、异麦芽低聚糖）、异麦芽低聚糖（Isomaltooligosaccharide）等。）等。 1.2.3 合生元（合生元（synbiotics） 是将益生素与益生菌结合使用，共同是将益生素与益生菌结合使用，共同产生效应，维持和增加有益菌群的数量。产生效应，维持和增加

5、有益菌群的数量。目前国内外已有产品。目前国内外已有产品。2.1 结肠中碳水化合物的代谢结肠中碳水化合物的代谢 2.2 蛋白质酶解和氨基酸发酵蛋白质酶解和氨基酸发酵 2.3 脂类代谢脂类代谢 2.4 短链脂肪酸短链脂肪酸 2.5 结肠中毒性物质的去除结肠中毒性物质的去除 l 2.1.1 内源性碳水化合物的代谢内源性碳水化合物的代谢 2.1.2 外源性外源性碳水化合物的代谢碳水化合物的代谢 2.1.1 内源性碳水化合物的代谢内源性碳水化合物的代谢 主要包括粘蛋白（主要包括粘蛋白（mucin）和其他糖蛋）和其他糖蛋白。白。 1 1）粘蛋白的代谢）粘蛋白的代谢 粘蛋白为杯状细胞（粘蛋白为杯状细胞（go

6、blet cell）所分）所分泌，犹如消化道黏膜表面的保护屏障，泌，犹如消化道黏膜表面的保护屏障，对维持结肠的健康有着非常重要的作用。对维持结肠的健康有着非常重要的作用。粘蛋白的降解可能是多种微生物持续协粘蛋白的降解可能是多种微生物持续协同作用的结果，这些细菌的纯培养物只同作用的结果，这些细菌的纯培养物只能在有限的程度内降解粘蛋白。能在有限的程度内降解粘蛋白。 2 2）其他糖蛋白的代谢）其他糖蛋白的代谢 类似粘蛋白寡糖的其他糖类，包括细类似粘蛋白寡糖的其他糖类，包括细菌细胞壁的一些物质、肠上皮细胞的鞘菌细胞壁的一些物质、肠上皮细胞的鞘糖脂类（糖脂类（glycosphingolipids）。）。

7、 2.1.2 外源性碳水化合物的代谢外源性碳水化合物的代谢 2.1.2.1 非淀粉多糖（非淀粉多糖（nonstarch polysaccharides，NSP） 2.1.2.2 抗性淀粉（抗性淀粉（resistant starch） 2.1.2.3 低分子量碳水化合物低分子量碳水化合物 2.1.2.4 有双歧因子作用的碳水化合物有双歧因子作用的碳水化合物 2.1.2.1 非淀粉多糖非淀粉多糖 （nonstarch polysaccharides, NSP） NSP一般指进入结肠可被发酵的纤维一般指进入结肠可被发酵的纤维素。素。NSP包括植物细胞壁的主要组分包括植物细胞壁的主要组分（纤维素、半纤

8、维素、木聚糖、果胶（纤维素、半纤维素、木聚糖、果胶等），植物和种子多糖（菊糖、等），植物和种子多糖（菊糖、-葡聚葡聚糖等）。结肠内有多种细菌参与糖等）。结肠内有多种细菌参与NSP的的降解，主要是拟杆菌属，尤其是脆弱拟降解，主要是拟杆菌属，尤其是脆弱拟杆菌类群（杆菌类群（Bacteroides fragilis），以及），以及双歧杆菌、瘤胃球菌和真杆菌。双歧杆菌、瘤胃球菌和真杆菌。 2.1.2.2 抗性淀粉（抗性淀粉（resistant starch） 有些淀粉可以抵抗小肠胰淀粉酶的消化有些淀粉可以抵抗小肠胰淀粉酶的消化而进入结肠，这些抗消化的淀粉称之为而进入结肠，这些抗消化的淀粉称之为抗性淀粉

