基于纳米簇电化学发光生物胺传感器的构建与应用论文设计

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1、摘要Construction and Application of Electroluminescent Biogenic amine sensors Based on Nanoclusters摘要电化学发光（Electrogenerated chemilumines-cence，ECL）作为一种新型的电化学技术，被广泛应用于生物检测，具有灵敏度高、线性范围广、成本低、可控性好、样品预处理简单、检测快速等特点。目前，在ECL中使用了不同的量子点作为发射体，而这些量子点由于其结构中存在诸如Cd2+和Pb2+等重金属的固有毒性，导致生物测定的应用受到限制。而且许多传统的有机发光剂价格昂贵，毒性大。

2、因此，为了减少环境污染和经济损耗，开发一种新的低毒或无毒的ECL生物分析材料极为必要。目前，贵金属纳米团簇（Noble metal clusters，MNCs；尺寸小于2 nm）由于其独特的导电性和优异的生物相容性，在荧光生物标记、化学传感和生物传感器检测和实际应用中受到了广泛的关注。由于特殊的物理（光学、电子）、化学性质，金纳米团簇（Au NCs）和银纳米团簇（Ag NCs）被用作化学传感和生物成像的电化学发光标签。因此，基于贵金属纳米材料的电化学传感器研究及生物分析应用具有极大的研究价值及应用前景。由于生物分子保护的金纳米簇具有更好的生物相容性，本文报道了一种新型的基于AuAg纳米团簇的精

3、胺(SPM)固态ECL传感器。以L-谷胱甘肽(L-GSH)为模板，通过两步合成高水溶性的金银纳米团簇(AuAg NCs)，本研究发现该金银纳米团簇(AuAg NCs)具有较强的阴极与阳极电化学发光信号，特别是SPM能够有效地抑制AuAg NCs的阴极ECL强度却又能增强AuAg NCs的阳极ECL强度，本研究并对其抑制或增强ECL的机理进行了研究，提出了SPM作为共反应促进剂的ECL机制。为了构建固态ECL平台，在玻碳电极表面对AuAg NCs、PANI、ATMP进行了良好的修饰，并利用PANI的优良导电性促进了它们之间的电子转移。通过优化一些重要的实验条件，构建了用于测定SPM的ECL传感器

4、，其阳极与的阴极的线性范围分别为110-12-110-5 M和110-12-110-4 M，最低检出限分别为1.1010-13 M (S/N=3) 和2.9710-13 M (S/N=3)，其稳定性良好。本论文的具体研究内容如下：设计了一种基于GSH-AuAg NCs的液相电化学发光（ECL）生物传感器，用于精胺的便捷检测分析。本研究以谷胱甘肽作为模板保护剂，首次制备了具红色荧光的高水溶性金银合金纳米簇，发现其能够在K2S2O8体系中产生阴极电化学发光，也能够在TEA体系中产生阳极电化学发光，而且生物分子精胺能够抑制GSH-AuAg NCs在阴极和阳极的电化学发光。基于此现象，首次构建了一种简

5、便的GSH-AuAg NCs液相电化学发光生物识别系统，这种发光体系在均相溶液中进行，无需电极修饰。因此，构建了这一简单而方便的电化学发光方法被用于精胺的检测分析，在阳极检测中精胺浓度在210-5-17.810-5 M和17.810-5-210-3 M之间具有良好的线性关系，检测限为1.3210-6 M；在阴极检测中精胺浓度在110-5-5010-5 M和5010-5-410-3 M之间具有良好的线性关系，检测限为1.9510-6M。并且具有良好的稳定性，可操作性和实用性，显示出广泛的实际应用潜力。基于以上结果，本研究设计了一种新型ATMP诱导三维导电聚合物水凝胶支架的固态电化学发光生物传感器

6、。用苯胺（Ani）、谷胱甘肽保护的金银二元合金簇（GSH-AuAg NCs）和氨基三亚甲基膦酸(ATMP)对GCE电极进行修饰，以GSH-AuAg NCs信号探针，构建了一种基于聚苯胺（PANI）水凝胶的固态电化学发光（ECL）生物检测系统。发现该GSH-AuAg NCs作为发光体既能够在K2S2O8体系中产生阴极电化学发光，又能够在TEA体系中产生阳极电化学发光，而且生物分子精胺能够抑制其阴极电化学发光，却又增强其阳极的电化学发光。基于此现象，构建了一种新型的基于AuAg NCs和K2S2O8体系/TEA体系的精胺(SPM)固态ECL传感器。阴极与阳极的检测范围分别为110-12-110-4

7、 M和110-12-110-5 M，相应的检测限分别为2.9710-13 M、1.1010-13 M。实验结果证明该ECL传感器具有较宽的线性范围和较低的SPM检测限。因此，基于AuAg NCs的生物胺ECL传感器在生物应用方面具有很大的潜力。综上，本研究有助于为生物化学与纳米分析领域各种生物传感器的开发和应用提供新的思路。关键词：生物胺；金银纳米簇；导电聚合水凝胶；固态电化学发光传感；精胺VIIIAbstractAbstractElectrochemical chemilumines-cence (ECL), as a new type of electrochemical technolo

