生物化学课程要点1(共68页)

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1、精选优质文档-倾情为你奉上导 论生物化学是生命的化学，是研究生物体的化学组成（生物分子）和生命活动过程中的化学变化的一门科学。 一、生物化学主要涉及以下几个方面的内容 生物分子的结构与功能：生物分子包括生物小分子和生物大分子，生物小分子主要有氨基酸、单糖、核苷酸、脂肪酸、甘油和维生素等，构成相应的生物大分子蛋白质、多糖、核酸和脂肪等。生物分子之间的相互作用：生物体生命活动的执行和实施是通过生物分子之间的相互作用完成的。生物分子的合成与分解。合成的代谢产物除了用来构成生物体外，还可以储存和运输能量。生物分子的分解可为合成代谢提供原料，并释放出大量的能量来完成生物体的生命活动。能量的产生、储存和利

2、用。生物分子的组装与协调。遗传信息的贮存、传递和表达调控。二、本课程的结构、重点与难点 第一部分：生物分子的结构与功能。包括氨基酸和蛋白质的结构与功能（第二章、第三章）；酶的结构与功能（第四章）；核酸的结构与功能（第五章）；糖类的结构与功能（第六章）；脂类与生物膜的结构与功能（第七章）。重点：氨基酸与蛋白质、酶、核酸的结构与功能。难点：氨基酸的酸碱性质；蛋白质一级结构的确定；蛋白质的分离与鉴定；酶反应动力学酶的活性调节；核苷酸与核酸的结构；RNA的结构特征。 第二部分：物质代谢及其调节。包括生物能学和代谢总论（第八章、第九章、第十二章、第十四章）；糖代谢（第十章、第十一章、第十三章）；脂类代谢

3、（第十五章）；氨基酸代谢（第十六章）；核苷酸代谢（第十七章）；物质代谢调节（第十八章）。重点：生物体内ATP的产生；糖代谢；脂类代谢；物质代谢调节。难点：生物氧化还原反应中自由能变化；电子传递与氧化磷酸化；三羧酸循环（柠檬酸循环）；脂肪酸的生物合成；核苷酸的生物合成第三部分：遗传信息的贮存、传递和表达调控。包括DNA的复制、修复与重组（第十九章）；基因的转录与加工（第二十章）；蛋白质的生物合成（第二十一章）；基因的表达与调控。重点：基因的复制、转录和翻译。难点：真核生物的基因表达调控 第一章 氨基酸与蛋白质1. 蛋白质的生物学意义 2. 蛋白质的元素组成3. 蛋白质的氨基酸组成 4. 肽5.

4、蛋白质的结构 6. 蛋白质分子结构与功能的关系7. 蛋白质的性质 8. 蛋白质的分类蛋白质 是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。第一节 蛋白质的生物学意义1. 生物体的组成成分 2. 酶 3. 运输4. 运动 5. 抗体 6. 干扰素7. 遗传信息的控制 8. 细胞膜的通透性 9. 高等动物的记忆、识别机构第二节 蛋白质的组成一、 蛋白质的元素组成C（5055%）、H（68%）、O（2023%）、N（1518%）、 S（04%）、N的含量平均为16%凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础。二、蛋白质的氨基酸组成氨基酸 是蛋

5、白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸（20 standard amino acids)组成。（一）氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到碳原子（C），同时结合到（C）上的是H原子和各种侧链（R）；Pro具有二级氨基（-亚氨基酸）COOH COO- l lH2NCH +H3NCH l lR R不带电形式 两性离子形式 C如是不对称C（除Gly），则：1. 具有两种立体异构体 D-型和L-型2. 具有旋光性 左旋（-）或右旋（+）（二）氨基酸的分类1. 根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、L

6、eu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro2. 根据R基团的极性分（1）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp（2）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu3. 其它氨基酸第三节 氨基酸的性质无色晶体，熔点极高（200以上），有不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。一 氨基酸的构型和

