9第九章核酸类药物的分析

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1、第九章第九章 核酸类药物的分析核酸类药物的分析基本要求基本要求掌握：掌握：核酸的结构和分类；嘌呤类药物核酸的结构和分类；嘌呤类药物和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的原理原理熟悉：熟悉：核酸的理化性质；反义寡核苷酸核酸的理化性质；反义寡核苷酸药物鉴别、检查、含量测定的原理药物鉴别、检查、含量测定的原理第一节第一节 概述概述结构和分类结构和分类理化性质理化性质1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核细胞核，当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何一种有机物，并且一种有机物，并且含

2、有很强的酸性含有很强的酸性，故得名核酸。，故得名核酸。19091909年其组成被研究清楚，年其组成被研究清楚，19441944年生物功能初步澄年生物功能初步澄清，在清，在X X射线衍射技术支持下射线衍射技术支持下19531953年结构澄清。年结构澄清。核酸是脱氧核糖核酸（核酸是脱氧核糖核酸（DNADNA）与核糖核酸（）与核糖核酸（RNARNA）的）的通称通称。核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解一、结构和分类一、结构和分类核核 酸酸代表，对DNA而言为，对RNA而言为； 代表 代表磷酸碱基戊糖NNNNNHHNHNHOOOOHOHOHOHCH2POHOOO碱基连接（糖苷键

3、）碱基连接（糖苷键）键键（对（对DNA为为H）核糖(in RNA)2脱氧核糖(in DNA)核苷核苷DNA & RNA 类别类别DNARNA基本单位基本单位脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核苷酸核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸 鸟嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸碱基碱基腺嘌呤（腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（胞嘧啶（C) 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T) 腺嘌呤（腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（鸟嘌呤（G)

4、 胞嘧啶（胞嘧啶（C) 尿嘧啶（尿嘧啶（U） 五碳糖五碳糖脱氧核糖脱氧核糖 核糖核糖酸酸磷酸磷酸 磷酸磷酸 嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤。 嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶 都是基本碱基的化学修饰型。NNNNONH2H鸟嘌呤鸟嘌呤NNNNOH次黄嘌呤次黄嘌呤CH31-甲基次黄嘌呤甲基次黄嘌呤二、理化性质二、理化性质（一）两性性质：（一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性）磷酸基；碱基（通常：酸性） pHpH影响碱基间氢键稳定：影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.011.0DNA pH4.011.0（二）水解性：（二）水解性：微溶于水，不

5、溶于一般的有机溶剂微溶于水，不溶于一般的有机溶剂（三）（三）UVUV：max=260nm max=260nm 蛋白质蛋白质280nm280nm A A260260/A/A280 280 纯纯DNADNA1.81.8 纯纯RNARNA应达到应达到2.02.0 混有杂蛋白混有杂蛋白 比值降低比值降低（四）变性和复性（四）变性和复性1.1.变性：变性：在某些理化因素影响下，在某些理化因素影响下，DNADNA双螺旋区的双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋结氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋结构变成单链无规律的构变成单链无规律的“线团线团”，但不发生共价键，但不发生共价键的断裂，这过

6、程称之。的断裂，这过程称之。变性原因：高温（一般变性原因：高温（一般7575）、强氧化剂、强）、强氧化剂、强酸、碱、尿素等；酸、碱、尿素等；机理：机理：双链间氢键断开，成为两条单链（双链间氢键断开，成为两条单链（ DNADNA双双螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失）螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失）特征性特征性Tm-DNATm-DNA的变性温度的变性温度 829582952.复性复性一定条件下，去除变性因素后，核酸一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活恢复二级结构及生物活性的现象性的现象；通常使用；通常使用。（退火）。（退火）（五）颜色反应（五）颜色反应苔黑酚反应苔黑酚反应:R

7、NARNA中核糖中核糖+ +浓浓HClHCl（浓（浓H H2 2SOSO4 4）糠醛糠醛+ +苔黑酚苔黑酚深绿色化合物深绿色化合物（ max=670nm max=670nm ）二苯胺反应二苯胺反应:DNADNA中脱氧核糖中脱氧核糖+ +浓浓H H2 2SOSO4 4 5-5-羟基羟基-4-4-羰基戊醛羰基戊醛+ +二苯胺二苯胺蓝色蓝色化合物（化合物（ max=595nm max=595nm ）水解后磷酸：水解后磷酸：磷酸磷酸+钼酸钼酸磷钼酸磷钼酸+ +还原剂（维生素还原剂（维生素C C、氯化亚锡等）、氯化亚锡等） 钼钼蓝（蓝（ max=660nm max=660nm ）Fe3+脱水脱水第二节第

