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1、Southernblot 实验方法与步骤This manuscript was revised by the office on December 22, 2012实验名称：Southernblot一、实验目的？1 .学习核酸杂交的基本过程和操作。二、实验原理？将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分 离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上， 固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物 中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗 涤后川自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片
2、段及其相对大 小。川途：检测样品中的DA及其含量，了解基因的状态，如是否有点突变、扩 增重排等。三、试剂与仪器(一)器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交 袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇 床，X线胶片。(二)试剂：限制性内切，DNA加样缓冲液，DNALadderMarker, 0. 25MHC1变性液(O.5MNaOH, 1.5MN&C1)中和液(0. 5MTris-HClPH7. 5, 3MNaCl),转印迹液SSC (3MNaCl, 0. 3M柠檬酸钠,PH7. 0)标记探针，20XSSC,预杂交液和杂交液，2X
3、洗液(2XSSC, 0. 1%SDS)2 X 洗液洗.5 义 SSC, 0. 1%SDS)IX缓冲洗液(0. 1M马来酸0. 15MNaC1, PH7. 5, 0. 3%Tween20 )1 X封阻液1 % (W/V)封阻剂溶于IX马来酸溶液(0. 1M马来酸，0. 15MNaCl, PH7. 5IX检测液(0. IMTris-HCl, 0. lMNaCl,PH7. 5)抗一地高辛一碱性磷酸。四、实验步骤1、制备DA分子(PCR)2 .琼脂糖凝胶电泳分离DA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品 的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25NHC1中脱嗯吟，当胶中的澳
4、酚蓝变为黄色取出4将胶从HC1溶液中取出，用ddH20涮洗两次，然后放入碱变性液(0.5 MNaOH)中处理45min,使胶中的ds-DNA变为SSTNA。5取一个瓷盘，注10XSSC,横跨窄边架上一块玻璃板，在玻璃板上铺2 层30cmX 10cm滤纸，纸条长两侧垂入10XSSC中6将胶底朝上放在滤纸上7裁与胶同样大小的尼龙膜平铺到胶上8用塑料布盖住尼龙膜四周，裁与尼龙膜同样大小的滤纸一张，铺在尼龙 膜上。9叠5至8cm高的吸水纸，再压一重物，放置过夜10转印结束后，将尼龙膜切角做记号，放到一张滤纸上，紫外交联30s11预杂交：将尼龙膜放入到杂交管中，倒入预杂交液，在杂交炉上42,低速转动lh
5、。12杂交：弃预杂交液，往管中导入杂交管液，42, 6-20ho13回收杂交液冻存，往管中加入50nli2XSSC/01%SDS洗5min重复一次。14往杂交管中加入66c预热的50mL0. 5XSSC/0. 1%SDS, 66洗涤30min,重复一次。15 齐洗液，加入 washingbuffer （马来酸 buffer/0. 3%Tween20）浸泡 5min<>16 加入 lOOmLblockingbuffer （封闭液），室温，lh17倒掉杂交管中的blockingbuffer,加入抗体溶液,25,温育lh。18 加入 500mlwashingbuffer,洗 2h19将尼龙膜从杂交管中取出，放入盛有detectionbuffer （pH9. 5）的大 培养皿中,浸泡5nlin。20将尼龙膜铺到一张大保鲜膜上，均匀滴加800 ULCSPD溶液，将另一侧 的尼龙膜平整地覆盖到膜上，轻轻挤走气泡。37,温育21将尼龙膜铺到暗匣中，在暗室中压上X光胶片，压片2h。22洗片：暗室中，将胶片依次放入显影液3min,定影液lmin。然后用自 来水将胶片充分涮洗后晾干。五实验结果与分析
Southernblot实验方法与步骤