7、旋光性除Gly外，19种氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体。 Thr、Ile有四种光学异构体。 旋光性：使偏振光平面逆时针方向（左手，）或顺 时针方向（右手，）旋转的性质。二 酸碱性质Henderson-Hasselbalch 方程 ：HA = A- + H+ Ka=H+A-/ HAH+（A-/ HA) 两边取负对数 pKapHlg（A-/ HA） pHpKa+ lg（A-/ HA）pKa+ lg(碱/酸) 在这里能接受H+（质子受体）的A-被看作广义的碱，而能释放H+（质子供体）的HA被看作广义的酸。 Gly 的 解 离甘氨酸解离曲线专心-专注-专业等电点（等电pH，pI

8、）两性电解质净电荷为零时溶液的pH值。等电点时，电解质在电场中不运动侧链不解离的中性氨基酸pIpK1pK2/2三 化学性质1. 氨基酸的甲醛滴定可直接用来测定氨基酸浓度2. 与亚硝酸反应3. 酰化反应4. 烃基化反应（1） Sanger反应：2,4-二硝基氟苯（DNFB）（2） Edman反应：苯异硫氰酸酯（PITC）5. 生成西佛碱的反应6. 脱氨基反应7. 成酯反应8. 成酰氯反应9. 叠氮反应10. 成肽反应11. 与茚三酮的反应紫色复合物：570 nm亮黄色化合物：脯氨酸、羟脯氨酸 440 nm四 氨基酸的紫外吸收第四节 蛋 白 质 结 构蛋白质结构层次一 蛋白质的一级结构氨基酸脱水缩

9、合成肽肽 与 肽 键牛催产素：促使子宫收缩、分娩牛加压素：促使小动脉收缩及肾小管重吸收水，抗利尿激素舒缓激肽：促进血管舒张及水、钠排出，降压两种脑啡肽：强烈镇痛物质，类似于鸦片剂蛋白质一级结构的测定 概况 :理想方法是从N端直接测至C端 ，间接法序列测定前的准备工作：样品的纯度:97%以上 相对分子质量肽链的数目氨基酸组成一级结构的测定主要用小片段重叠的原理 蛋白质测序的一般步骤1. 测定蛋白质分子中多肽链的数目。2. 拆分蛋白质分子中的多肽链。3. 测定多肽链的氨基酸组成。4. 断裂链内二硫键。5. 分析多肽链的N末端和C末端。6. 多肽链部分裂解成肽段。7. 测定各个肽段的氨基酸顺序8.

10、确定肽段在多肽链中的顺序。9. 确定多肽链中二硫键的位置。序列测定方法 （1）末端分析：包括N端分析，C端分析 N端分析方法 二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法） 丹磺酰氯法（DNS法）：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。 苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 ） 氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法 A B BN端亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase, LAP）专一性:A=非极性氨基酸时 快A=其它氨基酸时 慢A=Leu时 最快N端氨基封闭的几种情况：焦谷氨酰环化：

11、焦谷氨酸氨肽酶 乙酰化 环肽 C端分析 硼氢化锂还原法 肼解法：也称联氨法 氨基酸酰肼与苯甲醛作用变为水不溶性的二苯基衍生物Gln、Asn、Cys易破坏，Arg转变为鸟氨酸 羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法 4种羧肽酶的来源和专一性 （2）肽链的拆开和分离 共价键：过甲酸氧化 SS+HCOOOH SO3H巯基乙醇还原： 非共价键：8mol/L尿素，SDS （3）肽链的部分水解 化学方法： 溴化氰（CNBr）裂解法:酶解方法 （4）肽段的分离和氨基酸序列测定 电泳法 根据分子量大小分离离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex） 根据肽段的电荷

12、特性分离反相法 根据肽段的极性分离凝胶过滤 （5）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列 （6）二硫键位置的确定 对角线电泳 过甲酸 磺基丙氨酸二 蛋白质的二级结构不可能的空间构象侧链对螺旋的影响无规卷曲指不能归入明确的二级结构如折叠片和螺旋的多肽区段。常构成酶的活性中心和蛋白质的特异功能部位。烫发的生物化学原理 角蛋白结 构 域按结构域的分类三 蛋白质的三级结构肌红蛋白的三级结构四 蛋白质的四级结构缔合蛋白的优越性第五节 蛋白质的结构与功能一 蛋白质的一级结构决定其高级结构（三维结构、构象）。多聚丙氨酸在pH7溶液中能自发形成螺旋，而多聚赖氨酸却不能。二 蛋白质的一级结构具有种族特异性细胞色素

