以Survivin为靶点的结直肠癌治疗研究进展

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1、以Survivin为靶点的结直肠癌治疗研究进展 摘要 Survivin是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的成员，可调控细胞凋亡和细胞分裂。Survivin在绝大多数终末分化的正常成年细胞中检测不到，但在众多种类的肿瘤细胞中异常表达。近期研究发现了新的Survivin剪切异构体，不同的剪切异构体可能在结直肠癌的发生过程中起着不同的作用。一系列调控Survivin表达的实验，进一步阐明了Survivin在细胞凋亡过程中所起的作用，也证明了以Survivin为靶点的结直肠癌治疗的安全性、可行性和有效性。 关键词 Survivin；结直肠肿瘤，细胞凋亡；治疗 结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。据美

2、国癌症协会估计，2006年仅在美国分别有106680例和41930例结肠癌和直肠癌新发病例，我国结直肠癌的发病率亦呈逐年升高的趋势。Survivin在肿瘤组织和正常组织之间的差异性表达及其抗凋亡的功能使其成为结直肠癌靶向治疗的理想靶点。 1 Survivin及其剪切异构体的特点 Survivin于1997年由Altieri等利用效应细胞蛋白酶受体1（effector cell protease receptor 1，EPR-1）的cDNA在人类基因组文库中杂交筛选分离所获得的一种新的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptotic protein，IAP）。Survivin基因定位于

3、染色体17q25，全长14.7kb，其编码链有426个核苷酸开放阅读框架，与EPR-1互补。分子量为16.5kD的Survivin蛋白含有142氨基酸残基，结构与同族的IAP不同，只有一个杆状病毒IAP重复（baeuloviral IAP repeat，BIR）结构域，羧基端的环指结构也被一个长螺旋所取代。正常情况下Survivin仅在肠黏膜隐窝的基底部表达，以保证肠道细胞的更新，维持稳态，但在绝大多数终末分化的正常成年细胞内不表达。多数肿瘤组织中会有Survivin异常表达，且与肿瘤的发生发展及预后有关。 Survivin基因含有4个外显子（E1、E2、E3和E4）、3个内含子以及3个隐藏外

4、显子（2、2b和3b）。Survivin的mRNA前体经过不同的剪切，除Survivin外，还会产生Survivin-Ex3、Survivin-2B、Survivin-3B1、Survivin-224种剪切异构体。翻译出的蛋白也因而具备不同的结构和功能，Survivin和Survivin-3B具备完整的BIR结构域，而Survivin-Ex3和Survivin-2的BIR结构域则被 截短，Survivin-2B的BIR结构则被隐藏外显子2b编码的肽段插入而发生断裂。 不同的剪切异构体似乎有独特的亚细胞定位和功能3。其中Survivin-2B抗凋亡功能显著下降，呈斑点状分布于细胞质中，Noton

5、等4在构建表达Survivin-2B-GFP细胞系时遇到困难，说明Survivin-2B的表达可能有细胞毒性。强制表达Survivin-2B会诱导癌细胞发生凋亡已有报道5。也有研究证实Survivin-2B与良好预后有相关性，在、期结直肠癌中的表达低于、期6。这些证据说明Survivin-2B在结直肠癌中起负调节作用，故而有学者认为Survivin-2B是一种天然的Survivin拮抗剂，具有保护作用。Survivin-Ex3保留抗凋亡特性，主要定位于细胞核内，仅很少一部分位于线粒体内，胞浆内则无表达7。Taubert等构建的多变量Cox比例风险回归模型表明，Survivin-Ex3过度表达的

6、肿瘤患者死亡风险会上升7.3倍8。两种新发现的剪切异构体尚有待进一步的研究，但均与凋亡有密切关系。不同剪切异构体对结直肠癌的差异影响尚需深入研究。 值得注意的是，在期结直肠癌病人中，不表达Survivin的患者5年生存率为94，与期患者没有区别，且对辅助治疗反应佳；表达Survivin的患者5年生存率仅为52，接近期患者，对辅助治疗也不敏感9。这有助于在临床上区分期结直肠癌病人，以决定是否使用辅助治疗，从而提高患者的生存期。 2 Survivin与细胞凋亡 Survivin是一种同时具有调控细胞凋亡和细胞增殖双重功能的调控子10。本文着重讨论Survivin的抑制凋亡功能与结直肠癌靶向治疗的关

