酶的生产与分离纯化课件

《酶的生产与分离纯化课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶的生产与分离纯化课件（106页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、酶的生产与分离纯化1第二章酶的生产与分离纯化第一节第一节 酶的发酵生产酶的发酵生产第二节第二节 酶的纯化酶的纯化第三节第三节 酶纯度的评价酶纯度的评价第四节第四节 酶的剂型与保存酶的剂型与保存 酶的生产与分离纯化第一节第一节 酶的发酵生产酶的发酵生产一、产酶菌株的获得一、产酶菌株的获得二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术酶的生产与分离纯化一、产酶菌株的获得一、产酶菌株的获得1.产酶菌株产酶菌株用于发酵生产的细胞需具备条件：用于发酵生产的细胞需具备条件：酶产量高。通过各种育种。酶产量高。通过各种育种。容易培养和管理。培养条件易于实现和控制。容易培养和管理。培养条件易于实现和控制。产酶稳定性好

2、。不易退化。产酶稳定性好。不易退化。利于酶的分离纯化。细胞及其他杂质可分离。利于酶的分离纯化。细胞及其他杂质可分离。安全可靠。使用的细胞及其代谢产物安全无毒。安全可靠。使用的细胞及其代谢产物安全无毒。酶的生产与分离纯化产酶微生物产酶微生物枯草芽枯草芽孢杆菌孢杆菌应用最广的产酶微生物应用最广的产酶微生物。-淀粉酶、淀粉酶、蛋白酶蛋白酶、 -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。大肠杆菌大肠杆菌一般都属于胞内酶。谷氨酸脱羧酶、用于一般都属于胞内酶。谷氨酸脱羧酶、用于测定谷氨酸含量测定谷氨酸含量； -半乳糖苷酶，用于分解乳糖等。半乳糖苷酶，用于分解乳糖等。黑曲霉黑曲霉糖化酶、糖化酶、 -淀

3、粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶脂肪酶、纤、纤维素酶、橙皮苷酶、柚柑酶等。维素酶、橙皮苷酶、柚柑酶等。米曲霉米曲霉糖化酶、蛋白酶酿酒；生产糖化酶、蛋白酶酿酒；生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P2、果胶酶等。、果胶酶等。青霉青霉产黄青霉用于生产葡聚糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶产黄青霉用于生产葡聚糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶CX等；橘青霉用于生产等；橘青霉用于生产5-磷酸二酯酶磷酸二酯酶、脂肪酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶等。等。木霉木霉

4、是生产纤维素酶的重要菌株。有纤维素是生产纤维素酶的重要菌株。有纤维素C1酶、酶、CX酶和纤维素二糖酶等。木霉中含有较强的酶和纤维素二糖酶等。木霉中含有较强的17- -羟化酶，用于甾体转化。羟化酶，用于甾体转化。根霉根霉糖化酶、糖化酶、 -淀粉酶、淀粉酶、转化酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。等。毛酶毛酶蛋白酶、糖化酶、蛋白酶、糖化酶、 -淀粉酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。链霉菌链霉菌纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶几

5、丁质酶等。等。17- -羟化酶，用于甾体转化。羟化酶，用于甾体转化。啤酒酵母啤酒酵母啤酒、酒精、饮料酒和面包制作。生产转化酶、啤酒、酒精、饮料酒和面包制作。生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。等。假丝酵母假丝酵母脂肪酶、脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。转化酶、醇脱氢酶等。17- -羟化酶，用于甾体转化。羟化酶，用于甾体转化。酶的生产与分离纯化一、产酶菌株的获得一、产酶菌株的获得2. 产酶菌株的选育产酶菌株的选育微生物发酵的优点微生物发酵的优点（1）种类多，并可根据需求筛选最佳的产酶菌株；）种类多，并可根据需求筛选最佳的产酶菌株；（2）繁殖

6、快，利于生产进行；）繁殖快，利于生产进行；（3）培养易，生产成本经济；）培养易，生产成本经济；（4）可操控，连续化、自动化降低生产成本；）可操控，连续化、自动化降低生产成本；（5）能改良，微生物具有很强的适宜能力，可通过遗传变异手段培育）能改良，微生物具有很强的适宜能力，可通过遗传变异手段培育新的、更好的菌株，增加产品开发；新的、更好的菌株，增加产品开发；微生物微生物育种的方法育种的方法诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种原生质体融合原生质体融合基因工程育种基因工程育种酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术工艺流程工艺流程保藏细胞保藏细胞固定化原固定化原生质体生质体细胞活化细胞

7、活化培养基培养基发酵发酵无菌空气无菌空气预培养预培养原生质体原生质体细胞扩大培养细胞扩大培养固定化细胞固定化细胞分离纯化分离纯化酶酶酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术1.培养基制备培养基制备碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐生长因子生长因子微量元素微量元素生产培养基与菌种培养基有很大区别。生产培养基与菌种培养基有很大区别。酶的生产与分离纯化（1）工业上常用的碳源）工业上常用的碳源酶的生产与分离纯化（2）有机氮源）有机氮源来源：来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋粉、黄

8、豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。糟。成分复杂：成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。盐及生长因子。例例 玉米浆：玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、等微量元素等硫、磷、等微量元素等酶的生产与分离纯化工业上常用的氮源及含氮量（质量分数）工业上常用的氮源及含氮量（质量分数）% 氮源含氮量氮源含氮量大麦1.52.0花生粉8.0甜菜1.52.0

9、燕麦粉1.52.0甘蔗糖蜜1.52.0大豆粉8.0玉米浆4.5乳清粉4.5酶的生产与分离纯化（3）无机盐及微量元素）无机盐及微量元素大量元素：大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。等。 （微生物生长所需浓度在（微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L）微量元素：微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。等。 （微生物生长所需浓度在（微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。 以上物质

