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1、白藜芦醇对鼻咽癌相关实验模型的整体与离体药理作用研究作者：文炳均，黄碧云，何展祥，吴树浓，黎连新，石胜，吴波【摘要】 目的：了解白藜芦醇诱导大鼠鼻咽癌细胞CNE2 Z凋亡过程中半胱天冬酶6(caspase6)的活化情况。方法：采用实时PCR检测caspase6 mRNA表达的改变，比色法测定caspase6活性的变化。结果：采用不同浓度的白藜芦醇(0 mol/L、30 mol/L、60 mol/L、120 mol/L、240 mol/L)处理小鼠鼻咽癌细胞24 h，caspase6 mRNA的表达呈浓度依赖性的增加(P001)；caspase6活性呈浓度和时间依赖性的升高(P001)。结论：白
2、藜芦醇诱导小鼠鼻咽癌细胞CNE2 Z凋亡过程中存在caspaso6的活化。 【关键词】 白藜芦醇；细胞凋亡；鼻咽癌细胞；半胱天冬酶Studies on the Pharmacologic Mechanism of Resveratrol on Rats with Nasopharyngeal CarcinomaAbstract:Objective To investigate whether caspase6 was activated during resveratrol-induced apoptosis of ratsnasopharyngeal carcinoma cells CNE2
3、Z.Methods The changes of caspase6 mRNA was detected by semi-quantitative RTPCR.The changes of caspase6 activity was determined by colorimetric assay.Results After CNE2Z cells were treated with 0 mol/L，30 mol/L，60 mol/L，120 mol/L，240 mol/L resveratrol for 24 hours，respectively，the expression of casps
4、ae6 mRNA was increased in a concentration-dependent manner(P<0.01).The caspase6 activity was increased in a concentration and time-dependent manner(P<0.01).Conclusion Caspase6 is activated during resveratrol-induced apoptosis of CNE2Z cells.Key words:Resveratrol;Apoptosis;Nasopharyngeal carcin
5、oma cells;Caspase白藜芦醇为多酚类物质，是葡萄属植物产生的一种植物抗毒素，结构类似于雌激素乙底酚。白藜芦醇在植物中分布很广，含量较高，目前至少已经在70余种植物中发现了白藜芦醇。随着对白藜芦醇研究的深入，人们发现它具有多种药理活性，包括抗氧化活性、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、雌激素样活性、生长抑制活性、免疫调节及抗肿瘤活性等。近年来的研究13还发现：白藜芦醇可诱导人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE2 Z凋亡，且其凋亡过程中有caspase3的参与。本文将进一步探讨白藜芦醇诱导大鼠鼻咽癌细胞CNE2 Z凋亡过程中是否有caspase6的活化，对caspase6 mRNA的表达
6、及其活性变化进行了分析，现报道如下。1 材料与方法11 材料 实验用鼻咽癌大鼠27只(3月龄同系)，体重(23517)g，雌雄不拘，全部由中山大学实验动物中心提供；白藜芦醇为Sigma公司产品，使用前用DMSO溶解配成240 mmol/L；caspase6多克隆抗体为Santa Cruz公司产品； caspase6抑制剂VEID-fmk为Clontech公司产品；caspase6底物ACVEID-pNA为Alexis公司产品；9600型基因扩增仪为PE公司产品；ELx 800型酶标免疫测定仪由BioTek公司生产；RTPCR试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。1.2 方法121 RTPC
7、R检测caspase6 mRNA的表达 总RNA的提取：分别收集白藜芦醇0 mol/L、30 mol/L、60 mol/L、120 mol/L、240 mol/L处理24 h的鼻咽癌大鼠CNE2 Z细胞，严格按操作规程提取总RNA；引物的设计与合成：引物设计采用软件Primer Express 20进行，其Forward primer为5-CCATGGCGAAGGCAATCA-3，Reverse primer为5-CTCCAGCAGGCAGCGTGTAA-3，以actin为内参物，其Forward primer为5-TCCTGTGGATCCACGAAACT-3，Reverse primer为G
8、AAGCATTTGCGGTGGACCAT-3，由中山大学达安基因股份有限公司采用ABI 3900台式高温量DNA合成仪合成。扩增条件：49逆转录43 min，95预变性2 min，循环30次(94 30 s，52 1 min，68 2 min)，再68充分延伸8 min。122 比色法caspaso6活性的测定 将鼻咽癌大鼠细胞分为三组：对照组(未经药物和抑制剂处理的CNE2 Z细胞)；白藜芦醇组(用白藜芦醇30 mol/L、60 mol/L、120 mol/L、240 mol/L处理24 h的CNE2 Z细胞及120 mol/L白藜芦醇处理4 h、8 h、12 h、24 h、48 h的CNE