8、gy, is widely used in biological detection. It has characteristics of high sensitivity, wide linear range, low-cost, good controllability, simple sample pretreatment and fast detection. Currently, different QDs have been used as emitters in ECL, and the QDs are limited in the application of bioassay

9、 due to the inherent toxicity of heavy metals such as Cd2+ and Pb2+ in their structures. Besides, many traditional organic luminescent agents are expensive and toxic. Therefore, in order to reduce environmental pollution and economic depletion, it is extremely necessary to develop a new low-toxic or

10、 non-toxic ECL bioanalytical species.Nowadays, noble metal nanoclusters (MNCs; size less than 2nm) have received widespread attention in fluorescent biomarkers, chemical sensing and biosensor detection and practical applications owing to their unique electrical conductivity and excellent biocompatib

11、ility. Gold nanoclusters (Au NCs) and silver nanoclusters (Ag NCs) have been used as electrochemiluminescence labels for chemical sensing and bioimaging due to their special physical (optical, electronic) and chemical properties. Therefore, the research of electrochemical sensor based on noble metal

12、 nanomaterials and the application of biological analysis have great research value and application prospects. Since biomolecular-protected gold nanoclusters have better biocompatibility, this paper reports a new solid-state ECL sensor based on AuAg nanoclusters spermine (SPM). Using L-glutathione (

13、L-GSH) as stabilizer, high water-soluble gold/silver nanoclusters (AuAg NCs) were synthesized in two steps. This study found that the synthesized gold/silver nanoclusters (AuAg NCs) had strong cathode-anode ECL signals. In particularly, SPM can effectively suppress the cathodic ECL intensity of AuAg

14、 NCs while enhancing AuAg NCs the nodic ECL strength. The mechanism of inhibition or enhancement of the ECL is studied, and the ECL mechanism as the co-reaction promoter is proposed. To construct a solid ECL platform, the AuAg NCs、PANI、ATMP was well modified on the glassy carbon electrode surface an

15、d the excellent electrical conductivity of PANI was used to promote electron transfer between them.The ECL sensor used for the determination of SPM was constructed by optimizing some important experimental conditions. The linear ranges of the anode and cathode are 110-12-110-5 M and 110-12-110-4 M,

16、respectively. The lowest detection limits are 1.1010-13 M (S/N=3) and 2.9710-13 M (S/N=3), respectively. And their stability is good. The details specific content of this paper are as follows:A liquid state electrochemical luminescence (ECL) biosensor based on GSH-Au Ag NCs was designed for convenie

17、nt detection and analysis of spermine. Using glutathione as a protective agent, high water-soluble gold and silver alloy nanoclusters with red fluorescence was prepared for the first time. It was found that it could generate cathodic electrochemiluminescence in K2S2O8 system, and anodic electrochemi

18、luminescence in TEA system, and biomolecularspermine could inhibit the electrochemiluminescence of GSH-AuAg NCs at cathode and anode. According to this phenomenon, a facile GSH-AuAg NCs liquid-phase electrochemical luminescence biometrics system was constructed for the first time. This luminescence

19、system was carried out in homogeneous solution without electrode modification. Therefore, this simple and convenient electrochemiluminescence method was constructed used for the detect spermine. In anode detection, there was a good linear relationship between 210-5-17.810-5M and 17.810-5-210-3M for

20、the detection of spermine by ECL, and the detection limit was 1.3210-6M. In cathode detection, there was a good linear relationship between 110-5-5010-5 and 5010-5-410-3M for spermine in ECL technique, and the detection limit was 1.9510-6M. And have good stability, maneuverability and practicability

21、, showing a promising practical application prospect. Based on the above results, a new solid state electroluminescent biosensor for ATMP-induced three-dimensional conductive polymer hydrogel scaffolds is designed in this study. GCE electrodes were modified with aniline (Ani), glutathione-protected

22、gold-silver binary alloy clusters (GSH-AuAg NCs), and aminotrimethylphosphonic acid (ATMP) to GSH-AuAg NCs signal probes to construct a solid-phase electrochemiluminescence (ECL) bio-detection system based on conducting polymeric hydrogels.The probe was found to be able to produce both cathodic elec

23、trochemiluminescence and anodic electrochemiluminescence in the K2S2O8 system. Moreover, biomoleculesspermine can inhibit their cathodic electrochemiluminescence but also enhance their anodic electrochemiluminescence. According to this phenomenon, a novel fine amine (SPM) solid-state ECL sensor base

24、d on AuAg NCs and K2S2O8 systems/TEA systems was constructed. The detection range of cathode and anode is 110-12-110-4 M and 110-12-110-5M, respectively. The experimental results show that the ECL sensor has a wide linear range and low SPM detection limit. Therefore, AuAg NCs-based biogenic amine EC