10、作为其生理活性物质的组成和生理活性作用的调节物。以上物质作为其生理活性物质的组成和生理活性作用的调节物。酶的生产与分离纯化（4）生长因子）生长因子从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称等均称生长因子生长因子。功能：功能：构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。 生长因子不是所有微生物都必需的，对于营养缺陷生长因子不是所有微生物都必需的，对于营养缺陷 型才是必不可少的。型才是必不可少的。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含

11、有有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子的生长因子. 酶的生产与分离纯化B1核黄素B6CoA酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术p2.细胞活化与扩大培养细胞活化与扩大培养斜面菌种培养斜面菌种培养摇瓶或茄子瓶培养摇瓶或茄子瓶培养一级种子的培养一级种子的培养二级种子的培养二级种子的培养 发酵罐培养发酵罐培养 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术3.发酵工艺调节发酵工艺调节pH调节调节首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配

12、方，使它们有个首先需要考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内。值变化在合适的范围内。 （1）调节好基础料的）调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节呈酸性，必须调节pH。若要。若要控制消后控制消后pH在在6.0，消前，消前pH往往要调到往往要调到6.56.8。酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术（2）在基础料中加入维持）在基础料中加入维持pH的物质。的物质。如代谢产酸物质：葡萄糖（产酮酸）、（如代谢产酸物质：葡萄糖（产酮酸）、（NH4)2SO4 代谢

13、产碱物质：代谢产碱物质：NaNO3、尿素、尿素 缓冲剂：缓冲剂：CaCO3、磷酸缓冲液等、磷酸缓冲液等生理酸、碱性物质：生理酸、碱性物质：(NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术（3）、通过补料调节）、通过补料调节pH在发酵过程中根据糖、氮消耗需要进行补料。在补料与调在发酵过程中根据糖、氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛没有矛盾时采用补料调盾时采用补料调pH如如 调节补糖速率；消泡剂调节补糖速率；消泡剂(如豆油如豆油)的个别情况下，的个别情况下， 还可采用提高空气

14、流量来加速脂肪酸的代谢，以还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，以 调节调节pH 当当NH2-N低，低，pH低时补氨水；低时补氨水； 当当NH2-N低，低，pH高时补高时补(NH4)2SO4 当补料与调当补料与调pH发生矛盾时，加酸发生矛盾时，加酸 碱调碱调pH 酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术3.发酵工艺调节发酵工艺调节温度调节控制温度调节控制温度对发酵的影响温度对发酵的影响影响微生物的生长影响微生物的生长影响各种酶的反应速率影响各种酶的反应速率改变菌体代谢的合成的方向改变菌体代谢的合成的方向影响发酵液的物理性质影响发酵液的物理性质酶的生产与分离纯化温度影响微生物

15、的生长温度影响微生物的生长酶的生产与分离纯化温度影响反应速率温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。个最适温度。阿累尼乌斯方程式阿累尼乌斯方程式 (1).RTEAekk-反应速度常数，反应速度常数，1/s ；A-阿累尼乌斯常数，阿累尼乌斯常数， 1/s ;R-气体常数（气体常数（1.987x4.187J/K mol);T-热力学温度，热力学温度，K （0 =273K) ;E-活化能，活化能， J/mol ;e-2.718 则：随着温度升高酶反应速度增加则：随着温度升高酶反应速度增加酶的生产与分离纯化温度对合成的方向

16、的影响温度对合成的方向的影响例：四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金例：四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金 霉素。霉素。低于低于30 合成金霉素能力较强。合成金霉素能力较强。温度提高温度提高合成四环素的比例也提高。合成四环素的比例也提高。达到达到35则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。又如：赭曲霉又如：赭曲霉10 20 发酵时，有利于合成青霉素发酵时，有利于合成青霉素28 时，则有利于合成赭曲霉素。时，则有利于合成赭曲霉素。酶的生产与分离纯化温度对发酵液的物理性质产生影响温度对发酵液的物理性质产生影响影响发酵液的影响发酵液的黏度黏度氧在发酵液中的溶解度和传递速

17、率氧在发酵液中的溶解度和传递速率某些基质的分解速率某些基质的分解速率进而影响发酵动力学特征和产物的生物合成进而影响发酵动力学特征和产物的生物合成酶的生产与分离纯化发酵过程中最佳温度的选择发酵过程中最佳温度的选择发酵前期：发酵前期：由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍稍 高的温度高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；发酵中期：发酵中期：菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从 而提高产量，因此而提高产量，因此温度要稍低一些温度要稍低一些，可以

18、推迟衰老。因，可以推迟衰老。因 为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关 闭得比较严密有利于产物合成。闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期：发酵后期：产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要需提高温产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要需提高温 度，刺激产物合成到放罐。度，刺激产物合成到放罐。酶的生产与分离纯化发酵热和温度的控制发酵热和温度的控制发酵热Q发酵发酵=Q生物生物+ Q搅拌搅拌 Q蒸发蒸发 Q辐射辐射产热因素：生物热、搅拌热产热因素：生物热、搅拌热散热因素：蒸发热、辐射热散热因素：蒸发热、辐射热温度的控制 通过冷却将显热进行热交换

19、，以保持最佳发酵温度通过冷却将显热进行热交换，以保持最佳发酵温度 发酵罐的冷却装置：发酵罐的冷却装置： 夹套（夹套（10M10M3 3以下以下） 盘管（蛇管）盘管（蛇管） 列管列管 喷淋喷淋冷媒：冷媒： 冷水冷水 冷盐水冷盐水 氨氨建立冷冻站建立冷冻站酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术3.发酵工艺调节发酵工艺调节溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制p12,p16微生物的需氧微生物的需氧氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右倍左右(氧在水氧在水中的饱和度约为中的饱和度约为0.25mmol/L) 。许多发酵的生产能力。许多发酵的生产能力受到氧