9、。抗性淀粉能被肠道微生物发抗性淀粉。抗性淀粉能被肠道微生物发酵，因而对菌群的组成和代谢活性影响酵，因而对菌群的组成和代谢活性影响较大。动物实验证明，抗性淀粉可提高较大。动物实验证明，抗性淀粉可提高肠道细菌酶的活性，降低氨的浓度，增肠道细菌酶的活性，降低氨的浓度，增加乳杆菌和双歧杆菌的数量（加乳杆菌和双歧杆菌的数量（10100倍）。在生理、治疗方面具有意义。倍）。在生理、治疗方面具有意义。 2.1.2.3 低分子量碳水化合物低分子量碳水化合物 食品摄入后，部分小分子量碳水化合物食品摄入后，部分小分子量碳水化合物受到其他高分子物质的保护，或者快速受到其他高分子物质的保护，或者快速通过肠道而免于消化

10、，其中有一些重要通过肠道而免于消化，其中有一些重要的双糖，如蔗糖、乳糖等，约有的双糖，如蔗糖、乳糖等，约有4%以上以上的蔗糖通过这种方式进入后肠。除上述的蔗糖通过这种方式进入后肠。除上述糖类，还有一些不能在小肠水解的低分糖类，还有一些不能在小肠水解的低分子量碳水化合物，主要是天然的寡聚糖，子量碳水化合物，主要是天然的寡聚糖，如水苏糖、棉子糖等。还有乳酮糖、帕如水苏糖、棉子糖等。还有乳酮糖、帕拉金糖、木糖醇、乳糖醇等。拉金糖、木糖醇、乳糖醇等。 2.1.2.4 2.1.2.4 有双歧因子作用的碳水化合有双歧因子作用的碳水化合物物 人体不能吸收但可被肠道细菌发酵的人体不能吸收但可被肠道细菌发酵的碳

11、水化合物摄入后，能刺激肠道内双歧碳水化合物摄入后，能刺激肠道内双歧杆菌和乳杆菌的生长。这些促进体内有杆菌和乳杆菌的生长。这些促进体内有益菌生长的物质，一般称作双歧因子益菌生长的物质，一般称作双歧因子（bifidus factor）。）。 如低聚果糖、菊糖、如低聚果糖、菊糖、棉子糖等。大多不能被机体或某些有害棉子糖等。大多不能被机体或某些有害细菌利用，而只能被乳杆菌和双歧杆菌细菌利用，而只能被乳杆菌和双歧杆菌利用，从而促进这些微生物的生长。利用，从而促进这些微生物的生长。 膳食及内源性蛋白和肽：膳食及内源性蛋白和肽：1）经宿主消化道和细菌的蛋白酶和肽酶水解生）经宿主消化道和细菌的蛋白酶和肽酶水解

12、生成氨基酸；成氨基酸； 2）氨基酸经细菌代谢，生成三类产物：）氨基酸经细菌代谢，生成三类产物：l H2、CO2、CH4、H2S 及硫醇由呼吸和胃肠气及硫醇由呼吸和胃肠气中排出；中排出；l氨、酚、吲哚、胺从尿中排出；氨、酚、吲哚、胺从尿中排出；l有机酸供给宿主生物合成和产能反应。有机酸供给宿主生物合成和产能反应。 2.3.1 胆汁酸和胆红素代谢胆汁酸和胆红素代谢 2.3.2 胆固醇代谢胆固醇代谢 2. 2.3.1 3.1 胆汁酸和胆红素代谢胆汁酸和胆红素代谢 1)1)胆汁酸代谢。胆汁酸代谢。 是体内胆固醇的主要代谢产物。胆酸是体内胆固醇的主要代谢产物。胆酸和鹅脱氧胆酸是胆汁酸中最重要的两种和鹅脱