13、C进化树三 蛋白质的三维结构决定其生物学功能。蛋白质变性与复性第六节 蛋白质的分离、纯化一 根据分子大小不同的纯化方法1. 透析和超滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质。2. 密度梯度离心：质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得更快，当某种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度介质中时，即停止不前。3. 凝胶过滤：分子排阻层析，分子筛，凝胶渗透层析二 根据蛋白质带电情况分离纯化蛋白质具有两性电离的性质，在不同pH值溶液中带电情况不同。1. 离子交换层析2. 蛋白质电泳（NativePAGE，SDSPAGE）3. 等电聚焦蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏

14、碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。三 亲和层析法利用蛋白质与其配体（ligand）之间的相互作用，如抗原与抗体、酶与

15、底物、激素与受体、细胞因子与受体等蛋白质与配体之间发生特异性结合，而这种结合又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 四 检测技术1. SDSPAGE2. 免疫印迹技术（Western-blotting）蛋白质的电泳分离将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。 3. 酶联免疫

16、分析（enzyme linked immunosorbant assay ，ELISA）将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。 然后加入酶的作用底物催化显色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果，进行定性或定量测定。第七节蛋白质的性质一 蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10 0001 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：

17、蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。v =沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系二 蛋白质的沉淀反应1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2. 加有机溶剂3. 加重金属盐4. 加生物碱试剂单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能

18、沉淀生物碱，称生物碱试剂。三 蛋白质的颜色反应思考题一个谷氨酸溶液，用5m1 1mo1/LNa0H来滴定，溶液的pH从1.0上升到7.0，下列数值中哪一个接近于该溶液中所含谷氨酸的毫摩尔数? A.1.5B.3.0C.6.0D.12.0E.18.0 一、A型题（1-32)1.使蛋白质和酶分子显示巯基的氨基酸是 A.蛋氨酸 B.胱氨酸 C.半胱氨酸 D.谷氨酸 E.赖氨酸2.蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是 A.肽键 B.半胱氨酸的-SH基 C.苯丙氨酸的苯环 D.色氨酸的吲哚环 E.组氨酸的咪唑环3.天然蛋白中不存在的氨基酸是 A.半胱氨酸 B.瓜氨酸 C.脯氨酸 D.蛋氨酸 E.丝

19、氨酸4.以下哪一种氨基酸不具备不对称碳原子 A.甘氨酸 B.丝氨酸 C.半胱氨酸 D.苏氨酸 E.丙氨酸5.维系蛋白质一级结构的化学键是 A.氢键 B.肽键 C.盐键 D.疏水键 E.范德华力6.下列氨基酸不含极性侧链的是 A.丝氨酸 B.苏氨酸 C.亮氨酸 D.酪氨酸 E.半胱氨酸7.下列对氨基酸的叙述错误的是 A.赖氨酸和精氨酸都是碱性氨基酸 B.谷氨酸和天冬氨酸各含两个氨基 C.丝氨酸和酪氨酸均含羟基 D.缬氨酸和亮氨酸属支链氨基酸 E.苯丙氨酸和酪氨酸均含苯环8.下列含有两个羧基的氨基酸是 A.丙氨酸 B.酪氨酸 C.赖氨酸 D.甘氨酸 E.谷氨酸9.组成蛋白质的基本单位是A.L-氨基