20、利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。酶的生产与分离纯化描述微生物需氧的物理量描述微生物需氧的物理量p12KO2好氧速率（摄氧率），单位时间内单位好氧速率（摄氧率），单位时间内单位 体积的发酵液所需要的氧量；体积的发酵液所需要的氧量；mmol O2/（Lh ） 。QO2 细胞呼吸强度，单位重量细胞在单位时间耗氧量；细胞呼吸强度，单位重量细胞在单位时间耗氧量；mmol O2 /（g细胞细胞h ）。）。C0 细胞浓度，单位体积培养液中细胞的量；细胞浓度，单位体积培养液中细胞的量； g细胞细胞/L KO2 = QO2 . C0 酶的生产与分离纯

21、化酶的生产与分离纯化临界溶氧浓度临界溶氧浓度Cr: 临界溶氧浓度临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。CrQO2CL微微 生生 物物温度温度（C）临界氧浓度临界氧浓度（mmol/L）固固 氮氮 菌菌300.018大肠杆菌大肠杆菌370.008酵酵 母母300.004产黄青霉产黄青霉240.022p发酵液中有发酵液中有0.22 mmol /L酶的生产与分离纯化氧饱和度氧饱和度定义：定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度临界溶氧溶度对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1问题：

22、一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足？满足？例：例：某微生物的摄氧率某微生物的摄氧率0.052 mmol /（LS），）， 发酵液中有发酵液中有0.22 mmol /L 0.22/0.052=4.8秒秒由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样： 头孢菌素头孢菌素 卷须霉素卷须霉素生长生长 5% (相对于饱和浓度）相对于饱和浓度） 13%产物产物 13% 8%酶的生产与分离纯化溶氧对发酵的影响溶氧对发酵的影响例：天冬酰胺酶的发酵例：天冬酰胺酶的发酵前期好气培养，后

23、期转为厌气培养。前期好气培养，后期转为厌气培养。时机：当溶氧浓度降到时机：当溶氧浓度降到45%时，从好气转为厌时，从好气转为厌气，酶活力可提高气，酶活力可提高6倍。倍。酶的生产与分离纯化溶氧曲线溶氧曲线谷氨酸谷氨酸每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律酶的生产与分离纯化发酵过程中溶氧变化异常原因发酵过程中溶氧变化异常原因（1）污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗，反之下降。）污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗，反之下降。（2）菌体代谢发生异常，需氧要求增加。）菌体代谢发生异常，需氧要求增加。（3）搅拌功率变小，搅拌速度变慢或停止。）搅拌功率变小，搅拌速度变慢或停

24、止。（4）消泡剂加入过多、闷罐等。）消泡剂加入过多、闷罐等。污染烈性噬菌体：影响最为明显，生产菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，污染烈性噬菌体：影响最为明显，生产菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧直线上升。溶氧上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧直线上升。酶的生产与分离纯化微生物需氧与供氧微生物需氧与供氧需氧需氧KO2好氧速率（摄氧率），单位时间内单位好氧速率（摄氧率），单位时间内单位 体积的发酵液所需要的氧量；体积的发酵液所需要的氧量；mmol O2/（Lh ） 。供氧供氧OTR=kLa(c-c)kLa体积溶氧系数，单位：体积溶氧系数，单位：1

25、/h;或或kd经验公式：经验公式：)(sLgLvVpKak )()( LGLgLVVVpKak酶的生产与分离纯化供氧的控制供氧的控制p16p16(1) 改变通气速率（增大通气量）改变通气速率（增大通气量）氧传递系数氧传递系数kLa是随空气量是随空气量(空气的线速率空气的线速率)的增加而增大的。在低通气量的增加而增大的。在低通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果。的情况下，增大通气量对提高溶氧浓度有十分显著的效果。在空气流速已经十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显，反而在空气流速已经十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显，反而此时会产生某些副作用。比如：泡沫的形成

26、、水分的蒸发、罐温的增加以此时会产生某些副作用。比如：泡沫的形成、水分的蒸发、罐温的增加以及杂菌几率增加等。及杂菌几率增加等。(2) 改变搅拌速度改变搅拌速度增大搅拌转速，可以增大（增大搅拌转速，可以增大（PV），即搅拌功率，可以提高），即搅拌功率，可以提高kLa；当搅拌；当搅拌转速增加到一定程度时，将不会增加，若搅拌转速过大，还会由于剪切力转速增加到一定程度时，将不会增加，若搅拌转速过大，还会由于剪切力作用，打碎菌体，促使菌体自溶，增加泡沫等。作用，打碎菌体，促使菌体自溶，增加泡沫等。 酶的生产与分离纯化(3) 改变气体组成中的氧分压改变气体组成中的氧分压用通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，

27、提高了用通入纯氧方法来改变空气中氧的含量，提高了C*值，值，因而提高了供氧能力。因而提高了供氧能力。纯氧成本较高，但对于某些发酵需要时，如溶氧低于临界纯氧成本较高，但对于某些发酵需要时，如溶氧低于临界值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的。但有可能造成值时，短时间内加入纯氧是有效而可行的。但有可能造成细胞氧中毒。细胞氧中毒。 供氧的控制供氧的控制酶的生产与分离纯化(4) 改变罐压改变罐压增加罐压实际上就是改变氧的分压增加罐压实际上就是改变氧的分压pO2来提高来提高C*，从而提高供氧能力，从而提高供氧能力，但此法并不十分有效。主要原因是：但此法并不十分有效。主要原因是：提高罐压就要相应的增加空气压

