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1、仙鹿健骨汤含药血清对成骨细胞增殖和ALP阻碍的实验研究吴剑静王靖吴云刚沈权【摘要】目的观看仙鹿健骨汤含药血清对大鼠成骨细胞增殖 和成骨细胞ALP的阻碍。方式取12周龄Wister大鼠40只，随机 分为A、B、C、D、E、F六组，每组8只，分为仙鹿健骨汤低、中、高 剂量组（A、B、C组），阳性对照组（D组）、模型组（E组）及空白对照组 （F组），制备羽化鹿健骨汤含药血清备用。成骨细胞成立采纳新生SD 乳鼠5只（24h内颅盖骨）进行体外细胞传代培育。观看仙鹿健骨汤含 药血清对体外培育的新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化情形。结果B、 C、D、F组间比较无显著性不同，与E组比较细胞增殖分化与ALP阻碍
2、具有显著性不同（P<或P<。结论仙鹿健骨汤含药血清能增进 大鼠初期成骨细胞的增殖与分化。【关键词】骨质疏松症仙鹿健骨汤成骨细胞碱性磷酸酶大鼠为了探讨骨质疏松防治成效，咱们对自主开发的中药制剂仙鹿健 骨汤进行了临床和实验的系列研究，通过本实验来观看利用仙鹿健骨 汤含药血清对体外培育成骨细胞的增殖及其ALP的阻碍。1材料与方式实验动物12周龄的雌性Wistar大鼠48只,体重为200土 20g,新生大鼠4只，由浙江中医药大学实验动物中心提供。实验药品仙鹿健骨汤：仙灵脾、鹿角胶、骨碎补、杜仲、黄 芭、白术、丹参、当归。药物煎剂由温州医学院附属第一医院中药房 提供，水煎浓缩后含别离含生药m
3、l、lg/ml、2g/mlo a D3：以色列 梯瓦制药工业生产，批号（95）卫药准字J 10号，水溶液浓度为U g/mlo氯氨酮：上海第一生化药业生产，批号国药准字H。实验方式去势大鼠造模取12周龄的雌性Wistar大鼠48只，体重约 200g,取其中40只，腹腔注射成巴比妥钠（3 Ug/100g）麻醉条件下, 打开大鼠腹腔去除双侧卵巢，逐层缝合，随机分成5组。其余大鼠8 只为空白组，共6组，每组8只：仙鹿健骨汤高、中、低剂量组（I、 II、HI组）、a D3对照组（IV）、模型组（V）、空白组（VI）。血清制备各组天天均以10ml/kg,别离结予仙鹿健骨汤水 提液（I、II、HI组）、a
4、D3水溶液（IV）及生理盐水灌胃（V组和VI组），1次/d,持续10d,动物处死前lh再灌胃1次，动物给予氯氨酮麻醉，右心室抽血,搜集到的血液，4静置4h, 3000r/min离心30min,搜集血清,56c水溶灭活补体。-20保留，血清保留时刻不 超过3周。利用前用培育基稀释，过滤膜除菌。新生大鼠颅骨成骨细胞制备及培育取新生大鼠（24h内）， 无菌取颅骨，剔除黏附的结缔组织和血管，剪碎约IX 1丽3,加含%的 I型胶原酶和的透明质酸酶的消化酶消化，消化5个循环，每次 20min,其间不时摇动,取3、4、5次消化的细胞悬液，lOOOr/min离 心lOmin弃上清，沉淀的细胞用10%胎牛血清（
5、FCS）DMEM培育液重悬, 吹打均匀后，接种到培育瓶中，培育瓶置于37, 5%CO2孵箱孵育， 24h换液，待细胞60%70%贴壁后，胰酶消化，本实验所用细胞均为 原代培育。不同稀释比的血清对成骨细胞增殖的阻碍按细胞密度IX 105个/ml力口入96孔板，每孔100 ul,24h后换5%FCS DMEM培育基, 每孔90ulo IVI组同时别离加入按1 ： 一、1 ： 3、1 ： 7稀释比的 含药血清10 u 1,使其最终稀释比为1 ： 20、1 ： 40、1 ： 80,每种浓度 重复4孔，继续培育72h,实验终止前4h加20 的四哩氮盐（MTT） （5mg/ml）,继续在37, 5%CO2