25、L sensors have great potential in biological applications. In summary, this study is helpful to provide new ideas for the development and application of various biosensors in the field of biochemistry and nanoanalysis.Key Words: Biogenic Amines; Gold and Silver Nanoclusters; Conductive Polymerizatio

26、n Hydrogel; Solid-state Electrochemiluminescence Sensing; Spermine目录目录摘要IAbstractIII第1章 绪论11.1 引言11.2 生物胺21.2.1 生物胺简介21.2.2 生物胺的化学结构31.2.3 生物胺的合成条件31.2.4 生物胺的生理功能41.2.5 生物胺的研究现状41.3 电化学发光技术51.3.1 电化学发光简介51.3.2 电化学发光技术的应用优势11.3.3 电化学发光的反应机理21.4 贵金属纳米簇简介31.4.1 贵金属纳米团簇的合成41.4.2 贵金属纳米簇的特点与性质11.4.4 贵金属纳米

27、簇在电化学发光传感中的应用21.5 导电聚合水凝胶31.5.1 导电聚合水凝胶的性质31.5.2 导电聚合水凝胶的研究现状41.5.3 导电聚合水凝胶在生化传感领域中的应用41.6 贵金属纳米簇电化学发光生物传感器在生命分析中的应用51.6.1 在生物标志物检测方面的应用51.6.2 对生物分子的分析应用71.6.3 在疾病诊断中的免疫分析应用71.7 本论文整体构想及主要研究内容91.8 本论文创新之处11第2章 AuAg NCs的电化学发光性及精胺对其发光性抑制的研究122.1 引言122.2 材料与方法122.2.1 试剂与仪器122.2.2 实验方法142.3 结果与讨论162.3.1

28、 AuAg NCs性质研究162.3.2 AuAg NCs电化学发光性机理研究192.3.3 AuAg NCs 液相电化学发光传感器对精胺的响应检测222.3.4 AuAg NCs 液相电化学传感器的稳定性与重现性242.4 本章小结25第3章 AuAg NCs固态电化学生物胺传感器的构建与应用273.1 引言273.2 材料与方法283.2.1 试剂与仪器283.2.2 实验方法293.3 结果与讨论313.3.1 AuAg NCs 电化学发光传感器的构建方法323.3.2 AuAg NCs 电化学发光传感器的电化学性质研究323.3.3 AuAg NCs电化学传感器电化学行为研究343.3

29、.4 AuAg NCs电化学传感器对精胺的电化学响应检测373.3.5 AuAg NCs电化学传感器的重复性和稳定性393.3.6 AuAg NCs电化学发光传感器对实际样品中精胺的检测413.4 本章小结42第4章 总结与展望444.1 总结444.2 展望46参考文献47第1章 绪论第1章 绪论1.1 引言近年来，生物分析方法的研究取得了巨大的进展，其应用广泛，涉及诸多领域，包括健康监测1、临床诊断2、药物分析3、食品安全4、环境监测5和基础生物学研究6等，其中，纳米材料的生物分析技术引起了学者们的广泛关注。特别是贵金属纳米材料具有独特的物理化学性质，如低毒性、高的吸附和反应能力以及良好的

30、生物相容性等优点被用作潜在的生物分析探针，不仅能够提高检测灵敏度，而且为生物胺类的分析提供一种新的平台7。此外，导电聚合水凝胶作为一种新型的功能材料，以其良好的电化学活性、优异的稳定性和基底附着力，使得导电聚合水凝胶成为生物世界的一种独特的桥接材料，从而被应用于制备一种具有生物识别系统的传感器，其中包括动物细胞和植物细胞中的生物胺类传感器8。生物胺（Biogenic Amines，BAs）是一类具有生物活性的天然低分子有机化合物，广泛存在于动植物中。此外，生物胺根据其结构可分为三类：脂肪族、杂环族和芳香族，主要由氨基酸的脱羟基化形成1。它们是动植物细胞的正常活性成分，在细胞繁殖、生长和分化中起

31、着重要作用10。其次，生物胺主要存在于水产品、肉制品和发酵制品等不同种类的食品中2。它们大多具有很强的生理作用，在合成激素、生物碱、核酸和蛋白质的氮源与前体方面发挥着重要的生物学功能3。但是，人体若摄入过量的BAs，将会引起头痛、恶心、过敏等不良反应4。因此，食品中BAs的含量可以作为食品质量评价的指标5。在人体内，BAs也是核苷酸、蛋白质、生物碱和一些激素合成的前体。BAs发挥作为激素或神经递质作用的关键生物功能，是生物活性细胞的不可缺少的部分。从生物和化学的角度来看，BAs被认为是一种危害，因为它们是食物保存不当或不良的标志。因此，可作为几种食品饮料贮存、监测和卫生状况的控制参数。从生理学