28、缩机的出口压提高罐压就要相应的增加空气压缩机的出口压 力，也就是增加了动力消耗。力，也就是增加了动力消耗。发酵罐的强度也要相应增加发酵罐的强度也要相应增加提高罐压后，产生的提高罐压后，产生的CO2溶解量也要增加，会溶解量也要增加，会 使培养液的使培养液的pH值发生变化，这些对菌体生产都值发生变化，这些对菌体生产都 极为不利。极为不利。 供氧的控制供氧的控制酶的生产与分离纯化(5) 改变发酵液的理化性质改变发酵液的理化性质在发酵过程中在发酵过程中,菌体本身的繁殖及代谢可引起发酵液性质菌体本身的繁殖及代谢可引起发酵液性质不断改变不断改变, 因而显著地影响到氧的溶解速率，而且由于发因而显著地影响到氧

29、的溶解速率，而且由于发酵液中酵液中菌丝浓度所引起的表观粘度的增加，可使通气速率菌丝浓度所引起的表观粘度的增加，可使通气速率下降。下降。如果培养基性质为限制氧传递因素时，就根据具体情况对如果培养基性质为限制氧传递因素时，就根据具体情况对培养液的某一物理性质所作改造，例如补加无菌水，改变培养液的某一物理性质所作改造，例如补加无菌水，改变培养基的成分等都可以改善通气效果，以适应菌的正常生培养基的成分等都可以改善通气效果，以适应菌的正常生长。长。 供氧的控制供氧的控制酶的生产与分离纯化（6） 加入传氧中间介质加入传氧中间介质氧载体氧载体向发酵液中加入少量的水不溶性另一相，氧在这一液相中向发酵液中加入少

30、量的水不溶性另一相，氧在这一液相中具有比水中高得多的溶解度具有比水中高得多的溶解度.如常用的如常用的正十二烷，正十二烷，这类物质又称这类物质又称氧载体：作为非连续相，氧载体：作为非连续相，在搅拌的气液体系中被分散成比气泡小得多的微滴，附着在搅拌的气液体系中被分散成比气泡小得多的微滴，附着在气泡表面并在气泡水界面之间形成一层薄膜，使氧气在气泡表面并在气泡水界面之间形成一层薄膜，使氧气通过水膜溶入水相主流的推动力（氧浓度差）增大，相应通过水膜溶入水相主流的推动力（氧浓度差）增大，相应提高了传氧速率。提高了传氧速率。 供氧的控制供氧的控制酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术4.

31、提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制诱导合成调节诱导合成调节酶合成的反馈阻遏酶合成的反馈阻遏分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢对酶合成的阻遏作用酶合成的细胞膜通透性调节酶合成的细胞膜通透性调节（2）通过育种提高酶产量）通过育种提高酶产量自然选育自然选育诱变育种诱变育种基因重组基因重组（3）其他提高酶产量的方法）其他提高酶产量的方法改变碳氮比改变碳氮比添加产酶促进剂添加产酶促进剂添加阻遏物添加阻遏物酶的生产与分离纯化（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制p121)诱导合成调节诱导合成调节乳糖缺乏时乳糖缺乏时乳糖存在时乳糖存在时 Z y aZ-半乳糖苷

32、酶半乳糖苷酶 y-渗透酶渗透酶 a-转乙酰基酶转乙酰基酶酶的生产与分离纯化1961年，法国科学家莫诺（年，法国科学家莫诺（JLMonod，1910-1976）与雅可）与雅可布（布（FJacob）发表）发表“蛋白质合成中的遗传调节机制蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年后的四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。 1969年，贝克维斯（年，贝克维斯（JRBeckwith）从大肠杆菌的）从大肠杆菌的DNA中分离中分离出乳糖操纵子，完全证实了雅可布和莫诺

33、的模型。出乳糖操纵子，完全证实了雅可布和莫诺的模型。酶的生产与分离纯化乳糖操纵子对指导酶生产应用的实际意义乳糖操纵子对指导酶生产应用的实际意义采用现代诱变技术使细胞中的采用现代诱变技术使细胞中的调节基因调节基因发生突变，致使发生突变，致使调节基因不能转录翻译产生调节基因不能转录翻译产生阻遏蛋白阻遏蛋白，诱导酶变成组成酶，诱导酶变成组成酶，RNA聚合酶便能起作用、操纵子便能持久地开启，并连聚合酶便能起作用、操纵子便能持久地开启，并连续产生续产生-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。另一种组成突变体为变异的另一种组成突变体为变异的操纵基因，操纵基因，它不易因阻遏蛋白它不易因阻遏蛋白的作用而失活，从而导致操纵基

34、因开放而连续产生酶。的作用而失活，从而导致操纵基因开放而连续产生酶。在诱导酶合成时在诱导酶合成时加入诱导物加入诱导物以利于诱导酶的合成，食品以利于诱导酶的合成，食品工业应用的酶包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖异工业应用的酶包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、构酶、 -半乳糖苷酶等均属诱导酶，根据上述原理，在半乳糖苷酶等均属诱导酶，根据上述原理，在合成时最好的诱导物为该酶的合成时最好的诱导物为该酶的作用底物或其结构类似物作用底物或其结构类似物。酶的生产与分离纯化结构类似物结构类似物乳糖的结构类似物乳糖的结构类似物1,6-半乳糖半乳糖异丙基异丙基- -D-D-硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷

35、（IPTGIPTG）甲基甲基- -D-D-半乳糖等半乳糖等如：如：葡萄糖异构酶（或称木糖异构酶），若在培养基中加入葡萄糖异构酶（或称木糖异构酶），若在培养基中加入0.02%木糖木糖能能诱导合成该酶。诱导合成该酶。实际生产上，为降低成本也可采用廉价的实际生产上，为降低成本也可采用廉价的玉米芯的降解产物玉米芯的降解产物来代替。来代替。酶的生产与分离纯化（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制2）酶合成的反馈阻遏）酶合成的反馈阻遏 是指酶作用的终产物对酶合成产是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏作用。生阻遏作用。当有终产物或共阻遏物存在时，当有终产物或共阻遏物存在时，使它与立体阻遏物结合并与操纵使它与