6、条件下孵育,实验终止后,吸去培育 液加甲喷溶解液振摇15min,静置后，酶标仪检测其吸光度，在波长 570nm比色。不同稀释比的血清对成骨细胞ALP的阻碍成骨细胞接种密度为IX 105个/ml加入96孔板，细胞A1A12行为空白调零，每孔100 UK加药方式同前，细胞加药后培育72h,培育终止时去除培育液，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3遍，力口曲拉通（Triton） X 100 200 H 1 M 12h,吹打Imin,取50 U 1细胞裂解液转移至另一 96孑L 板，用PBS液作空白调零。各孔均加碱性磷酸酶检测试剂盒中新鲜配 制的底物100 口1, 37孵箱孵育30min,加的NaOH终止反
7、映。酶标仪 检测其吸光度，在波长405nm比色。统计学方式实验数据采纳统计软件包进行分析。实验数据 以均值土标准差表示,进行One WayANOVA分析。 2结果仙鹿健骨汤对细胞增殖的阻碍见表lo成骨细胞的活性各 医治组与模型组比较，空白组、阿法D3组和仙鹿健骨汤在稀释比为ml、 ml时有显著提高（P<或P<）,仙鹿健骨汤的低浓度组,与模型组 比较无统计学意义,提示成骨细胞的活性未见明显增高，而中剂量组比 低剂量组仙鹿健骨汤能更有效地增进成骨细胞的活性（P<）。仙鹿健骨汤对细胞ALP活性的阻碍见表lo不同浓度仙鹿 健骨汤组、空白组、阿法D3组与模型对照组比较，不同均有统计学意
8、 义（P<或P<,提示仙鹿健骨汤和阿法D3都可增进成骨细胞ALP 活性提高，但组间比较不同无统计学意义。3讨论成骨细胞和破骨细胞是骨形成与骨重建进程中两个功能相反 却又相互依存的细胞，成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收二者间 维持动态平稳是骨活动维持正常状态的基础。成骨细胞数量不足或活 力低下,不能有效地填充因破骨细胞骨吸收而形成的空腔,久之便造成 骨质疏松:1L因此防治骨质疏松症的关键之一，是提高成骨细胞的 增殖能力和分化水平，而增进成骨细胞功能的中药复方是目前防治骨 质疏松症的要紧途径之一。表1不同浓度仙鹿健骨汤对细胞增殖和ALP活性阻碍的比较 （略）与模型组比较，仙鹿健骨汤是
9、狄任农主任连年来临床用于医治0P的体会方。 方中以仙灵脾、鹿角胶为君药温肾壮阳；骨碎补、仙茅补肝肾强筋骨, 以助增强补肾之功；黄芭、白术益气健脾，以养后天；仙鹤草、当归 养血活血。诸药合用共收补肾健脾活血之功，使肾精得充，骨筋濡养 有渠。本实验结果说明去势大鼠成骨细胞增殖率较正常大鼠明显降低, 而中高浓度的仙鹿健骨汤可增进成骨细胞的增殖，但不存在成骨细胞 增殖与药物剂量呈比例关系。碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质, 特异性高,被以为是细胞外基质成熟的初期标志2,当做骨细胞活动 增强时ALP活性升高，实验发觉去势大鼠成骨细胞ALP的分泌能力明 显降低，仙鹿健骨汤含药血清能增进成骨细胞ALP的分泌，提高ALP 活性，从细胞因子水平上说明了其医治0P的可能机理。【参考文献】1王洪复，金蔚芳，高建军.骨质疏松症防治药物的体 外细胞药效评判J.中国骨质疏松杂志，1999,5(2) :5862.2 Bruder SP , Jaiswal N , Ricalton NS , et stem cellsin osteobiology and applied bone regeneration j . Clin Orthop, 1998,355(3) : 247.
仙鹿健骨汤含药血清对成骨细胞增殖和ALP阻碍的实验研究