32、的角度来看，BAs可能引起疾病和健康问题，其中可能包括几个与毒理学问题6有关的临床概况：胃或肠道问题；过敏反应7；头痛、恶心和哮喘8；呼吸道疾病、心脏紊乱和血压扭曲等9。同时，这些化合物的不平衡分泌被认为是神经内分泌肿瘤筛查中的相关生化标志物，如：神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤19。精胺（SPM）作为早期癌症诊断的关键生物标志物，也是生物胺的一种关键目标物。SPM存在于真核细胞和体液中，在细胞生长和增殖中起着重要作用，其通过稳定细胞膜和细胞骨架结构来调节细胞的增殖和分化10。在人体中，SPM在免疫反应、神经元调控和某些病理事件中起着重要作用。因此，SPM水平的波动通常与疾病有关20。当SPM的水平改

33、变时，其可能指示异常的生物过程。事实上，癌症患者的SPM水平也有显著上升的报道 21。虽然SPM已被提出并作为肿瘤早期诊断和疗效评价的标志物，然而，SPM代谢的具体机制尚不完全清楚。因此，寻求一种有效的SPM水平检测方法对阐明SPM的生物学功能和开发新的健康诊断工具具有重要意义。然而，精胺的低分子量、低挥发性和缺乏发色团，极大地阻碍了精胺的灵敏和选择性检测。生物胺的传统检测技术，如免疫分析方法22,23，电化学方法24,25和色谱技术26,27等具有操作复杂、时间长、材料消耗大、设备昂贵等缺点限制了这些检测方法的应用。近年来，电化学发光(ECL)以其高灵敏度和极宽的动态范围引起了人们的广泛关注

34、，被广泛应用于食品分析28,29、免疫检测30,31、临床传感器32,33和环境监测5,34等领域。因此，研制用于检测BAs的ECL传感器具有不可替代的实用价值35,36。1.2 生物胺1.2.1 生物胺简介生物胺（Biogenic Amines，BAs）是一类结构包含脂肪族（如：精胺、亚精胺、腐胺、尸胺）、杂环族（如：羟色胺、组胺）或芳香族（如：苯基乙胺、酪胺）的兼具生物活性与碱性的低分子量有机氮化合物37。可看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质，常存在于动植物体内及食品中。根据BAs组成成分可以分为两类：单胺和多胺，主要的单胺类包括组胺、酪胺、尸胺、色胺、腐胺和苯乙胺

35、，适量的单胺可对人体血管和肌肉有明显的舒张和收缩作用，而且对大脑皮层和精神活动也有重要的调节功能。多胺类主要是精胺和亚精胺，其在生物体的生长过程中能促进DNA、RNA和蛋白质的合成，加速生物体的生长发育。尤其是精胺（SPM），主要是一种天然形成的细胞内化合物，在许多生物体中广泛分布，参与许多生理功能，包括细胞生长、哺乳动物细胞的增殖和分化、某些信号转导、细胞粘附和生物大分子合成等19。SPM在促进生物体的生长过程中能够保护DNA免受自由基攻击造成的损伤。作为一种自由基清除剂，也被证明能够保护身体组织免受氧化应激38。因此，它在人体中的失衡将与一些致命疾病的发生有关8。1.2.2 生物胺的化学结

36、构生物胺的存在对自然界中对植物、动物以及微生物细胞活性有重要的意义。人体细胞中亦含有，但是若BAs含量改变则会引起人体相应的不良反应39。比如，多胺缺乏会引起神经系统疾病，如癫痫40，而过量会引起呼吸窘迫和心悸等多种症状18。常见的生物胺结构图见图1-1： 图1-1 常见生物胺的结构Fig.1-1 Chemical structure of biogenic amines1.2.3 生物胺的合成条件生物胺生物合成需要满足一些基本条件，主要有游离氨基酸、产生氨基酸脱羧酶的微生物和适宜的环境，以保证微生物的生长和合成脱羧酶的转化9。在脱羧酶催化下，氨基酸首先将-羧基转移给含胺基的母体，然后形成相应

37、的生物胺。脱羧基反应机理可分为两种：一种是磷酸吡哆醛反应机理，即磷酸吡哆醛自催化氨基酸反应；另一种是非磷酸吡哆醛反应，其中乙酰基通过共价键将氨基酸和苯乙胺嵌入酶中，同时将其从丝氨酸分离出来。1.2.4 生物胺的生理功能生物胺广泛存在于生物体内，参与生物的新陈代谢。生物胺作为人体必需的生物活性成分，在机体中具有重要的生理功能。不同的生物胺具有不同的生理活性，生物胺的适当摄入对机体有积极的作用。例如，适量的精胺可以促进DNA、RNA和蛋白质的合成，并且促进其生长发育3，如表1-1所示。表1-1 生物胺的生理作用。Table 1-1 Physiological functions of biogen