36、立体阻遏物结合并与操纵基因结合，致使基因结合，致使RNA聚合酶停聚合酶停止作用，使操纵基因关闭，酶合止作用，使操纵基因关闭，酶合成受阻。成受阻。立体阻遏物RNA聚合酶共阻遏物RPODNASDNA酶的生产与分离纯化反馈阻遏机制实践意义反馈阻遏机制实践意义设法从培养基中除去终产物，以消除反馈阻遏。设法从培养基中除去终产物，以消除反馈阻遏。如如:生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌培养基培养基中含有氨基酸时产生很少量的中含有氨基酸时产生很少量的蛋白酶，除去氨基酸，便可大大提高蛋白酶的产量。蛋白酶，除去氨基酸，便可大大提高蛋白酶的产量。此外，限制培养基中此外，限制培养基中氨氨的含量或限制末

37、端产物在细胞内的积累，也可的含量或限制末端产物在细胞内的积累，也可增加酶的产量。增加酶的产量。向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子切断代谢途径通路。向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子切断代谢途径通路。例：组氨酸对组氨酸合成途径中的例：组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的生物合成均起反馈作用。种酶的生物合成均起反馈作用。如果加入抑制物如果加入抑制物-噻唑丙氨酸，便能使酶合成产量提高噻唑丙氨酸，便能使酶合成产量提高30倍。倍。酶的生产与分离纯化（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制3）分解代谢对酶合成的阻遏作用（中间产物阻遏）分解代谢对酶合成的阻遏作用（中间产物阻遏）指被菌体迅速利用的底物或其

38、分解产物对许多酶指被菌体迅速利用的底物或其分解产物对许多酶（降解酶、合成酶）合成的抑制作用。（降解酶、合成酶）合成的抑制作用。根据分解产物的不同，又分为根据分解产物的不同，又分为碳分解产物阻遏碳分解产物阻遏和和氮分解产物阻遏氮分解产物阻遏，如，如“葡萄糖效应葡萄糖效应”和和“铵阻铵阻遏遏”。酶的生产与分离纯化葡萄糖效应葡萄糖效应葡萄糖和乳糖同时存在，细菌葡萄糖和乳糖同时存在，细菌便会自动优先利用葡萄糖。便会自动优先利用葡萄糖。启动基因由环腺苷酸启动，启动基因由环腺苷酸启动，而而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。RNA聚合酶聚合酶-环腺苷酸结合不环腺苷酸结合不到位点上，使无法转

39、录。到位点上，使无法转录。由此可知，结构基因同时受两由此可知，结构基因同时受两个开关基因个开关基因操纵基因与启操纵基因与启动基因的调控。只有当这两个动基因的调控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。基因才能活化。酶的生产与分离纯化降解物降解物活化蛋白活化蛋白酶的生产与分离纯化葡萄糖的大量存在，降低了胞内葡萄糖的大量存在，降低了胞内 cAMP 浓度：浓度：葡萄糖抑制葡萄糖抑制腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶活性，降低活性，降低 cAMP 生成：生成： ATP cAMP + Pii？葡萄糖降解物引起葡萄糖降解物引起 消耗胞内消耗胞内 cAMP： cAMP + H2

40、O ADP AMP结果，启动子上没有结果，启动子上没有cAMPCRP复合物结合，使得复合物结合，使得RNA聚合酶也无法结合到启动子的位点上，结构基因不聚合酶也无法结合到启动子的位点上，结构基因不能转录和表达。能转录和表达。 酶的生产与分离纯化铵阻遏铵阻遏氮分解产物的调节作用指的是被菌体迅速利用的氮分解产物的调节作用指的是被菌体迅速利用的氮源（特别是铵）能阻抑某些参与含氮化合物代氮源（特别是铵）能阻抑某些参与含氮化合物代谢的酶的合成。谢的酶的合成。如：在初级代谢中，它能阻遏许多如：在初级代谢中，它能阻遏许多芽孢杆菌的蛋芽孢杆菌的蛋白酶白酶的合成的合成通常受到通常受到 NH4+ 阻遏的酶有：亚硝酸

41、还原酶、硝阻遏的酶有：亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、固氮酶、乙酰胺酶、脲酶、黄嘌呤脱酸还原酶、固氮酶、乙酰胺酶、脲酶、黄嘌呤脱氢酶、组氨酸酶、天冬酰胺酶等。氢酶、组氨酸酶、天冬酰胺酶等。酶的生产与分离纯化（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制诱导型操纵子；诱导型操纵子；阻遏型操纵子；阻遏型操纵子；阻遏型操纵子形式阻遏型操纵子形式末端产物或终产物阻遏；末端产物或终产物阻遏；分解代谢产物阻遏（中间产物）；分解代谢产物阻遏（中间产物）；酶的生产与分离纯化（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制4）酶合成的细胞膜通透性调节）酶合成的细胞膜通透性调节微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。微生

42、物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外，这种解除末端产物反胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外，这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株，可以提高发酵产物的产量。馈抑制作用的菌株，可以提高发酵产物的产量。a.生物素亚适量生物素亚适量机制：机制：生物素生物素是合成脂肪酸的关键酶是合成脂肪酸的关键酶-乙酰乙酰CoA 羧化酶的羧化酶的辅酶，辅酶，亚适量的生物素亚适量的生物素直接抑制膜的合成直接抑制膜的合成或或使膜缺损使膜缺损 。乙酰乙酰CoA 丙二酸单酰丙二酸单酰CoA 脂

43、肪酸脂肪酸 CO2生物素生物素酶的生产与分离纯化b.油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸（油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸（C18），是），是细胞膜磷脂中细胞膜磷脂中的重要脂肪酸。的重要脂肪酸。油酸缺陷型因不能合成油酸而使细胞膜缺损油酸缺陷型因不能合成油酸而使细胞膜缺损，细胞膜，细胞膜的通透性加大。的通透性加大。甘油缺陷型菌株的甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。即使是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷大量渗漏。即使是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量