20、酸 B.D-氨基酸 C.L-氨基酸 D.L,D-氨基酸 E.D-氨基酸10.下列哪一物质不属于生物活性肽 A.胰高血糖素 B.短杆菌素S C.催产素 D.胃泌素 E.血红素11.下列关于蛋白质结构叙述中，不正确的是 A.一级结构决定二、三级结构 B.二、三级结构决定四级结构 C.三级结构即具有空间构象 D.无规卷曲是在一级结构上形成的 E.螺旋又称为二级结构12.可以裂解肽链中蛋氨酸残基末端的试剂有 A.羟胺 B.溴化氰 C.胃蛋白酶 D.中等强度的酸 E.胰蛋白酶13.有一血清清蛋白（pI=6.85）的混合物，在哪种条件下电泳、分离效果最好 A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D

21、.pH8.6 E.pH3.514.可用于测定多肽N端氨基酸的试剂有 A.丹磺酰氯 B.巯基乙醇 C.溴化氢 D.羟胺 E.甲酸15.变性蛋白质的特点是 A.粘度下降 B.丧失原有的生物活性 C.颜色反应减弱 D.溶解度增加 E.不易被胃蛋白酶水解 16.蛋白质变性是由于 A.蛋白质一级结构改变 B.蛋白质空间构象的改变 C.辅基的脱落 D.蛋白质水解 E.以上都不是 17.下列有关蛋白质片层结构的叙述正确 的是 A.主链骨架呈锯齿状 B.两个相邻的肽平面呈折纸状 C.片层结构是一种较伸展的肽链结构 D.若干矩齿状肽链骨架平行或反平行排列，链间靠氢键维系 E.以上都正确18.可用于蛋白质定量的测

22、定方法有 A.双缩脲法 B.紫外吸收法 C.Folin酚试剂法 D.凯氏定氮法 E.以上都可以 19.蛋白质多肽链具有的方向性是 A.从3端到5端 B.从5端到3端 C.从C端到N端 D.从N端到C端 E.以上都不是20.血浆蛋白质的pI大多为pH5-6，它们在血液中的主要存在形式是 A.兼性离子 B.带负电荷 C.带正电荷 D.非极性分子 E.疏水分子21.蛋白质分子中的螺旋和片层都属于 A.一级结构 B.二级结构 C.三级结构 D.域结构 E.四级结构22.螺旋每上升一圈相当于氨基酸残基的个数是 A.4.5 B.3.6 C.3.0 D.2.7 E.2.5 23. 维持蛋白质二级结构的主要化

23、学键是 A.疏水键 B.盐键 C.肽键 D.氢键 E.二硫键24.关于蛋白质分子三级结构的描述，其中错误的是 A.具有三级结构的多肽链都具有生物学活性 B.天然蛋白质分子均有这种结构 C.三级结构的稳定性主要是次级键维系 D.亲水基团多聚集在三级结构的表面 E.决定盘曲折叠的因素是氨基酸残基25. 下列蛋白质通过凝胶过滤层析时最先被洗脱的是 A.马肝过氧化氢酶(相对分子质量) B.肌红蛋白(相对分子质量16900) C.人血清清蛋白(相对分子质量68500) D.牛乳球蛋白(相对分子质量35000) E.牛胰岛素(相对分子质量5733)26.在生理pH 下，下列哪一种是带正电荷的氨基酸 A.半

24、胱氨酸 B.谷氨酸 C.赖氨酸 D.色氨酸 E.缬氨酸27.蛋白质的一级结构及高级结构决定于 A.亚基 B.分子中盐键 C.氨基酸组成和顺序 D.分子内部疏水键 E.分子中氢键28.蛋白质溶液的稳定因素是 A.蛋白质溶液的粘度大 B.蛋白质在溶液中有布朗运动 C.蛋白质分子表面带有水化膜和同种电荷 D.蛋白质溶液有分子扩散现象 E.蛋白质分子带有电荷29.有关血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb) 的叙述不正确的是 A.都可以和氧结合 B.Hb和Mb都含铁 C.都是含辅基的结合蛋白 D.都具有四级结构形式 E.都属于色蛋白类 30.下面哪一种氨基酸是前体掺入多肽后才合成的 A.脯氨酸 B.赖氨酸

25、C.羟脯氨酸 D.谷氨酸 E.丝氨酸31.有一蛋白质水解产物在pH 6用阳离子交换柱层析时，第一个被洗脱下来的氨基酸是 A.Val(pI5.96) B.Lys(pI9.74) C.Asp(pI2.77) D.Arg(pI10.76) E.Tyr(pI5.66)32.经测定，一血清标本的含氮量为10g/L ，那么，蛋白质的浓度是多少 A. 52.5g/L B. 57.5g/L C. 62.5g/L D. 67.5g/L E. 72.5g/L 二、B型选择题(33-52)A.碱性氨基酸 B.亚氨基酸C.芳香族氨基酸D.含硫氨基酸E.含羟基氨基酸33.脯氨酸34.色氨酸35.蛋氨酸36.丝氨酸37.