13、氧胆酸是胆汁酸中最重要的两种成分。微生物在胆汁酸的降解中起了重成分。微生物在胆汁酸的降解中起了重要的作用要的作用, ,只有在微生物酶的作用下，结只有在微生物酶的作用下，结合型胆汁酸才能分解。因此无菌动物体合型胆汁酸才能分解。因此无菌动物体内只有结合型胆汁酸。内只有结合型胆汁酸。 2) 2)胆红素代谢。胆红素代谢。 肠道微生物起了重要的作用，胆红素肠道微生物起了重要的作用，胆红素代谢过程中，每一步都涉及到特异性的代谢过程中，每一步都涉及到特异性的酶和特异功能的蛋白质，如酶和特异功能的蛋白质，如-葡萄糖葡萄糖醛酸酶，只有少量由机体本身产生，绝醛酸酶，只有少量由机体本身产生，绝大多数是由肠道微生物产

14、生，它可使结大多数是由肠道微生物产生，它可使结合胆红素脱去葡糖醛酸，这是胆红素代合胆红素脱去葡糖醛酸，这是胆红素代谢的重要环节。大量使用抗生素后，粪谢的重要环节。大量使用抗生素后，粪便中粪胆素原含量明显降低，这可能是便中粪胆素原含量明显降低，这可能是抑制肠道细菌而引起的。抑制肠道细菌而引起的。 2.3.2 2.3.2 胆固醇的代谢胆固醇的代谢 胆固醇可在体内合成，也可从动物性食物中获胆固醇可在体内合成，也可从动物性食物中获得。食物中的胆固醇多以游离形式存在，吸收后得。食物中的胆固醇多以游离形式存在，吸收后80%-90%80%-90%的游离胆固醇与脂肪酸结合为胆固醇脂，的游离胆固醇与脂肪酸结合为

15、胆固醇脂，进入体循环。未被吸收的食物胆固醇在肠道被细菌进入体循环。未被吸收的食物胆固醇在肠道被细菌还原为粪固醇排出体外，转化胆固醇的微生物是一还原为粪固醇排出体外，转化胆固醇的微生物是一类严格厌氧、革兰氏阳性、无芽孢球杆菌。对无菌类严格厌氧、革兰氏阳性、无芽孢球杆菌。对无菌动物而言，没有肠道微生物降解胆固醇的途径，因动物而言，没有肠道微生物降解胆固醇的途径，因而同样饲喂条件下，无菌动物血清中胆固醇含量要而同样饲喂条件下，无菌动物血清中胆固醇含量要比常规鼠高许多。给动物口服产粪固醇真杆菌会产比常规鼠高许多。给动物口服产粪固醇真杆菌会产生明显的低胆固醇血症状，食物种类可能对肠道菌生明显的低胆固醇血

16、症状，食物种类可能对肠道菌产生粪固醇有一定影响。产生粪固醇有一定影响。 2.4.1 概述概述 短链脂肪酸（短链脂肪酸（short chain fatty acids, SCFA），），也常称作挥发性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、也常称作挥发性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸和己酸。异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸和己酸。其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高，是肠道中主其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高，是肠道中主要的要的SCFA。SCFA主要来自大肠内蛋白质和碳主要来自大肠内蛋白质和碳水化合物的代谢，是肠道细菌发酵的主要产物。水化合物的代谢，是肠道细菌发酵的主要产物。 有机酸有

17、机酸 浓度（浓度（mmol/kg内容物）内容物） 乙酸乙酸40100 丙酸丙酸1540 丁酸丁酸1030 甲酸甲酸01 乳酸乳酸05 异丁酸异丁酸03 戊酸戊酸05 异戊酸异戊酸04 己酸己酸02 2.4.2 SCFA的功能的功能 可调节肠道菌群，维持体液和电解质可调节肠道菌群，维持体液和电解质的平衡，给宿主提供能量，给肠道上皮的平衡，给宿主提供能量，给肠道上皮细胞提供营养等。尤其丁酸，对结肠上细胞提供营养等。尤其丁酸，对结肠上皮细胞有很大的意义，其功能有：皮细胞有很大的意义，其功能有： 能能量来源；量来源； 细胞膜脂类合成的基质；细胞膜脂类合成的基质； 促进消化道细胞生长；促进消化道细胞生长