44、谷氨酸。氨酸。c.控制细胞壁控制细胞壁如：加青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，从而改变细胞如：加青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，从而改变细胞壁的通透性。壁的通透性。酶的生产与分离纯化二、酶生产的发酵技术二、酶生产的发酵技术4.提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法（1）酶的合成调节机制）酶的合成调节机制诱导合成调节诱导合成调节酶合成的反馈阻遏酶合成的反馈阻遏分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢对酶合成的阻遏作用酶合成的细胞膜通透性调节酶合成的细胞膜通透性调节（2）通过育种提高酶产量）通过育种提高酶产量自然选育自然选育诱变育种诱变育种基因重组基因重组（3）其他提高酶产量的方法）

45、其他提高酶产量的方法改变碳氮比改变碳氮比添加产酶促进剂添加产酶促进剂添加阻遏物添加阻遏物酶的生产与分离纯化4.提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法（2）通过基因突变（育种）提高酶产量）通过基因突变（育种）提高酶产量A.自然选育自然选育B.诱变育种诱变育种C.基因重组基因重组D.其他方法其他方法酶的生产与分离纯化A.自然选育与诱变育种自然选育与诱变育种a.自然选育自然选育根据菌种的自发突变而进行菌种筛选过程。根据菌种的自发突变而进行菌种筛选过程。 突变频率低。突变频率低。b.诱变选育诱变选育通过诱变剂处理，突变频率提高，随机性大，如果通过诱变剂处理，突变频率提高，随机性大，如果 筛选方法得当

46、，也有可能获得好的变异株。筛选方法得当，也有可能获得好的变异株。目的：目的： 提高产量提高产量 提高质量提高质量 增加品种增加品种 改善工艺条件改善工艺条件 酶的生产与分离纯化自然选育自然选育确定出发菌株确定出发菌株 菌种的纯化选优菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定同步培养同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理诱变处理 计形态变异的菌落数，计形态变异的菌落数， 计算突变率计算突变率 平板分离平板分离 挑取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养 突变

47、体的初步筛选突变体的初步筛选 用简单快捷的方法用简单快捷的方法重复筛选重复筛选 摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）重复诱变处理）诱变育种诱变育种酶的生产与分离纯化诱变剂诱变剂物理物理诱变剂诱变剂化学化学诱变剂诱变剂烷化剂烷化剂碱基类似物碱基类似物吖啶化合物吖啶化合物紫外线紫外线X射线射线射线射线快中子快中子激光激光射线射线诱变剂的种类及选择诱变剂的种类及选择诱变剂处理诱变剂处理方式可分为方式可分为:单因子处理单因子处理和复因子处和复因子处理，复因子理，复因子处理一般先处理一般先用弱诱变因用弱诱变因子，后用强子，后用强诱变因

48、子诱变因子酶的生产与分离纯化诱变剂诱变剂诱变剂的浓度诱变剂的浓度处理时间处理时间缓冲液缓冲液终止反应终止反应亚硝酸亚硝酸.mol/lminPH4.51mol/l醋醋酸缓冲液酸缓冲液Ph8.6,0.07mol/l磷酸磷酸二氢钠二氢钠硫酸二乙酯硫酸二乙酯（DES）minPH7.0,0.1mol/l磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠硫代硫酸钠或大量稀释或大量稀释甲基硫酸乙甲基硫酸乙酯（酯（EMS）mol/lminPH7.0,0.1mol/l磷酸缓冲液磷酸缓冲液硫代硫酸钠硫代硫酸钠或大量稀释或大量稀释亚硝基胍亚硝基胍（NTG）mg/mlminPH7.0,0.1mol/l磷酸缓冲液磷酸缓冲液大量稀释大量稀释

49、亚硝基甲基亚硝基甲基胍（胍（NMU）mg/mlminPH7.0,0.1mol/l磷酸缓冲液磷酸缓冲液大量稀释大量稀释氮芥氮芥mg/mlmin碳酸氢钠碳酸氢钠大量稀释大量稀释氯化锂氯化锂加入培养基，在加入培养基，在生长过程中进行生长过程中进行大量稀释大量稀释秋水仙碱秋水仙碱加入培养基，在加入培养基，在生长过程中进行生长过程中进行大量稀释大量稀释酶的生产与分离纯化1）高产突变株的选育）高产突变株的选育出发菌株出发菌株绝大多数个体死亡绝大多数个体死亡少数存活少数存活多数未变多数未变少数突变少数突变多数负变多数负变少数正变少数正变多数变幅小多数变幅小少数变幅大少数变幅大多数不宜投产多数不宜投产少数宜投

50、产少数宜投产存活率存活率 突变率突变率 正变率正变率 高产率高产率 投产率投产率诱变平板分离平板分离纯培养纯培养初筛初筛重筛重筛变异幅度广变异幅度广 产量高的出发菌株产量高的出发菌株 对诱变剂敏感性大对诱变剂敏感性大酶的生产与分离纯化产酶高产菌初筛产酶高产菌初筛透明圈法透明圈法显色圈法显色圈法摇瓶培养摇瓶培养酶的生产与分离纯化透明圈法透明圈法在平板培养基中加入在平板培养基中加入溶解性较差的底物，溶解性较差的底物，使培养使培养基混浊。能分解底物的微生物会在菌落周围产生基混浊。能分解底物的微生物会在菌落周围产生透明圈。透明圈。该法在分离该法在分离水解酶产生菌水解酶产生菌时采用较多，产有机酸时采用较

51、多，产有机酸菌也可用。菌也可用。如：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都如：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成透明圈。会在含有底物的选择性培养基平板上形成透明圈。圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。酶的生产与分离纯化 - -淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选酶的生产与分离纯化应用含酪蛋白的培养基应用含酪蛋白的培养基酶的生产与分离纯化筛选半纤维素酶筛选半纤维素酶 划线产透明圈的细菌划线产透明圈的细菌点种点种酶的生产与分离纯化变色圈法变色圈法对于一些对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中