7、系。 Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl-2家族成员。越来越多的证据表明，Survivin同时调控着caspase依赖的和非caspase依赖的凋亡途径。Survivin阳性的正常成年组织的线粒体中不含Survivin，但众多种类的癌细胞的线粒体中存在一个Survivin池，在细胞凋亡信号的刺激下，线粒体内的Survivin迅速释放入胞浆，以同源二聚体的形式与caspase-3或caspase-7形成稳定结合，阻止caspase激活，使二者的蛋白切割作用失效，进而抑制caspase-9介导的细胞凋亡11。运用泛caspase抑制剂只能部分降低Su

8、rvivin的抗凋亡能力，证实Survivin在非caspase依赖的凋亡途径中发挥调控作用12。 Survivin还存在胞质池和核内池，免疫组化方法研究过程中观察到某些抗体只能识别二者之一，而部分抗体可同时识别两者，这两个Survivin池各自的作用及其调控机制值得进一步探讨。有报道称结直肠癌病人如有Survivin在胞质内表达，则具有保护作用，相对危险度为0.3513。Survivin的亚细胞分布若能应用于预后评分，辅助临床医师对结直肠癌病人进行分类，则有利于实现个性化治疗。 3 Survivin靶向治疗结直肠癌 目前针对Survivin靶点的肿瘤治疗有4类3：（1）抑制Survivin的

9、表达，包括运用反义寡核苷酸、反义表达载体、RNAi、核酶、抗癌药物等；（2）抑制Survivin的功能，包括应用显性失活突变体、药物抑制剂、肽模拟物等；（3）应用Survivin的cDNA、RNA、蛋白质或肽段的免疫治疗；（4）应用Survivin启动子于肿瘤特异性细胞毒性基因。 3.1 抑制Survivin的表达 反义包括反向表达载体和人工合成反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASON），后者更适用于临床应用。Penuelas等14用21-mer ASON作用于结直肠癌细胞，能够提高其对化疗药物（甲氨蝶呤）的敏感度。siRNA具有相对于ASON有更强的效力和

10、抗降解能力，已成为近几年的主流靶基因沉默手段。运用siRNA下调Survivin的表达，可以促进直肠癌细胞DNA双链的断裂，终而表现为病人对放疗的敏感性提高，说明Survivin可以充当预后因子，用于判断病人对放疗的反应度15。基于Survivin在肿瘤的新生血管内皮细胞中也呈现过度表达的事实，Coma等16同时运用ASON和siRNA于血管内皮细胞，发现Survivin在mRNA和蛋白水平均下调，不仅凋亡细胞上升4倍，内皮细胞的生长被强烈抑制，且内皮细胞的迁移能力被抑制并有剂量依赖效应，内皮细胞的乳头状腔管形成能力也下降了。该实验亦证实，siRNA在30100nM水平上即可达到ASON在80

11、01000nM水平时才能达到的抑制效果，不难得出siRNA的效力更强的结论。寻找最佳靶片断是这两种方法的成功关键，其方法学仍在进一步讨论之中。EPR-1是天然的反义Survivin，诱导其在人类结肠癌细胞系的表达，能下调Survivin，导致了癌细胞的增殖能力下降，凋亡增多，且能提高对抗癌药物的敏感度17，这种方法可以克服反义寡核苷酸基因治疗存在的特异性差、基因传递不完全的缺点，具有良好应用前景。 核酶是具有特异核酸降解能力的RNA小分子，某些锤头酶可以特异性地降解Survivin的mRNA，但此法主要应用于实验室，距临床应用还有很大距离。 非甾体抗炎药Sulindac能持续抑制Survivi

12、n的mRNA和蛋白水平上的表达，对结直肠癌有抑制能力和预防作用18，具体机制可能是上调Wnt通路的APC蛋白及降解catenin，前者可以直接抑制Survivin的表达，后者的下调会减少T细胞因子(T cell factor，Tcf)的激活，转录激活子catenin/Tcf复合体的靶基因Survivin也随之下调。 进行小分子化合物的筛选，寻找具有良好治疗效果的物质，是一条不容忽视的有效途径。ICG-001在体内和体外实验中均可特异地下调catenin/Tcf的靶基因，强烈抑制结直肠癌细胞中Survivin的表达，诱发凋亡19。能够抑制Ras信号通路的LY294002，同样通过抑制Surviv