18、； 诱导细胞分化；诱导细胞分化； 影响基因表达；影响基因表达； 与细胞骨架构建改与细胞骨架构建改变有关；变有关； 增加组蛋白乙酰化；增加组蛋白乙酰化； 诱导诱导细胞编程死亡等。细胞编程死亡等。 5.1 肠道菌对甲基汞的作用肠道菌对甲基汞的作用 甲基汞是一种高毒性物质，可引起中毒，如甲基汞是一种高毒性物质，可引起中毒，如20世纪世纪60年代日本发生的水俣病。甲基汞能迅速地年代日本发生的水俣病。甲基汞能迅速地被肠道完全吸收，粪便是最主要的排出途径。大被肠道完全吸收，粪便是最主要的排出途径。大部分排出的汞（部分排出的汞（50%-90%）是以盐的形式存在，）是以盐的形式存在，因而甲基汞的脱甲基作用可能

19、是体内有机汞排出因而甲基汞的脱甲基作用可能是体内有机汞排出的关键。无菌动物，或肠道菌群受到抗生素抑制的关键。无菌动物，或肠道菌群受到抗生素抑制的动物，汞的排出明显减少，体内汞的积累明显的动物，汞的排出明显减少，体内汞的积累明显增加。常规小鼠体内汞消除的半衰期为增加。常规小鼠体内汞消除的半衰期为10天，而天，而抗生素处理的小鼠增加到抗生素处理的小鼠增加到100天。这说明肠道菌天。这说明肠道菌群在汞的代谢和解毒中具有相当重要的作用。群在汞的代谢和解毒中具有相当重要的作用。 5.2 5.2 其他其他 研究发现肠道细菌可以结合在某些致癌研究发现肠道细菌可以结合在某些致癌物质上，这种结合导致这些突变剂的

20、活性物质上，这种结合导致这些突变剂的活性降低。因为当致癌物质和肠道细菌结合后，降低。因为当致癌物质和肠道细菌结合后，减少了结肠黏膜的吸收和结肠黏膜的损伤，减少了结肠黏膜的吸收和结肠黏膜的损伤，表现出抗致癌剂的作用，这也可以认为是表现出抗致癌剂的作用，这也可以认为是结肠细菌的非特异性保护作用。结肠细菌的非特异性保护作用。 3.1 对病原菌的排除拮抗作用；对病原菌的排除拮抗作用；3.2 免疫促进和免疫调节；免疫促进和免疫调节；3.3 抗肿瘤、抗突变活性；抗肿瘤、抗突变活性；3.4 防治胃肠道疾病（婴幼儿腹泻、乳糖防治胃肠道疾病（婴幼儿腹泻、乳糖 不耐受症、旅游者腹泻、肠易激综合不耐受症、旅游者腹泻

21、、肠易激综合 征、便秘、腹泻等）；征、便秘、腹泻等）； 3.5 降低血脂、降低血压，降低胆固醇；降低血脂、降低血压，降低胆固醇；3.6 其他（阴道炎、牙齿病变、肝病等）其他（阴道炎、牙齿病变、肝病等） 作用机制：作用机制：l 产生活性物质，如有机酸、细菌素、产生活性物质，如有机酸、细菌素、 H2O2、酶等；、酶等；l 竞争吸附位点；竞争吸附位点；l 竞争营养物质。竞争营养物质。作用机制作用机制l 刺激巨噬细胞；刺激巨噬细胞；l 调控细胞因子基因表达，诱导产生调控细胞因子基因表达，诱导产生 细胞因子；细胞因子；l 促进非特异性免疫；促进非特异性免疫；l 与黏膜免疫相关。与黏膜免疫相关。作用机制作