52、可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如：筛选果胶酶生产菌时，用含有如：筛选果胶酶生产菌时，用含有0.2%果胶为唯一碳源果胶为唯一碳源的培养基平板，待菌落长成后，加入的培养基平板，待菌落长成后，加入0.2%刚果红染色液刚果红染色液4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。刚果红的变色范围为刚果红的变色范围为pH35。 在在pH5时，它以磺酸钠形式存在，显红色；时，它以磺酸钠形式存在，显红色； 在在pH3时，它以邻醌式内盐的结构存在，显蓝色。时，它以邻醌式内盐

53、的结构存在，显蓝色。 果胶酶水解果胶形成游离的半乳糖醛酸果胶酶水解果胶形成游离的半乳糖醛酸 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化产酶高产菌复筛产酶高产菌复筛经初筛后可简便快速淘汰经初筛后可简便快速淘汰8590%不符合要求不符合要求的微生物，剩下较好菌株进行摇瓶复筛。的微生物，剩下较好菌株进行摇瓶复筛。通常一株要重复通常一株要重复35个瓶，培养后的发酵液采用个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定：精确分析方法测定：蛋白酶用分光光度计；蛋白酶用分光光度计；脂肪酶用脂肪酶用NaOH滴定等。滴定等。最后选出最后选出23株。株。酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化2）组成型突变株的选育）组成型突变株的

54、选育组成型突变株：组成型突变株：是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵。是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵。菌株不经诱导也能合成酶；菌株不经诱导也能合成酶；或不受终产物阻遏的调节突变型。或不受终产物阻遏的调节突变型。突变株特性：突变株特性：有的是调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；有的是调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；有的是操纵基因突变，丧失了和阻抑物结合的亲和力。有的是操纵基因突变，丧失了和阻抑物结合的亲和力。目的：目的：可以利用一些易可以利用一些易同化碳源同化碳源或或价廉易得的碳源价廉易得的碳源为基质，生产所需的为基质，生产所需的诱导诱导酶类酶类。酶

55、的生产与分离纯化组成型选育方法：组成型选育方法：a.限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养。续培养。由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作用，所以诱导型的野生型菌株不能生长，而突变株由于不用，所以诱导型的野生型菌株不能生长，而突变株由于不经诱导就可以产生诱导酶而利用底物，因而很快得以生长经诱导就可以产生诱导酶而利用底物，因而很快得以生长成为组成型菌株。成为组成型菌株。培养过程正确控制培养时间，使组成型突变株得以繁殖，培养过程正确控

56、制培养时间，使组成型突变株得以繁殖，而诱导型菌株则被淘汰。而诱导型菌株则被淘汰。例如在低浓度乳糖恒化器上连续培养大肠杆菌，其中组成例如在低浓度乳糖恒化器上连续培养大肠杆菌，其中组成型突变株不要加诱导物也能合成型突变株不要加诱导物也能合成-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。酶的生产与分离纯化组成型选育方法：组成型选育方法：b.循环培养循环培养要解除诱导的菌株，移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替要解除诱导的菌株，移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。连续循环培养。由于组成型突变株在两个培养基上都能产酶，生长逐渐占优势。由于组成型突变株在两个培养基上都能产酶，生长逐渐占优势。例如把诱

57、导型的野生菌株经诱变剂处理后，先移接到含葡萄糖培养基例如把诱导型的野生菌株经诱变剂处理后，先移接到含葡萄糖培养基中进行培养。这时，野生型菌株和组成型突变体都能生长。将此培养中进行培养。这时，野生型菌株和组成型突变体都能生长。将此培养物移接到含诱导物培养基中培养，物移接到含诱导物培养基中培养，此时组成型菌株立即开始生长，此时组成型菌株立即开始生长，而而诱导型野生菌株须经一段停留时间诱导型野生菌株须经一段停留时间(诱导酶合成时间诱导酶合成时间)才开始生长，只才开始生长，只要细心控制在含诱导物培养基中培养时间，反复交替培养，组成型逐要细心控制在含诱导物培养基中培养时间，反复交替培养，组成型逐渐占优势

58、，诱导型却被淘汰。渐占优势，诱导型却被淘汰。酶的生产与分离纯化组成型选育方法：组成型选育方法：c.鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用如将诱变孢子悬液涂布在甘油作惟一碳源的平板上，培养如将诱变孢子悬液涂布在甘油作惟一碳源的平板上，培养后长出菌落。后长出菌落。然后在菌落上喷上然后在菌落上喷上O-硝基苯酚硝基苯酚-D半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)，组成型成黄色，诱导型呈白色。组成型成黄色，诱导型呈白色。这是由于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生这是由于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生-半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-硝基苯酚，因而硝基苯酚，因而很容易挑选

59、。很容易挑选。此方法为目测法，可免去上述几种方法的浓缩富集过程。此方法为目测法，可免去上述几种方法的浓缩富集过程。酶的生产与分离纯化组成型选育方法：组成型选育方法：d.筛选筛选经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。例如利用苯变体能良好生长，野生型不能生长。例如利用苯-半乳糖半乳糖(PG)筛选筛选-半乳糖苷酶组成型突变株。半乳糖苷酶组成型突变株。酶的生产与分离纯化3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选）抗分解代谢阻遏突变株的筛选a.循环培养法循

60、环培养法将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。例如，将大肠杆菌先在葡萄糖培养基中培养，后又转移到乳糖等慢速例如，将大肠杆菌先在葡萄糖培养基中培养，后又转移到乳糖等慢速利用的碳源培养基上培养，出现一个生长的延缓期，此时由于突变株利用的碳源培养基上培养，出现一个生长的延缓期，此时由于突变株解除了阻遏现象，解除了阻遏现象，在葡萄糖培养基上生长时已合成乳糖分解酶，在葡萄糖培养基上生长时已合成乳糖分解酶，故在故在含乳糖培养基上很快就能形成菌