26、组氨酸A一级结构B二级结构C三级结构D四级结构E超二级结构 38.蛋白质变性，何结构未破坏39.亚基具有几级结构40.有活性的血红蛋白 A.凝胶过滤B.离子交换层析C.亲和层析D.超速离心E.聚丙烯酰胺凝胶电泳41.根据蛋白质的密度与形态来分离蛋白质42.根据蛋白质的生物学特性来分离蛋白质43.根据蛋白质分子量和所携带的电量来分离蛋白质A.胰蛋白酶B.8mol/L 尿素C.溴化氰D.2-巯基乙醇E.过甲酸44.削弱或断裂氢键45.还原二硫键46.水解赖氨酸或精氨酸羧基侧肽键A.盐键 B.二硫键C.肽键D.疏水键E. 3,5-磷酸二酯键47.连接蛋白质一级结构的键为48.连接核酸一级结构的键为4

27、9.在蛋白质分子中谷氨酸和精氨酸侧链之间可形成A.-巯基乙醇B.盐酸胍C.碘乙酸D.SDSE.以上都不是50.能与蛋白质半胱氨酸的-SH反应生成羧甲基衍生物的是51.使蛋白质亚基解聚和变性但不向蛋白质分子中引入负电荷的是52.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时可用作去污剂的是三、答案及题解 1. C评析：组成蛋白质的20种氨基酸中只有半胱氨酸是含有巯基的氨基酸。2.D评析：280nm 波长附近具有最大光吸收峰是色氨酸的一个特点。3. B评析：瓜氨酸不存在于蛋白质结构中，只是参加尿素的合成。4. A评析：组成蛋白质的20种氨基酸中只有甘氨酸不具有不对称碳原子。5. B评析:维系蛋白质一

28、级结构的化学键是肽键。6. C评析:丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸侧链都含有极性的侧链基团，亮氨酸属于非极性疏水性氨基酸。7. B评析:谷氨酸的两个羧基，一个在碳原子上，一个在碳原子上。 8. E评析：天冬氨酸和谷氨酸都是酸性氨基酸，各含两个羧基。9. A评析：组成蛋白质的基本单位是L-氨基酸（除甘氨酸外）。10. E评析：血红素属于铁卟啉化合物，是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素等的辅基。11.B评析：一级结构是空间结构的基础，具有二条以上多肽链组成的蛋白质才具有四级结构。12.B评析：溴化氰专一水解蛋氨酸羧基侧的肽键。13.D评析：选择pH8.6条件下电泳时距离清蛋白的pI6.85最远所以带

29、电荷最多，分离效果最好。14.A评析：丹磺酰氯和2，4-二硝基氟苯做为测 定多肽链N-未端氨基酸的试剂。15.B 评析：蛋白质变性后，由于空间结构破坏因此生物学活性丧失。变性的蛋白质溶解度下降，粘度增加，呈色反应增强，易被蛋白酶消化。16.B评析：蛋白质变性是由于空间构象的改变，而一级结构不改变。17.E评析：片层属二级结构，其形状呈折纸状。在片层结构中，多肽链充分伸展，折叠成锯齿状结构，平行的多肽链之间通过氢键维持稳定。18.E评析：蛋白质定量的测定方法有双缩脲法、紫外吸收法、Fol i n酚试剂法、凯氏定氮法和考马斯亮蓝法等。19.D评析：蛋白质多肽链的方向是从N端往C端方向。20.A评析