22、用机制l 具有抗肿瘤活性的细菌类生物调节剂；具有抗肿瘤活性的细菌类生物调节剂；l 通过改善菌群及其代谢，减少致癌物通过改善菌群及其代谢，减少致癌物 质的产生；质的产生；l 增强细胞免疫活性；增强细胞免疫活性；l 增加增加NO、IL-6、IL-1的量和活性；的量和活性；l 产生抗突变物质。产生抗突变物质。l 菌体结合有毒物质菌体结合有毒物质作用机制作用机制l 调整恢复菌群；调整恢复菌群；l 竞争营养及黏附受体，抑制病原菌的竞争营养及黏附受体，抑制病原菌的 定植；定植；l 产生抗体、抗毒素、细菌素等活性物质，产生抗体、抗毒素、细菌素等活性物质， 抑制腐败菌病原菌的生长；抑制腐败菌病原菌的生长；l

23、免疫激活免疫激活作用机制作用机制 l 改善菌群平衡，产生短链脂肪酸；改善菌群平衡，产生短链脂肪酸；l 菌细胞生长时可摄入结合胆固醇；菌细胞生长时可摄入结合胆固醇；l 一些乳酸菌可产生降解胆固醇的酶；一些乳酸菌可产生降解胆固醇的酶；l 可产生糖肽物质。可产生糖肽物质。作用机制作用机制l 产生抑菌物质，如产生抑菌物质，如H2O2、细菌素等；、细菌素等；l 产生有机酸，如乳酸、乙酸等，及其他生理产生有机酸，如乳酸、乙酸等，及其他生理 活性物质；活性物质；l 降低肠源性内毒素和血氨；降低肠源性内毒素和血氨；l 提高细胞免疫水平；提高细胞免疫水平；l 排斥病原菌定植排斥病原菌定植 4.1 适用性适用性4

24、.2 可行性可行性4.3 竞争性竞争性4.4 功能性功能性 l准确的分类位置；准确的分类位置；l最好是应用对象的正常细菌：如人来源最好是应用对象的正常细菌：如人来源 的细菌用于人；的细菌用于人；l对每一种使用的细菌，都要有独立的分对每一种使用的细菌，都要有独立的分析资料；析资料；l无毒，不致病，达到无毒，不致病，达到GRAS要求。要求。l易于大量生产保存，适应制备过程中复苏、易于大量生产保存，适应制备过程中复苏、培养、浓缩、冷冻、干燥、分装等工艺要培养、浓缩、冷冻、干燥、分装等工艺要求；求；l活菌数量高，存活能力强（最好在活菌数量高，存活能力强（最好在106-108）l培养物特性在制备、储存、

25、运输时保持稳培养物特性在制备、储存、运输时保持稳定；定；l发酵或添加后可赋予产品良好的感官品质，发酵或添加后可赋予产品良好的感官品质，至少不产生不需要的品质；至少不产生不需要的品质；l遗传性状稳定经得起检验；遗传性状稳定经得起检验；l抗胃酸，抗胆汁；抗胃酸，抗胆汁；l进入体内能在目标位点存活繁殖，并有进入体内能在目标位点存活繁殖，并有代谢活性；代谢活性；l能与正常菌群（包括相同的或相近的种）能与正常菌群（包括相同的或相近的种）竞争，具有抵抗原来菌群所产生的酸，竞争，具有抵抗原来菌群所产生的酸，细菌素以及其他抗微生物物质的能力；细菌素以及其他抗微生物物质的能力；l良好的吸附和定植能力；良好的吸附