8、二节 嘌呤类核苷酸药物分析嘌呤类核苷酸药物分析l嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤）l戊糖戊糖l磷酸磷酸一、鉴别一、鉴别戊糖鉴别戊糖鉴别嘌呤鉴别嘌呤鉴别磷酸鉴别磷酸鉴别特征吸收光谱特征吸收光谱熔点测定熔点测定（一）戊糖的鉴别（一）戊糖的鉴别苔黑酚反应苔黑酚反应（地衣酚反应）（地衣酚反应）-凡核糖均有此反应凡核糖均有此反应试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂）现象：鲜绿色现象：鲜绿色二苯胺反应二苯胺反应 DNA试剂：浓硫酸，二苯胺试剂：浓硫酸，二苯胺现象：蓝色现象：蓝色与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖）与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖）现象

9、：玫瑰红色现象：玫瑰红色（二）嘌呤的鉴别（二）嘌呤的鉴别+氨制硝酸银氨制硝酸银白色白色红棕色（遇光）红棕色（遇光）（嘌呤碱基的特殊鉴别反应）（嘌呤碱基的特殊鉴别反应）（三）磷酸的鉴别（三）磷酸的鉴别有机磷有机磷无机磷无机磷+ +钼酸钼酸磷钼酸磷钼酸+ +还原剂还原剂钼蓝钼蓝（四）特征吸收光谱（四）特征吸收光谱lUV：嘌呤环，嘧啶环lIR（五）熔点测定（五）熔点测定二、检查二、检查一般检查一般检查酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度蛋白质检查蛋白质检查磺基水杨酸溶液磺基水杨酸溶液有关物质有关物质纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查纸色谱，薄层色

10、谱，电泳，荧光检查三、含量测定三、含量测定紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法现在国家已经批准的现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物嘌呤类核苷酸药物一般都用一般都用此法测定含量此法测定含量HPLC四、实例分析四、实例分析肌苷肌苷ATP（一）肌苷的质量分析（一）肌苷的质量分析1.结构：结构：C10H12N4O5 268.23本品为本品为9-D-9-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含C C1010H1H12 2N N4 4O O5 5应为应为98.098.0102.0102.0。2.性状：性状：本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦

11、。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐酸和氢氧化钠溶液中易溶。酸和氢氧化钠溶液中易溶。3.鉴别鉴别取取0.010.01供试品溶液适量供试品溶液适量, ,加等体积的加等体积的3,5-3,5-二二羟基甲苯溶液羟基甲苯溶液( (取取3 3，5-5-二羟基甲苯与三氯化铁二羟基甲苯与三氯化铁各各0.1g0.1g，加盐酸使成，加盐酸使成100ml)100ml)，混匀，在水浴中，混匀，在水浴中加热约加热约1010分钟，即显分钟，即显绿色。绿色。-苔黑酚反应苔黑酚反应取本品取本品1 1水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，即产生即产生白色胶

12、状白色胶状沉淀。沉淀。-嘌呤碱基嘌呤碱基 取含量测定项下的溶液取含量测定项下的溶液, ,照分光光度法测定，照分光光度法测定，在在248nm248nm的波长处有最大吸收，在的波长处有最大吸收，在222nm222nm的波长的波长处有最小吸收。处有最小吸收。色谱图色谱图IRIR4.4.检查检查溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率）溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率）取本品取本品0.5g0.5g，加水，加水50ml50ml使溶解，照分光光度法在使溶解，照分光光度法在430nm430nm的波长处测定透光率，不的波长处测定透光率，不得低于得低于98.098.0( (供注射用供注射用) )。干燥失重干燥失重取本品

13、，在取本品，在105105干燥至恒重，减失重量不得过干燥至恒重，减失重量不得过1.01.0炽灼残渣炽灼残渣不得过不得过0.10.1( (供注射用供注射用),),或不得过或不得过0.20.2( (供口服用供口服用重金属重金属取本品取本品1.0g1.0g，依法检查含重金属不得过百万分之十。，依法检查含重金属不得过百万分之十。 次黄嘌呤次黄嘌呤精密称取本品精密称取本品0.5g0.5g，置，置50ml50ml量瓶中量瓶中, , 加水溶解并加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶10l10l，点，点于于3 325cm25cm色谱滤纸上，照上行法，

14、以水为展开剂，展开约色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约20cm20cm处，取出晾干，置紫外光灯处，取出晾干，置紫外光灯(254nm)(254nm)下检视，不得出现杂下检视，不得出现杂质斑点。质斑点。 HPLC5.5.含量测定含量测定1 1）UVUV法：法：取本品，精密称定，加水制成每取本品，精密称定，加水制成每1ml1ml中约含中约含10g10g的溶液，照分光光度法在的溶液，照分光光度法在248nm248nm的波长处测定吸收度，按的波长处测定吸收度，按C C1010H H1212N N4 4O O5 5的的吸收系数（吸收系数（E E1 11cm1cm）为）为460460计算。计算。2）