38、ic amines.类别 生理作用精胺 肠道调节色胺 调节血压酪胺 增加心率、升高血压、升糖作用、抗氧化苯乙胺 调节去甲肾上腺激素水平、增加血压组胺 局部免疫调节、肠道调节、神经递质功能、控制炎症反应、调节白细胞数量精胺、亚精胺、腐胺、尸胺 调节 DNA、RNA 和蛋白质生成及生物膜稳定性精胺（SPM）是一种含两个或两个以上氨基的脂肪族化合物，具有一定的生物学活性，是早期肿瘤诊断的重要标志物。少量精胺是体内的正常成分，具有调节肠道、促进某些重要生物大分子（DNA、RNA和蛋白质）形成、维持生物膜稳定性的生理功能。此外，过量的精胺、亚精胺、尸胺和腐胺会与体内亚硝酸盐发生反应，产生强致癌物质41。

39、1.2.5 生物胺的研究现状 生物胺（BAs）是低分子质量的物质，对所有生物体的适当健康至关重要。例如，在动植物细胞中普遍存在的精胺和亚精胺，参与细胞的一些生物学功能（增殖、分裂、稳态、基因表达和蛋白质合成等）3。适当摄入生物胺对机体的生理功能有积极的影响，如增加代谢、促进生长发育、增强自由基清除和免疫功能等，然而摄入过量的生物胺可引起呕吐、腹泻、偏头痛等不良反应17，其潜在的毒性已经引起了相关部门的重视。鉴于此，设计并成功构建一种超灵敏、高效率检测食品、药品或生物制品中生物胺的方法与人类健康紧密相关。但是由于生物样品的不稳定性（热敏感性、易氧化性）及体液中BAs的浓度较低，生物样品中BAs的

40、生物分析方法还有待改进。所以，致力于开发一种实时有效的生物胺的检测方法越来越受到国内外学者的广泛关注。 目前，生物胺的常用分析方法包括分光光度法、荧光法、层析法（液相色谱-质谱法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法)、放射免疫法、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、生物传感器等。我们以精胺为例简要说明其研究现状，譬如，2016年，Malik等人42建立了一种精胺检测的新策略：聚合物诱导的FRET-表面活性剂络合的方法，其检出限为0.12 M；2019年，Ratish R. Nair等人43研制了一种高选择性的开启荧光生物传感器，用于测量人体尿液和血液中的精胺，其检测范围为6 M-2.5 mM；同年，

41、Shweta Chopra等人44开发了一种新型的比色检测方法，该方法以有机纳米粒子用于蒸气和水相中精胺和亚精胺的视觉检测，两种生物胺的检出限分别为35 nM和36.2 nM。以上这些方法虽然具有便捷性，但仍存在检测限偏高，检测范围窄等不足。然而电化学发光传感器方法具有仪器设备简单、操作方便、易于实现自动化、高灵敏度、高选择性、极宽的检测范围、低成本等优点，其利用生物识别元件的选择性和ECL技术的高灵敏度，因此，被应用于生物分子的超灵敏检测45，这一方法将弥补传统分析技术对生物胺分析的诸多不足。1.3 电化学发光技术1.3.1 电化学发光简介电化学发光（Electrogenerated che

42、milumines-cence，ECL）又称电致化学发光，是融合电化学反应和化学发光反应的产物。它主要是在电极表面施加一定的电压，促使产生高能电子转移反应和电子激发态发射信号而产生的一种发光现象。即ECL技术是电化学在电极表面引发的一种化学发光反应，说明该分析技术是将发光作为电化学反应的直接或间接结果。由于具有非常高的灵敏度、极宽的动态范围和优异的可控性，在分析的各个领域引起了广泛的关注。621.3.2 电化学发光技术的应用优势电化学发光（ECL）是利用电化学技术从ECL发光体的激发态中产生的，因为其高灵敏度和极宽的动态范围，已被应用于生物分子的痕量目标检测、免疫分析、临床传感和环境监测等领域

43、28-36。作为一种新的分析工具，与其它光学方法相比，ECL具有独特的优越性，包括光发光、生物发光和化学发光46，见表1-2。表1-2 不同发光分析的优劣比较。Table1-2 Comparison of advantageous and disadvantageous of different luminescence assays.发光类型光激发优点缺点化学发光（CL）化合物的化学激发灵敏，线性响应，光发射快，无光源光子产率低，灵敏度有限，应用少生物发光（BL）发光生物高灵敏度由于低背景，低成本，活细胞高通量成像亮度低，成像时间长，基板光致发光（PL）化合物的光激发发光过程灵敏、简单、快速

44、需光源，背景高，高光毒性，高光漂白，自动光致发光，非选择性光激发电化学发光（ECL）电产生的化学激发快速、简单的测量，宽的线性范围（六阶以上），高精度和灵敏度，受控反应，样品体积小，试剂消耗少，没有光源，没有背景信号，多通道获取信息，多技术融合，可实现复杂样品的同时分离检测较复杂的仪器，一些新发射体的ECL效率较低，需要开发新的发射体和共反应体首先，由于ECL不要求外部光源，因此简化检测装置的同时，也降低了传统光致发光传感系统（如自荧光）中的背景噪声，从而提高了检测的灵敏度。第二，与化学发光相比，ECL对发光反应的时间和位置有明显的控制，因为ECL发射只发生在电极的扩散层。对光发射位置的更好的