26、和定植能力；l能发挥一种或多种可在临床证实的有益健能发挥一种或多种可在临床证实的有益健康的作用；康的作用；l对致病或有害微生物具有拮抗作用；对致病或有害微生物具有拮抗作用；l产生抗微生物的物质（细菌素、过氧化氢、产生抗微生物的物质（细菌素、过氧化氢、有机酸或其它抑菌性物质）；有机酸或其它抑菌性物质）；l免疫刺激和调节作用；免疫刺激和调节作用；l抗突变、抗肿瘤作用；抗突变、抗肿瘤作用；l产生生物活性物质（酶、多糖、多肽等）。产生生物活性物质（酶、多糖、多肽等）。5.1 正常菌群对人类健康具有重要意义；正常菌群对人类健康具有重要意义；5.2 菌群与体内营养物质的代谢紧密相关；菌群与体内营养物质的代

27、谢紧密相关；5.3 肠道菌群是益生菌的重要来源；肠道菌群是益生菌的重要来源；5.4 益生菌的有益功能是通过促进天然菌益生菌的有益功能是通过促进天然菌群的作用来实现的；群的作用来实现的；5.5 益生素是一类促进有益菌生长的物质。益生素是一类促进有益菌生长的物质。正常存在于食物中。正常存在于食物中。6.1 追踪技术（追踪技术（tracking methods）6.2 鉴定技术（鉴定技术（identification methods）6.3 原位技术（原位技术（in situ methods）六、用于益生菌和肠道菌的分子生物学技术6.1.1 菌落核酸探针杂交（菌落核酸探针杂交（Colony Hybr

28、idization with Nucleic Acid Probes ）6.1.2 脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis）6.1.3 核酸分型（核酸分型（Ribotyping）6.1.4 多重多重PCR（Multiple PCR）6.1.5 限制片长多态性（限制片长多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）6.1.6 任意引物任意引物PCR（Arbitrary Primed PCR, AP-PCR）6.1.7 三联任意引物三联任意引物PCR（Triplet AP-PCR）6.1

29、.1 菌落核酸探针杂交菌落核酸探针杂交 一些细菌种或属的特异性探针已经一些细菌种或属的特异性探针已经得到，对于检测粪便或肠内容物样品中得到，对于检测粪便或肠内容物样品中的微生物类型非常有用。尽管菌株特异的微生物类型非常有用。尽管菌株特异性的探针很难构建，但随着基因组序列性的探针很难构建，但随着基因组序列的完成，将会促进这些探针的设计。探的完成，将会促进这些探针的设计。探针的选择主要考虑其对特定微生物属、针的选择主要考虑其对特定微生物属、种或菌株的特异性。种或菌株的特异性。基本原理：基本原理：1.探针特异性是本法的关键；探针特异性是本法的关键；2.用鸟枪法或直接法制备探针，依据用鸟枪法或直接法制

30、备探针，依据rRNA区域产生的短寡核苷酸片段（区域产生的短寡核苷酸片段（20bs）是制备属或种特异探针最常用的方法；是制备属或种特异探针最常用的方法；3.可利用可利用rRNA序列数据库及计算机模型检序列数据库及计算机模型检测探针的特异性；测探针的特异性；4.用酶法，荧光或放射性技术标记探针；用酶法，荧光或放射性技术标记探针；5.从菌落提取核酸，利用探针检测。从菌落提取核酸，利用探针检测。6.1.2 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 用于细菌指纹技术。将分离物的基因用于细菌指纹技术。将分离物的基因组消化为几个（组消化为几个（5-50）大分子片段。高）大分子片段。高分子量分子量DNA分子

31、处在两个相互垂直的、分子处在两个相互垂直的、交替变换的电场中，使分子量大小不等的交替变换的电场中，使分子量大小不等的DNA片段分开。对特定的微生物有高度片段分开。对特定的微生物有高度的鉴别作用。的鉴别作用。6.1.3 核酸分型核酸分型 大多数细菌基因组一般含有多个（大多数细菌基因组一般含有多个（8个个以上）拷贝的以上）拷贝的rRNA，因此可以利用，因此可以利用RFLP技术，分析特定的含有技术，分析特定的含有rRNA基因的基因基因的基因组的限制性片段，通过限制片长多态性的组的限制性片段，通过限制片长多态性的特点，来对其进行区分鉴定。特点，来对其进行区分鉴定。基本方法：基本方法： 足够的培养物，提