15、HPLC6.6.作用与用途作用与用途辅酶类药。有改善机体代谢作辅酶类药。有改善机体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等。视神经萎缩等。7.7.用法与用量用法与用量口服，一次口服，一次0.20.20.6g0.6g一日一日0.60.61.8g1.8g8.8.贮藏贮藏遮光，密闭保存。遮光，密闭保存。9.9.制剂制剂(1)(1)肌苷口服溶液肌苷口服溶液(2)(2)肌苷片肌苷片(3)(3)肌肌苷注射液苷注射液 (4)(4)肌苷胶囊肌苷胶囊(5)(5)肌苷颗粒剂肌苷颗粒

16、剂（二）三磷酸腺苷二钠（二）三磷酸腺苷二钠（ATP）的质量分析）的质量分析 拼音名：拼音名：SanlinsuanxianganSanlinsuanxianganerna erna 英文名：英文名：Adenosine Disodium TriphosphateAdenosine Disodium Triphosphate C C1010H H1414N N5 5NaNa2 2O O1313P P3 3 551.15 551.151.1.结构：结构：本品为腺嘌呤核苷本品为腺嘌呤核苷-5-5- -三磷酸酯二钠盐三磷酸酯二钠盐三水化合物。按干燥品计算，含三水化合物。按干燥品计算，含C C1010H H

17、1414N N5 5NaNa2 2O O1313P P3 3不得少于不得少于90.090.0。2.2.性状：性状：本品为白色或类白色粉末或结晶块状本品为白色或类白色粉末或结晶块状物；无臭，味咸；有引湿性。物；无臭，味咸；有引湿性。 本品在水中易本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。 3.3.鉴别鉴别（1 1）取本品）取本品20mg,20mg,加稀硝酸加稀硝酸2ml2ml溶解后，加钼酸铵试液溶解后，加钼酸铵试液1ml1ml，加热，放冷，即析出黄色沉淀。，加热，放冷，即析出黄色沉淀。-磷酸盐磷酸盐（2 2）取本品约）取本品约10mg10mg，加盐酸溶液，加

18、盐酸溶液(12)5ml(12)5ml溶解后，溶解后，加加间苯三酚间苯三酚10mg10mg，混匀，置水浴中加热约，混匀，置水浴中加热约1 1分钟，即分钟，即显玫瑰红色。显玫瑰红色。-戊糖戊糖（3 3）苔黑酚反应）苔黑酚反应戊糖戊糖 （3 3）UVUV（4 4）IRIR（5 5）本品的水溶液显钠盐的鉴别反应）本品的水溶液显钠盐的鉴别反应4.4.检查检查酸度酸度溶液的澄清度与颜色溶液的澄清度与颜色蛋白质蛋白质取本品取本品20mg20mg，加水，加水2ml2ml溶解后，滴加溶解后，滴加3030磺基磺基水杨酸水杨酸溶液溶液0.5ml0.5ml，不得发生浑浊。，不得发生浑浊。有关物质有关物质水分水分氯化物

19、氯化物铁盐铁盐重金属重金属热原热原5.5.含量测定含量测定（1 1）总核苷酸：）总核苷酸：UVUV（2 2）三磷酸腺苷二钠的重量比：）三磷酸腺苷二钠的重量比：HPLCHPLC（3 3）色谱条件与系统适用性试验）色谱条件与系统适用性试验（4 4）测定法）测定法6.6.作用与用途作用与用途辅酶类药。用于进行性肌萎缩、辅酶类药。用于进行性肌萎缩、脑溢血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎脑溢血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎等。等。7.7.注意注意缓慢注射。心肌硬塞和脑溢血在发病缓慢注射。心肌硬塞和脑溢血在发病期患者慎用。期患者慎用。8.8.贮藏贮藏有阴凉干燥处密封保存。有效期年。有阴凉干燥处密封保

