微生物实验三(1

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1、 主讲：马玉龙主讲：马玉龙 Tel:15903060813 Tel:15903060813 Email: Email:新乡医学院微生物学教研室：新乡医学院微生物学教研室：3029130 科教科：科教科：3029945注意！注意！v 本次实验部分涉及生物危险本次实验部分涉及生物危险( (粪便粪便中致病微生物中致病微生物) )，请谨慎操作，请谨慎操作( (无菌操作无菌操作) )！病原菌的检验程序病原菌的检验程序增菌培养革兰染色分离培养接种琼脂斜面纯培养采集标本生化试验生化试验血清学试验血清学试验动物试验动物试验分析鉴定革兰染色观察菌落特征观察菌落特征v概念：用生化的方法来检测细菌对概念：用生化的方

2、法来检测细菌对各种基质的各种基质的代谢作用及代谢产物代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验。种生化试验称为细菌的生化反应试验。v意义：是意义：是鉴别细菌鉴别细菌的重要依据。的重要依据。1.细菌的生化反应细菌的生化反应生化反应生化反应碳水化合物碳水化合物代谢试验代谢试验各种酶类试验各种酶类试验抑菌试验抑菌试验糖发酵试验糖发酵试验甲基红试验甲基红试验V-P试验试验蛋白质和氨基蛋白质和氨基酸代谢试验酸代谢试验硫化氢试验硫化氢试验吲哚试验吲哚试验碳源和氮源碳源和氮源利用试验利用试验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验IMViC试验试验糖发酵试验糖发酵

3、试验v 原理原理 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂养基中加入指示剂溴甲酚紫溴甲酚紫（即（即B.C.PB.C.P指示剂，其指示剂，其pHpH在在5.25.2以下呈黄色，以下呈黄色，pHpH在在6.86.8以上呈紫色），经培养后根以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置养基中放入倒置杜氏小管杜氏小管观察。观察。1 1、确定细菌是否生长、确定细菌是否生长

4、2 2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+ +”表示。表示。3 3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用泡，用“”表示。表示。4 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“- -”表示。表示。 结果结果 方法方法 取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置倒立小管内无气泡，接种细菌后置3737温箱培养温箱培养18182424小时，观察结果。

5、小时，观察结果。 糖糖发发酵酵试试验验大肠杆菌 伤寒杆菌 副伤寒杆菌葡萄糖 +乳糖 - -硫化氢产生试验硫化氢产生试验 v原理原理 某些细菌能分解蛋白质中的某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸含硫氨基酸，如半胱氨酸、，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。v方法方法 分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌至两管双糖铁培养分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌至两管双糖铁培养基中。基中。37孵育孵育24小时后观察结果。小时后观察结果。结果结果 沿穿刺线部位呈黑褐色，

6、沿穿刺线部位呈黑褐色，表明有硫化氢产生，为阳性以表明有硫化氢产生，为阳性以“+ +”表示，表示， 不变色者为阴性，以不变色者为阴性，以“- -”表示。表示。 大肠杆菌：大肠杆菌：- - 伤寒杆菌：伤寒杆菌：+ +实验目的：实验目的： 熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程粪 便增菌培养（必要时） SS 培养基 双糖铁培养基 生化反应血清学鉴定肠道杆菌的鉴定程序已完成已完成革兰染色n大肠杆菌在大肠杆菌在SS平板上的菌落特点；平板上的菌落特点；n伤寒杆菌在伤寒杆菌在SS平板上的菌落特点；平板上的菌落特点；（1）观察）观察SS平板上菌落特点平板上菌落特点 SS平板平板大肠杆菌大肠杆

7、菌 粉红色粉红色大菌落大菌落痢疾杆菌痢疾杆菌 无色细小无色细小 半透明菌落半透明菌落伤寒杆菌伤寒杆菌 无色细小无色细小 半透明菌落半透明菌落（2） 双糖铁培养基接种双糖铁培养基接种n双糖铁培养基成分双糖铁培养基成分n含有乳糖和葡萄糖：产酸产气含有乳糖和葡萄糖：产酸产气n含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀硫化氢，可形成黑色沉淀n酚红指示剂：酚红指示剂： 酸：黄酸：黄 碱：红碱：红 各菌的生长特点各菌的生长特点1)1)大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色

8、并有气泡。是斜面及底层均呈黄色并有气泡。2)2) 沙门菌和志贺菌沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解，分解葡萄糖产的酸使培养基葡萄糖产的酸使培养基pHpH下降，酚红指示剂变黄，但下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有是培养基中的葡萄糖仅有0.1%0.1%，在斜面的酸性物质被，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。，而底层则为黄色。双糖铁培养基接种方法双糖铁培养基接种方法（穿穿刺刺+ +斜面斜面 ）双糖铁培养基上各菌的生长现象双

9、糖铁培养基上各菌的生长现象大肠杆菌大肠杆菌黄色有气泡黄色有气泡伤寒杆菌伤寒杆菌上红下黄中间有黑色沉淀上红下黄中间有黑色沉淀福氏痢疾杆菌福氏痢疾杆菌上红下黄上红下黄冲洗冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果（3）革兰染色方法与步骤）革兰染色方法与步骤 1、细菌涂片的制备、细菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2、染色、染色 初染（结晶紫）初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液）媒染（卢戈氏碘液） 脱色脱色（95%乙醇）乙醇） 复染（稀释石碳酸复红）复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸吸水纸吸干吸干 1min1min30s30s冲洗