13、in诱发大规模的细胞凋亡20，提示Ras通路对Survivin的研究价值。 3.2 抑制Survivin的功能 有丝分裂起始蛋白cdc2对Survivin的第34位苏氨酸（T34）磷酸化后，后者才能发挥其抗凋亡的功能，应用药物抑制剂（purvalanol A）、基因修饰或分子靶向攻击等抑制cdc2活性的手段均能导致癌细胞的大规模凋亡。周期素依赖激酶抑制剂flavopiridol能够抑制p34cdc2，从而阻断Survivin的T34磷酸化，进而诱导癌细胞凋亡21；多柔比星能上调Survivin-2B，同时下调Survivin和Survivin-Ex3，与flavopiridol的作用有协同效应

14、，可诱导细胞凋亡并抑制嫁接癌的生长。化疗药奥沙利铂可以显著抑制结直肠癌细胞Survivin的表达，提高癌细胞对紫杉醇的反应，很可能是奥沙利铂抑制了cdc2的功能。但紫杉醇和奥沙利铂的应用顺序对疗效有影响，先用紫杉醇或二者同时应用均表现为协同效应；若先用奥沙利铂则表现出明显的拮抗作用，具体机制不明22。 显性失活突变体主要有两种，一种是针对Survivin被cdc2磷酸化的位点的SurvivinT34A（第34位苏氨酸突变为丙氨酸）；另一种是BIR结构发生断裂的SurvivinC84A（第84位半胱氨酸突变为丙氨酸）。显性失活突变体虽可诱导结直肠癌细胞自发凋亡，抑制体内肿瘤生长，也能提高紫杉醇诱

15、导的凋亡，但在临床应用中尚存在困难23。 运用肽模拟物shepherdin24，以Hsp90和Survivin的结合点为靶点，能诱导强烈的凋亡，同时不影响正常细胞的成活力，且能抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，未见明显毒性。 3.3 针对Survivin的免疫治疗 Casati等25选择的一段Survivin十肽具有很强的HLAA2结合能力，应用于结直肠癌病人后，能在其外周血中检测到特异的CD8+T细胞和CD4+T细胞，是一种很有价值的肿瘤相关抗原（tumorassociated antigen，TAA）。此靶点十分理想，因Survivin在癌细胞以外的正常组织中沉默，且与病程进展无关。另有报道在很多肿

16、瘤患者的外周血中都有Survivin-2B80-88特异的细胞毒性T细胞，很有希望成为HLAA24+肿瘤患者的强效肿瘤疫苗26。已进行的期临床试验证实这种疫苗可以降低结直肠癌患者的血清肿瘤标志物CEA、CA19-9或停止上升，未观察到严重不良事件，可证实其安全性27。确定最有效的内生性蛋白酶体加工修饰出的Survivin肽段是靶向Survivin的免疫治疗亟待解决的问题。但是有实验发现Survivin在结直肠癌细胞中与Fas配体的表达有相关关系，且结直肠癌细胞能通过表达功能性Fas配体主动杀伤T细胞28，因此抑制Survivin的表达可部分解决结直肠癌细胞主动逃避免疫监视的问题。不同起源的Su

17、rvivin阳性肿瘤似乎可以处理和呈递出同样类型的Survivin衍生肽段抗原决定簇29，这也为从其他肿瘤中制备针对结直肠癌的suvivin衍生疫苗提供了可能性。 3.4 Survivin启动子应用 有实验用Survivin启动子促进人分泌型碱性磷酸酶报告基因的表达，发现Survivin启动子的活性在癌细胞中比在正常细胞中强，Survivin启动子结构能够促进具备自身催化能力的Revcaspase 3基因表达，并特异性地杀伤癌细胞，对正常细胞没有影响29。由于启动子的特异性不高，往往有众多靶基因，所以靶向性不够理想，存在影响其他基因正常表达的风险。 4 Survivin靶点在结直肠癌治疗方面的

18、展望 由于Survivin在正常细胞中也发挥生理作用，所以靶向Survivin治疗结直肠癌的安全问题一直为大家所关注。迄今为止，尚无严重不良事件的报道，且Survivin在结直肠癌细胞中定位呈高度特异性，因而有理由相信，以Survivin为靶点的结直肠癌治疗几乎不会对正常结直肠细胞产生毒性。需要指出的是，尼古丁能上调Survivin的表达，进而抑制化疗药物诱导的癌细胞凋亡30，所以在临床治疗结直肠癌时，需注意尽可能排除患者生活习惯中有可能影响疗效的因素。 参考文献 1 Badran A，Yoshida A，Ishikawa K，et al.Identification of a novel s

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