20、存。有效期年。9.9.制剂制剂(1)(1)三磷酸腺苷二钠注射液三磷酸腺苷二钠注射液(2)(2)注射注射用三磷酸腺苷二钠用三磷酸腺苷二钠 第三节第三节 嘧啶类核苷酸药物的分析嘧啶类核苷酸药物的分析一、鉴别一、鉴别 该类药物的化学组成和性质本与嘌呤类该类药物的化学组成和性质本与嘌呤类相似，唯一区别在于碱基的不同。相似，唯一区别在于碱基的不同。一元碱一元碱二、检查二、检查常规检查常规检查其他核苷酸：其他核苷酸：TLCTLC三、含量测定三、含量测定UVUV法法电位滴定法电位滴定法四、实例分析四、实例分析-氟尿嘧啶氟尿嘧啶1.1.通用名通用名: : 氟尿嘧啶氟尿嘧啶 化学名化学名: 5-: 5-氟氟-2

21、,4(1H,3H)-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮嘧啶二酮分子式分子式: C: C4 4H H3 3FNFN2 2O O2 2 分子量分子量: 130.08 : 130.08 熔熔 点点: 278-286: 278-286 水溶性水溶性: 12.2g/L 20: 12.2g/L 20含氟尿嘧啶（含氟尿嘧啶（C4H3FN202C4H3FN202）应为标示量的）应为标示量的93.0-107.0% 93.0-107.0% 2.2.性状：性状：白色或类白色结晶或结晶性粉末。白色或类白色结晶或结晶性粉末。在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中几乎不在水中略溶，乙醇中微溶，三氯甲烷中几乎不溶，在稀盐酸或氢氧化

22、钠溶液中溶解。溶，在稀盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。3.3.鉴别鉴别（1 1）+ +溴，溴褪色；溴，溴褪色；+ +氢氧化钡，紫色氢氧化钡，紫色（2 2）三三氧化铬的饱和硫酸溶液，均匀涂于管壁氧化铬的饱和硫酸溶液，均匀涂于管壁 本品，不能再均匀涂于管壁本品，不能再均匀涂于管壁（3 3）max=265nm min=232nm（4）IR4.4.检查：检查：氯化物氯化物硫酸盐硫酸盐含氟量含氟量干燥失重干燥失重重金属重金属5.5.含量测定：含量测定：取本品适量，加取本品适量，加0.1mol/L0.1mol/L盐盐酸溶液制成每酸溶液制成每1mL1mL中约含中约含10g10g的溶液，的溶液，照紫外照紫外- -可

23、见分光光度法，在可见分光光度法，在265nm265nm波长波长处，测定吸光度，按处，测定吸光度，按C C4 4H H3 3FNFN2 2O O2 2的吸收系的吸收系数（数（E E1%1%1cm1cm）为）为552552计算，即得。计算，即得。 用途：用途：本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代本品为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰核苷核，干扰DNADNA合成。对合成。对RNARNA的合成也有的合成也有一定的抑制作用。一定的抑制作用。 不良反应：不良反应：骨

24、髓抑制：主要为白细胞减少、血小板下降。骨髓抑制：主要为白细胞减少、血小板下降。 食欲不振、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹痛食欲不振、恶心、呕吐、口腔炎、胃炎、腹痛及腹泻等胃肠道反应。及腹泻等胃肠道反应。 注射局部有疼痛、静脉炎或动脉内膜炎。注射局部有疼痛、静脉炎或动脉内膜炎。 其他：常有脱发、红斑性皮炎、皮肤色素沉着其他：常有脱发、红斑性皮炎、皮肤色素沉着手足综合征及暂时性小脑运动失调，偶有影响手足综合征及暂时性小脑运动失调，偶有影响心脏功能心脏功能 注意事项：注意事项：用药期间应严格检查血象。避光置阴暗处保存，用药期间应严格检查血象。避光置阴暗处保存，温度不应低于温度不应低于1010，亦不宜超

25、过，亦不宜超过3535。治疗期。治疗期涂药范围有炎症，涂药范围有炎症， 停药后炎症消退。本品可引起严重的皮肤刺激，停药后炎症消退。本品可引起严重的皮肤刺激，尤其在日光下。尤其在日光下。 该药还可经皮损内注射给药用于角化棘皮病、该药还可经皮损内注射给药用于角化棘皮病、疣和汗孔角化病。其主要副作用为注射期间有疣和汗孔角化病。其主要副作用为注射期间有的烧感，继之有局部红斑、水肿甚至溃疡。的烧感，继之有局部红斑、水肿甚至溃疡。 第四节第四节 反义寡核苷酸药物分析反义寡核苷酸药物分析1.1.定义定义2.2.化学修饰：硫代修饰化学修饰：硫代修饰3.3.序列分析：化学测序法；质谱法序列分析：化学测序法；质谱法4.4.杂交性质杂交性质5.5.理化特性分析理化特性分析（鉴别：（鉴别：HPLCHPLC，CECE）（特殊杂质：失败序列；硫代不充分）（特殊杂质：失败序列；硫代不充分）6.6.生物活性测定生物活性测定