10、冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗（4）伤寒杆菌玻片凝集试验v原理原理： 当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。v试剂与器材试剂与器材沙门氏菌属沙门氏菌属A AE E群多价群多价O O血清，血清，SSSS平板上菌落，平板上菌落，玻片、消毒缸、酒精灯，记号笔等。玻片、消毒缸、酒精灯，记号笔等。v方法方法 1. 1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用移液枪分别在两取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用移液枪分别在两边加沙门氏菌属边加沙门氏菌属A-EA-E群多价群多价O O血清血清8 8微升。微升。 2. 2.无菌操作下用接种环分别取少许无

11、菌操作下用接种环分别取少许SSSS平板上菌落（平板上菌落（黑色或无色菌黑色或无色菌落，以及粉红色大菌落落，以及粉红色大菌落）与血清混合成均匀乳状）与血清混合成均匀乳状( (注意：取菌量不注意：取菌量不宜过多，使悬液呈轻度乳浊即可宜过多，使悬液呈轻度乳浊即可) )。 3.3.轻轻摇动玻片，经轻轻摇动玻片，经1-2min1-2min后观察结果。后观察结果。v注意事项：注意事项：注意涂菌时，标明菌落，以免混淆产生错误结注意涂菌时，标明菌落，以免混淆产生错误结果。果。记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。器内，切勿任意放置或冲洗。n

12、结果观察结果观察液体变清，并有乳白色凝集块出现者为阳性。液体仍然混浊，无凝集块出现者为阴性。如待检菌与沙门氏菌属如待检菌与沙门氏菌属A-EA-E群多价群多价O O血清发生凝集，血清发生凝集，则该菌为沙门氏菌属。则该菌为沙门氏菌属。（5）结果判断）结果判断 v SS平板：菌落的形态，颜色；平板：菌落的形态，颜色；v 双糖铁培养基上生化特点；双糖铁培养基上生化特点；v 革兰染色：形态，排列，染色特点；革兰染色：形态，排列，染色特点； 玻片凝集试验结果玻片凝集试验结果 本次实验所做内容本次实验所做内容（穿刺（穿刺+ +斜面斜面 ）1.1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定掌握纸片扩散法药敏试验的

13、原理及结果判定2.2.了解药敏试验的操作方法和意义了解药敏试验的操作方法和意义v含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的的抑菌圈抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。药物的敏感程度。1.1.大肠杆菌菌液普通琼脂平板

14、大肠杆菌菌液普通琼脂平板2.2.含抗生素的滤纸片：含抗生素的滤纸片： 青霉素青霉素 氯霉素氯霉素 链霉素链霉素 庆大霉素庆大霉素1.标记分区2.密涂接种3.贴片4.培养5.结果观察 分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。v置置3737温箱，温箱， 倒置培养倒置培养18h-24h18h-24h青霉素链霉素庆大霉素氯霉素 五五、 结果结果 抑菌圈抑菌圈抑菌圈直径抑菌圈直径v抑菌圈直径15mm 高度敏感v抑菌圈直径10-15mm 中度敏感v抑菌圈直径10mm 低度敏感v无抑菌圈 不敏感或耐药1.接种时均匀密涂2.贴片时，用无菌镊子轻轻触压

15、药物纸片使之与培养基充分接触3.贴片后不能再更改纸片位置4.镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响5.整个贴片过程应在15min内完成一、实验目的：一、实验目的：1、掌握细菌涂片标本的制备、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握抗酸染色的原理和方法、掌握抗酸染色的原理和方法三三 抗酸染色抗酸染色v分枝杆菌的细胞壁内含有大量的分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分脂质，主要是分枝菌酸枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过一般不易着色，要经过加热和延长染色时间加热和延长染色时间来促来促使其

16、着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色抗酸染色。v齐齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为然为红色红色，而其他细菌及背景中的物质为，而其他细菌及背景中的物质为兰色兰色。三、实验材料：三、实验材料：细菌：细菌：卡介苗卡介苗 （Bacillus Calmette-Guer

17、in， BCG）染液：石炭酸复红液、染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美盐酸酒精、碱性美兰溶液兰溶液其它：接种环、酒精灯、载玻片等其它：接种环、酒精灯、载玻片等四、实验方法：四、实验方法：1、细菌涂片标本的制备、细菌涂片标本的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定2、染、染 色色1）初染：）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗待标本冷却后用水冲洗。2）脱色：）脱色： 3%盐酸酒精脱色301；用水冲洗。3）复染）复染：用碱性美兰溶液复染1；用水冲洗后用吸水纸

18、吸干。3、油镜观察油镜观察未染色未染色 初染后初染后 脱色后脱色后 复染后复染后初染初染脱色脱色复染复染镜检镜检五、实验结果：五、实验结果：结核杆菌呈红色结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。六、注意事项：六、注意事项：1、无菌操作、无菌操作2、涂片厚度要适中、涂片厚度要适中3、固定、固定4、冲洗、冲洗5、染色时间、染色时间6、初染加热的温度，勿沸腾、初染加热的温度，勿沸腾实验报告1. 肠道致病菌的分离，培养和鉴定2.抗酸染色一、目的一、目的二、原理二、原理三、材料三、材料四、方法四、方法五、五、结果（图）结果（图）六、意义六、意义七、注意事项七、注意事项下周实验内容v1.病毒的接种（小鼠和鸡胚）v2.真菌菌落的形态观察v3.考试