45、控制导致比CL更高的选择性、简单性和重现性。应该注意的是，这一优势导致同时测定同一样品中的多分析物需要使用多个电极。第三，ECL通常是一种无损系统，因为ECL的发射会导致ECL发射体的再生。与共反应物相比，ECL发光材料的再生使其能够再次参与ECL反应。而且每个测量周期都会产生许多光子，从而提高技术的灵敏度。最后，电致化学发光(ECL)由于其优异的性能，已成为设计传感器和生物传感器的最有潜力的分析技术之一。1.3.3 电化学发光的反应机理有关ECL在半个多世纪的发展可追溯至1927年，由Dufford等47人首次发现在Grignard化合物的无水乙醚溶液中，对阳极或阴极加500到1500V电压

46、时产生电解发光现象；到了20世纪60年代中期，Hercules和Bard等人47第一次详细的研究了ECL。其内容就涉及氧化物种和还原物种之间的电前转移反应，这些反应都是由电极上的电极电位交替脉冲产生的。根据参与发光反应的物质种类与发光过程电位控制方式的不同，通常把ECL分为湮没型ECL（annihilation ECL）和共反应物参与型ECL（coreactant ECL）。（1）湮灭型电化学发光（Annihilation ECL）反应机理当交流电压作用于电极表面时，A物质和B物质在电极附近分别被氧化和还原为阳离子自由基A+和阴离子自由基离子B，A+和B又很快生成激发态A*或B*，这一过程产生

47、由两者间的相对能量决定。A*返回基态时向外释放光子，进而产生发光现象47。这类反应通常被称为“湮灭”反应，机理如下： A-eA+（阳极氧化）（1-1） B+eB（阴极还原）（1-2）A+B-A*+B（激发态的形成）（1-3）A*A+h （激发态返回基态发光）（1-4）例如，有机ECL试剂9,10 -二苯基蒽（DPA）的发光反应属于湮没型ECL。在铂电极上施加1.4-2.2 V电压，电解液为乙腈或二甲基甲酰胺（DMF）和季铵盐。反应过程如下：DPA-eDPA+（阳极氧化） （1-5）DPA+e DPA（阴极还原） （1-6）DPA+DPA1DPA*（单电子转移） （1-7） 1DPA*DPA+h

48、（化学发光）（1-8）如无机类ECL试剂：联吡啶釕的ECLRubpy3 2+eRubpy3 +（电极还原）Rubpy3 2+-eRubpy3 3+（电极氧化）（1-9）（1-10）Rubpy3 +Rubpy3 3+Rubpy3 2+ Rubpy3 2+*（电转移）（1-11）Rubpy3 2+*Rubpy3 2+h（化学发光）（1-12）综上，电化学发光物质需满足三个条件：第一，具有可逆的一电子转移的电解反应；第二，自由基离子必须在氧化还原反应中有一定的稳定性；第三，反应动力学必须足够快以便检测到光子。（2）共反应剂电化学发（Coreactant ECL）光机理共反应物ECL通常是通过在电极上

49、施加电势而产生的，发光团可以沉积在电极上，也可以在溶液中共同反应。当电势(正负)作用在电极上时，发光团和共反应物都会发生氧化或还原，伴随着自由基的形成和二酸根间态的形成。然后，中间态随着高活性氧化或还原物种的形成而分解，并与氧化或还原发光团相互作用，从而产生激发态和随后的ECL发射。电化学发光系统中最常见的共反应试剂非草酸根离子（C2O4 2-）和三丙胺（TPrA）莫属。草酸（C2O4 2-）体系是Bard小组1977年在文献中第一次报道的一个共反应物ECL系统48，也是“氧化还原”ECL的经典例子。它在水溶液中经过电化学氧化，生成一种强还原性的中间体 CO2 ，其反应机理如下：Rubpy3

50、2+-eRubpy3 3+（1-13）Rubpy3 3+C2O4 2-Rubpy3 2+C2O4 （1-14）C2O4 CO2 +CO2（1-15）Rubpy3 3+CO2 -Rubpy3 2+*+CO2（1-16）Rubpy3 2+CO2 Rubpy3+CO2（1-17）Rubpy3 2+Rubpy3 +Rubpy3 2+*+Rubpy3 2+（1-18）Rubpy3 2+*Rubpy3 2+h（1-19）还原-氧化型共反应剂中最常见的有过硫酸根离子（S2O82-）、C2O42-和TPrA，其中共反应剂S2O82-和C2O42-主要作用于阴极电化学发光共反应体系，其自身被还原产生SO4-，进

