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1、ELISA 操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程（ 注意设置空白对照 , 阴性对照 ）:将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100,置37C,4h,或4c,24h;弃去孔中液体， （ 为避免蒸发, 板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中 ） 。2. PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。具体为 . 吸干或甩干孔内反应液； . 用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去） ；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干； . 重复操作涤3 次。3. 加入待检测样品 （ 建立合适的浓度梯度）:
2、检测时一般采用 1:50-1:400 的稀释度 , 应采用较大稀释体积进行, 一般保证样品吸取量20科l。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔1001,置于37 ,40-60min 。4. PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。5. 加入酶标抗体 :酶标抗体 : 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度， 37 ,30-60min 之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加 100科1。6. PBS 洗 3 次，每次 3 分钟。7. 加入底物液（ 现用现配 ）:TMB（四甲基联苯胺）使用液：TMB（10mg/5ml无水乙酉I） 0.5ml底物缓冲液（PH5.5）10
3、m10.75 %H2O2 32 ”，底物加入量每孔100“（TMB空白显色孔除外），置37c避光放置 20-25 分钟 。8. 终止反应 :每孔加入终止液 50 “（2M H2SQ）终止反应，此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。9. 结果判断 :可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深， 阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在 ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要 450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。 用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值 （P/N） 表示， 当 P/N 大于 2 时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的 2 倍， （ 数值的大小依具体检测要求而定） 。
ELISA操作步骤(双抗体夹心法)