9、2 Z细胞)；VEID-fmk+白藜芦醇组(先用120 mol/L VEIDfmk预处理2 h后，再用白藜芦醇处理的CNE2 Z细胞)，各组均设3复管。分别收集三组细胞，参照文献4处理后，加入caspase6的底物AC-VEID-pNA，使其最终浓度为60 mol/L。置37孵育60 min，转移到96孔板中，在405 nm下测定其吸光度来表示caspase6的相对活性。12.3 统计学处理 采用SPSS 110进行统计学处理，组间比较采用t检验。2 结果21 caspase6 mRNA的表达 分别采用白藜芦醇0 molL 、30 molL、60 molL、120 molL、240 molL处
10、理CNE2 Z细胞24 h，caspase6 mRNA的条带逐渐变粗、变亮；图像分析结果也显示caspase6actin(内参物)的光密度积分值之比有随浓度增加而增高的趋势，具有浓度依赖性(P001，见图1)。图1 Caspase6 mRNA水平变化的图像分析结果（略）(注：与对照组相比，*：P001)22 caspase6活性的变化 用白藜芦醇120 mol/L处理CNE2 Z细胞4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、48 h，caspase6的相对活性测定结果见表1。从表1可见caspase6的活性随处理时间的延长而不同，具有时间依赖性(P001)。 caspase6的活性在用白藜
11、芦醇处理后8 h开始升高(与对照组、 VEID-fmk+白藜芦醇组两组比较， P<0.01)， 16 h达高峰(约为对照组的5倍， P001)。 以后呈缓慢下降， 至48 h才降至对照组水平(P>005) 。 用白藜芦醇0 molL 、 30 molL 、 60 molL、120 molL、 240 molL处理细胞后16 h，各浓度组caspase6的相对活性见图2，从图2可见caspase6活性有随浓度增加而增高的趋势，具有浓度依赖性(P<0.01)。表1 白藜芦醇120 mol/L处理后不同时间caspase6相对活性的检测结果(A405 nm)（略）注：与其他两组相比
12、，*：P001。图2 不同浓度白藜芦醇处理后16 h caspase6相对活性的检测结果（略）(注：与对照组相比，*：P005，*：P001)3 讨论白藜芦醇化学名为芪三酚(3，4，5-trihydroxystibene)，是一种天然活性成分，目前已在葡萄、决明、藜芦、虎杖等21个科、31个属的72种植物中发现，较早证实其有抗菌、抗炎、抗血栓、抗脂质过氧化等功效，近年还发现其有抗癌活性。在对其抗癌机制研究中，已发现白藜芦醇可通过诱导多种肿瘤细胞株凋亡而抑制其增殖5，6。细胞凋亡信号传导的关键是caspase的激活，所有的caspase正常时均以无活性的酶原形式存在，当受到凋亡信号的刺激时，切割
13、形成一个大亚基和一个小亚基，然后结合成22四聚体，从而形成有活性的caspase。caspase通过有序的依次切割而被激活，产生级联反应，最终诱导细胞凋亡。迄今已发现caspase家族有16个成员，据caspase在级联反应中的作用和活化的先后，分为启动性和效应性caspase，caspase6属效应性caspase。近年来研究发现，白藜芦醇诱导一些肿瘤细胞凋亡中也有caspase6的参与。因此，caspase6在一些肿瘤细胞(包括鼻咽癌细胞)凋亡过程中起重要作用。本研究采用不同浓度白藜芦醇处理CNE2 Z细胞24 h，采用半定量RTPCR发现白藜芦醇浓度依赖性地增加caspase6 mRNA
14、的表达；同时通过caspase6活性的检测，发现caspase6的活性呈浓度和时间依赖性的升高。因此，从caspase6的转录和活性检测结果均证实，在白藜芦醇诱导大鼠鼻咽癌细胞CNE2 Z细胞凋亡的过程中有caspase6的活化。【参考文献】 1 Ai Shih，Shenli Zhang，HJames Cao，et alInhibitory effect of epidermal growth factor on resveratrol-induced apoptosis in prostate cancer cells is mediated by protein kinase C-JMol
15、Cancer Ther，Nov 2004，3：135513642 ShengHong Tseng，SweiMing Lin，JinCherng Chen，et alResveratrol Suppresses the Angiogenesis and Tumor Growth of Gllomas in RatsJClinCancer Res，Mar 2004，10：21902202.3 唐旭东，周克元，赵南.白藜芦醇对鼻咽癌细胞株CNE2Z增殖和凋亡的影响J.中草药，2004，35(3)：287290.4 Grub S，Pcrsohn E，Trommer W E，et al.Mechanis
16、ms of cyclosporine A-induced apoptosis in rat hepatocyte primary culturesJ.Toxicol Appl Pharmacol，2000，163(3):209.5 Dominique Delmas，Cedric Rebe，Sandrine Lacour，et al.Resveratrol-induced Apoptosis Is Associated with Fas Redistribution in the Rafts and the Formation of a Death-inducing Signaling Complex in Colon Cancer CellsJ.J.Biol.Chem，Oct 2003，278:4148241490.6 Sunita B.Jones，Samuel E，et al.Resveratrol-Induced Gene Expression Profiles in Human Prostate Cancer CellsJ.Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev，Mar 2005，14:596604.8 / 8文档可自由编辑打印
白藜芦醇对鼻咽癌相关实验模型的整体与离体药理作用研究