51、而SO4-与体系中的发光试剂反应形成激发态分子，以此过程往复循环产生发光现象，如K2S2O8与发光试剂Ag NCs的ECL的反应50。近年来，纳米材料作为ECL活性物种的应用促进了ECL在生物分析应用中的快速发展。由于纳米材料（NMs），主要是金属纳米团簇（MNCs）因其独特物理和化学性质越来越受到人们的关注。Ag NCs和Au NCs49,50具有亚纳米核大小团簇在光电子学、生化传感和电催化等领域有着广阔的应用前景。因此，人们做出了巨大的努力来研究它们在ECL中的应用。1.4 贵金属纳米簇简介一般来说，贵金属纳米团簇（Noble metal naonoclusters，NMCs)被定义为直径

52、小于2 nm的粒子（不包括配体壳）或150个原子的金属核。确切地讲，它是一类具有波长选择性等离子体吸收共振、电导率和催化活性等性能的高功能分子聚集体。主要由几个到几十个的Au，Ag，Pt等贵金属的原子组成，核团簇的直径通常小于2 nm，其大小和性质介于单原子和纳米粒子之间。与半导体类似，它产生特定的能级分离，并在特定波长的光发射荧光。与有机荧光染料、半导体量子点、聚合物纳米粒子等荧光纳米探针相比，贵金属纳米团簇由于其独特的电子结构和物理化学性质，在纳米材料的研究中备受关注，被广泛应用于纳米分析的各大领域（如生物标志物、生物化学传感器、光学和单分子成像以及细胞标记研究等）52，因此，其已成为颇有

53、应用前景的发光探针。因为贵金属纳米簇，如Ag NCs和Au NCs具有易制备、水溶性、低毒、增强催化、发光稳定等特点50,51，所以使得Ag NCs和Au NCs成为ECL研究和构建传感器及光学器件的理想材料。因此，NMCs的合成和适用性引起了人们的广泛兴趣。它是一种值得关注的ECL发光材料。目前已报道了多种贵金属纳米团簇的合成方法。例如，金、银等纳米团簇具有良好的生物相容性、极小的尺寸（2 nm）和优异的物理化学性质，特别是其强烈的发光性。显而易见，贵金属材料的尺寸对其性能和性能的影响是巨大的。回顾过去的十多年，具有可控尺寸、形貌、组成或结构的功能化贵金属纳米粒子（NMNs）已成为现代生物分

54、析化学发展的主要动力。近几年，一些双金属合金NCs出现了35，被确定为具有双组分材料的综合性能，并产生了独特的新的电子和光学性能和功能。金-银合金纳米团簇（AuAg NCs）之所以有趣，是因为银和金的晶格常数（或原子尺寸）几乎相同，因此这两种贵金属可以按不同比例混合，从而在相似的价电子特征下53引起明显的电子结构扰动。在双金属NCs协同响应的启发下，本文研究了AuAg NCs的ECL行为，研制了一种新型双检测生物胺的固态ECL传感器。1.4.1 贵金属纳米团簇的合成贵金属纳米团簇的制备方法包括物理、化学及物理化学结合法。在这些合成方法中，由于物理方法制备的团簇在没有合适的稳定剂的情况下容易聚集

55、，产物一般粒径偏大、颗粒大小不均且稳定性差，从而导致其结构和性能发生了变化56。因此需要合适的稳定剂作为团簇的保护剂和稳定剂，设计具有精确控制粒径和结构的合成技术对于克服这些障碍是极为有效的。目前的研究中较为常用的为化学方法,主要包括单分子层保护法（Monolayer-protected nanoclusters，MPCs）和模板法54。尤其以MPCs（如硫醇）或模板（如磷酸盐）法合成的MNCs，具有较强稳定性、特定和均匀的纳米结构。1.4.1.1 化学合成方法化学合成法最主要是单分子层保护法（MPCs）和模板合成法。采用单分子层保护法，磷化氢57、十二烷基磺酸钠（SDS）58、小分子硫醇化合

56、物59及炔基60等可用于作为贵金属纳米簇表面的单分子层。模板法制备MNCs时，需引入一些能够稳定或还原金属离子的聚合物、蛋白质或核酸等具有特殊功能的物质作为反应模板。否则，很容易产生积累聚集61,62。树枝状大分子比如聚酰胺-胺型树枝状高分子（Polyamidoamine，PAMAM）63、高分子聚合物如超支化聚乙烯亚胺（hPEI）64、寡核苷酸DNA64以及蛋白65和自主设计的多肽等均可以作为模板。（1）单分子层保护法单分子层保护法（MPCs）是在单层分子表面组装修饰形成功能性纳米团簇。通过以一定官能团的小分子为保护基，在团簇表面形成保护层，从而形成结构稳定的纳米团簇。该方法赋予团簇独特性质