61、落，而野生型菌株转接到乳糖培养基含乳糖培养基上很快就能形成菌落，而野生型菌株转接到乳糖培养基中，需要花去一定时间去合成分解乳糖酶，其生成速度比突变株慢得中，需要花去一定时间去合成分解乳糖酶，其生成速度比突变株慢得多，控制培养时间，可以筛选到目的变株多，控制培养时间，可以筛选到目的变株酶的生产与分离纯化3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选）抗分解代谢阻遏突变株的筛选b.鉴别性培养基鉴别性培养基假若筛选抗乳糖分解阻遇的菌株，把诱变后的菌假若筛选抗乳糖分解阻遇的菌株，把诱变后的菌体分离在体分离在含有葡萄糖的琼脂平板上含有葡萄糖的琼脂平板上，长成菌落后，长成菌落后，喷上喷上ONPG，抗分解阻遏的菌落呈显黄色

62、，野生，抗分解阻遏的菌落呈显黄色，野生型是白色。型是白色。酶的生产与分离纯化3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选）抗分解代谢阻遏突变株的筛选c.特殊氮源特殊氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌(Aerobacters aerogenes)，可以选出不受，可以选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。由于野生型菌株合成组氨酸酶被葡萄糖阻遏，而由于野生型菌株合成组氨酸酶被葡萄糖阻遏，而突变株则可产生组氨酸酶，能迅速生长形成菌落。突变株则可产生组氨酸酶，能迅

63、速生长形成菌落。酶的生产与分离纯化3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选）抗分解代谢阻遏突变株的筛选d葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物用于筛选抗分解阻遏突变体的葡萄糖结构类似物有用于筛选抗分解阻遏突变体的葡萄糖结构类似物有2-脱脱氧葡萄糖氧葡萄糖(以下称以下称2-dG)和和3-O-甲基葡萄糖甲基葡萄糖(以下称以下称3mG)酶的生产与分离纯化3）抗分解代谢阻遏突变株的筛选）抗分解代谢阻遏突变株的筛选2-dG和和3-mG具有以下特性：具有以下特性：结构与葡萄糖类似，既不被微生物同化，也不能作为微生结构与葡萄糖类似，既不被微生物同化，也不能作为微生物生长的碳源；它们不被微生物代谢，也不阻抑微生物生物生长的碳

64、源；它们不被微生物代谢，也不阻抑微生物生长，在葡萄糖培养基中添加低浓度长，在葡萄糖培养基中添加低浓度2-dG或或3-mG，微生，微生物可以正常地生长；由于它们的结构类似葡萄糖，物可以正常地生长；由于它们的结构类似葡萄糖，和葡萄和葡萄糖一样会阻遏诱导酶的合成，其阻遏作用甚至比葡萄糖还糖一样会阻遏诱导酶的合成，其阻遏作用甚至比葡萄糖还要强。要强。正因为正因为2-dG和和3-mG既不被微生物代谢又具有分解阻遏既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，因此应用含作用，因此应用含2-dG或或3-mG的琼脂培养基平板可筛的琼脂培养基平板可筛选抗分解阻遏的突变株。选抗分解阻遏的突变株。酶的生产与分离纯化例如例如淀

65、粉诱导桔林油脂酵母淀粉诱导桔林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)合成合成淀粉酶，由于淀粉酶，由于2-dG会阻遏此酶的诱导合成，故会阻遏此酶的诱导合成，故将酵母涂布在含玉米淀粉、酵母膏、蛋白胨及含有将酵母涂布在含玉米淀粉、酵母膏、蛋白胨及含有0012-dG的琼脂平板上。的琼脂平板上。培养后野生型菌株不能合成培养后野生型菌株不能合成-淀粉酶，也就不能分解利淀粉酶，也就不能分解利用淀粉，因而在这种平板上不能产生菌落，仅抗用淀粉，因而在这种平板上不能产生菌落，仅抗2-dG突突变株才能形成菌落并在其周围形成透明圈。变株才能形成菌落并在其周围形成透明圈。酶的生产与分离纯化又如：又如：纤

66、维素诱导木霉合成纤维素酶，将木霉涂布在含酸膨胀纤纤维素诱导木霉合成纤维素酶，将木霉涂布在含酸膨胀纤维素、蛋白胨、无机盐、胆汁、维素、蛋白胨、无机盐、胆汁、Phosphon-D(防菌落防菌落扩张剂扩张剂)及一定量及一定量2-dG的琼脂平板上。的琼脂平板上。野生型菌株不能合成纤维素酶，不能分解纤维素，因而不野生型菌株不能合成纤维素酶，不能分解纤维素，因而不能形成菌落，仅抗能形成菌落，仅抗2-dG才能形成菌落并在其周围形成透才能形成菌落并在其周围形成透明圈。明圈。 酶的生产与分离纯化(4)无孢子突变株的筛选无孢子突变株的筛选细菌细菌-淀粉酶、淀粉酶、-淀粉酶以及蛋白酶的生物合成与芽孢淀粉酶以及蛋白酶的生物合成与芽孢的形成有密切关系，筛选无孢子突变株有可能增加这些酶的形成有密切关系，筛选无孢子突变株有可能增加这些酶的合成与分泌。的合成与分泌。方法：方法：用氯仿熏蒸、斜面培养或镜检来确证。用氯仿熏蒸、斜面培养或镜检来确证。如：将生成的菌落用氯仿熏蒸，凡无孢子的菌株经过处理如：将生成的菌落用氯仿熏蒸，凡无孢子的菌株经过处理后会死亡，因而可从对照平板上选出无孢子突变株。后会死亡，因而可从对照平板上选