32、取总足够的培养物，提取总DNA； 利用限制性内切酶将利用限制性内切酶将DNA酶切为不同酶切为不同大小的片段；大小的片段； 琼脂糖凝胶电泳分离；琼脂糖凝胶电泳分离； 用用16S、23S、或、或5S rRNA探针杂交；探针杂交； 探针检测；探针检测；6.1.4 多重多重PCR 多重多重PCR，使用多个引物，以保证同时，使用多个引物，以保证同时 扩增大量的目标扩增大量的目标DNA片段，扩增越多，片段，扩增越多，可靠性越高；可靠性越高； 需要设计合适的反应条件。需要设计合适的反应条件。6.1.5 16S rRNA基因的基因的RFLP 以基因中通用保守片段为引物，快速扩以基因中通用保守片段为引物，快速扩

33、增增16S rRNA的技术。扩增子用适当的限的技术。扩增子用适当的限制性内切酶酶切，然后进行琼脂糖电泳分制性内切酶酶切，然后进行琼脂糖电泳分离，以形成有鉴别特征的多态性。离，以形成有鉴别特征的多态性。 由于基因的保守特性，该技术的辩别能由于基因的保守特性，该技术的辩别能力较低。力较低。6.1.6 任意引物任意引物PCR AP-PCR用单个随意选择的序列（一般用单个随意选择的序列（一般1012bs）作为引物。）作为引物。 辨别能力很高的快速技术，可用于没有辨别能力很高的快速技术，可用于没有序列信息的微生物。序列信息的微生物。 反应条件的微细变化可改变带型。反应条件的微细变化可改变带型。 重复性低

34、。重复性低。6.1.7 三联任意引物三联任意引物PCR 三联任意引物三联任意引物PCR在三个退火温度在三个退火温度 38C、40C、42C平行进行，比较三个反平行进行，比较三个反 应的凝胶电泳结果，进行指纹分析。该应的凝胶电泳结果，进行指纹分析。该 技术可以在种或株的水平鉴别细菌，能技术可以在种或株的水平鉴别细菌，能 可靠地用于双歧杆菌和乳杆菌的指纹分可靠地用于双歧杆菌和乳杆菌的指纹分 析。析。l6.2.1 16S rRNA 序列分析（序列分析（16S rRNA Sequence Analysis）；）；l6.2.2 ITS序列分析（序列分析（ITS Sequence Analysis）；）；

35、l6.2.3 recA基因序列分析（基因序列分析（recA Gene Sequence Analysis ）；）；6.2.1 16S rRNA 序列分析序列分析 通过通过16S rRNA 序列分析对分离序列分析对分离的微生物分型，了解它们的进化系的微生物分型，了解它们的进化系谱，是最常用的方法。谱，是最常用的方法。6.2.2 ITS序列分析序列分析 ITS 内转录间隔区（内转录间隔区（internal transcribed spacer）6.2.3 recA基因序列分析基因序列分析 recA 基因，双歧杆菌的基因。在基因，双歧杆菌的基因。在重组、重组、DNA修复、和修复、和SOS应答中起应答中起重要作用。重要作用。6.3.1 微生物的多态性微生物的多态性6.3.2 原位分析特定的微生物原位分析特定的微生物1. 益生菌在营养物质消化、转化、利用方益生菌在营养物质消化、转化、利用方面的作用；面的作用；2. 益生菌在促进黏膜免疫方面的作用；益生菌在促进黏膜免疫方面的作用；3. 益生菌对保持肠道的生理结构、功能、益生菌对保持肠道的生理结构、功能、微环境方面的作用；微环境方面的作用；4. 益生菌作为食品级载体的作用；益生菌作为食品级载体的作用；5. 益生菌在遗传物质转移、信息传导方面益生菌在遗传物质转移、信息传导方面的作用。的作用。