57、与功能。保护分子一般是硫醇、胺66和磷化氢，它们分别通过Au-S、Au-N和Au-P键与纳米团簇表面结合。如，Schiffrin等67首次以硫醇类化合物合成并报道了一种疏水性AuMPCs。该方法具有操作简单、副产物少、可控性强、不要求模板，而且以硫醇类、胺类作为保护层时，能够使合成的MNCs结构稳定且表面带电荷，从而增强了其水溶性。（2）模板法模板法是一种以特定材料为模型合成具有特殊立体结构与功能的贵金属纳米团簇的最常用方法。模板法主要基于高分子聚合物和生物大分子等。模板分子可以给团簇提供一个预生长空间，使团簇的合成更容易，大小和形状亦更加容易控制。聚合物是制备贵金属纳米团簇的第一个模板。Ga

58、ponik等人68首次报道了可作为防止Ag NCs聚合的保护基团是聚磷酸盐（polyphosphate）。此后，学者们开始寻找更多可用于制备贵金属纳米团簇的聚合物，陆续发现了聚苯胺（polyaniline，PANI）和聚胺类树状大分子等。虽然这些聚合物可以有效地防止贵金属纳米团簇的聚集，但是由于模板的制备方法复杂且耗时，导致很难形成贵金属纳米团簇。近几年，研究人员发现蛋白质、核酸等生物大分子也可以作为贵金属纳米团簇合成的模板。例如，Durgada等人69合成了一种表面附着顺磁性纳米粒子的牛血清白蛋白（BSA）包覆的荧光金纳米团簇。Zhou等70以谷胱甘肽（GSH）为保护剂合成GSH-Ag NC

59、s。这种多肽作为模板合成的NMNs主要有一些其它方法无法满足的条件，主要包括温和的反应条件、赋予材料高特异性和多功能化（如谷胱甘肽）71、可调节生物分子的结构和组成实现生物矿化过程。因此，本研究选用GSH为模板合成了一种具有强荧光性的新型GSH-AuAg NCs，并且表现出优异的ECL性能。由于氨基酸的还原强度和与金的良好结合的相互作用，可以在纳米粒子的合成中扮演关键角色。谷胱甘肽（GSH）是一种天然三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，被广泛应用于荧光Au NCs和Ag NCs的合成。在我们的工作中，我们选用了一种以L-谷胱甘肽（L-GSH）为稳定剂，通过两步合成高水溶性的金银纳米团簇（Au

60、Ag NCs），发现所合成的AuAg NCs具有较强的阴极与阳极ECL信号。1.4.1.2 物理化学综合合成方法（1）超声化学合成法超声化学合成法是声学和化学相结合的产物。该方法具有控制和加速化学反应速率并提高化学产率72的作用归因于其兼具声学和化学特性。尤其是均匀尺寸和高纯度的纳米特征使该方法在金属纳米团簇的制备中备受瞩目73。例如，朱俊杰等74合成了两种高水溶性近红外发射荧光的Au NCs和具有黄色荧光的AuAg NCs，与水热法合成的NMNs相比，该方法性质更佳。Liu 75等用超声化学法合成了Ag NCs，尽管与本文合成的AuAg NCs性质研究相似，均具有ECL特性，但由于AuAg

61、NCs具有Au NCs和Ag NCs的协同效应，因此，本研究中AuAg NCs具有更高的ECL强度及荧光性质，并表现出更广泛的应用价值。（2）微波辅助化学合成法微波辅助化学合成素有“绿色”合成之名，正是因其对环境几乎没有任何影响。自1986年以来，微波辐射被报道为加速化学反应的一种有用的热源76。Liu等人77选用微波辅助法以谷胱甘肽作为纳米团簇的稳定剂和还原剂，反应几分钟就能制备得到功能性的L-GSH-Ag NCs。Lu等78也使用该方法合成了一种糖类聚合物功能化的Ag NCs。Yan等79首次报道并合成具有红色发射的BSA稳定和HSA保护的金纳米团簇。由于微波能量的过热和非热效应，该方法简

62、便快捷，反应时间可从几十小时缩短到几分钟。综上，贵金属纳米团簇的合成途径较多，受应用研究要求采用不同的合成方法赋予这些纳米团簇不同特点，见于表1-3。表1-3 不同合成方法的优劣比较。Table 1-3 Comparison of the advantages and disadvantages of different synthesis methods.合成方法类型特点物理合成惰性气体蒸发冷凝法55、辐射诱导法和光诱导还原法合成产物一般粒径偏大、颗粒大小不均且稳定性差化学合成单分子层保护法和模板法溶解性高、结构稳定、操作简单、副产物少及大小可控，但具有复杂、耗时物理化学合成超声化学合成与微波辅助化学合成法合快速、均匀、纯度高低毒、水溶性高1.4.2 贵金属纳米簇的特点与性质贵金属纳米团簇长期以来一直是研究热点，原因如表1-4所示：表1-4 贵金属纳米簇主要的特点与性质。Table 1-4 Main characteristics and properties of noble metal nanoclusters.特点性质元素生物毒