30、：血液中的pH为7.2,大于血浆蛋白质的等电点,因此血浆蛋白质在血液中带负电荷。21. B评析：螺旋和片层都属于蛋白质的二级结构。22.B评析: 螺旋每上升一圈相当于氨基酸残基的个数是3.6个氨酸酸残基。23.C评析: 维持蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。24.A评析：一条多肽链组成的蛋白质必需具有三级结构才具有生物学活性，而二条以上多肽链组成的蛋白质有四级结构才具有生物学活性。25.A评析：大分子先被洗脱，因小分子进入凝胶微孔后被洗脱。26.C评析：在生理pH 下，赖氨酸的-氨基带正电荷，谷氨酸侧链羧基带负电荷。本题中其余的氨基酸侧链均不带电荷。27.C评析：蛋白质一级结构是空间结构的基础

31、。蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。28.C评析：蛋白质在溶液中稳定因素是水化膜和电荷。29.D评析：血红蛋白有四个亚基组成具有四级结构，而肌红蛋白只有一条多肽链组成故只有三级结构。30.C评析：羟脯氨酸不直接掺入多肽中。它是在蛋白质合成后或合成过程中经过化学修饰而成的。故它在生物体内没有相应的遗传密码。31.C评析：离子交换剂是通过化学反应将带电基 团引入到隋性支持物上形成的，如果 带电基团带负电，能结合阳离子，称阳离子交换剂，如果带电基团带正电，能结合阴离子，称阴离子交换剂。在pH 6条件下，Asp带负电荷，Lys和Arg带正荷，Val为兼性离子，阳离子交换 剂能吸咐带正电

32、荷的Lys和 Arg，排斥带负电荷的Asp，故Asp第一个被洗脱下来。 32.C评析：因蛋白质含氮量平均为16%，测得含氮量即可计算蛋白质的 浓度。1g 氮相当6.25g蛋白质。33.B评析：脯氨酸由于未端的C与氨基发生环化，比其他的氨基酸上的氨基少一个氢，故为亚氨基酸。34.C评析:色氨酸因含有吲哚环，故为芳香族氨基酸。35.D评析:蛋氨酸因为分子中含有硫和甲基故又称为甲硫氨酸。36.E评析:丝氨酸因为分子中含有羟基故又称为含有羟基的氨基酸。37.A 评析:组氨酸含有咪唑基，在生理条件下可带有正电荷 ，故为碱性氨基酸。38.A评析：蛋白质变性后，空间结构破坏，不涉及一级结构的改变。39.C

33、评析：具有完成三级结构的多肽链称为蛋白质的亚基。40.D评析:血红蛋白是由2个亚基和2个亚基组成的四聚体故有四级结构。41.D评析：不同蛋白质其密度与形态各不相同可用超速离心的方法将它们分开。42.C评析: 根据蛋白质的生物学特性分离蛋白质的是亲和层析法。它是利用配体与待分离物质进行特异性结合而与其它物质分离的方法，所以分离提纯的效率极高。43.E评析:蛋白质在高于或低于其pI 的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳。44.B评析:尿素可破坏维持蛋白质空间结构的次级键。45.D 评析:2-巯基乙醇是还原剂可使二硫键还原

34、。46.A 评析:胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键。47.C评析：蛋白质分子中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构，氨基酸之间是通过肽键连接。 48.E评析:核酸的一级结构是指其中核苷酸的排列顺序。核苷酸之间以.3,5-磷酸二酯键相连。49.A评析:谷氨酸的侧键的羧基可与精氨酸侧键的胍基之间形成盐键。50.C评析:碘乙酸可与半胱氨酸-SH反应,生成羧甲基衍生物,其反应式为:R-SH+ICH2COO- R-S-CH2COO- 51.B评析:6mol/L 盐酸胍是一般蛋白质的变性剂。52.D评析:大约一个SDS分子可与两个肽键反应，使蛋白质带负电荷，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋

35、白质分子量时可用作去污剂。第二章 酶的结构与功能1. 酶的化学本质、结构和特性；2. 酶的作用动力学；3. 酶的作用机理；4. 酶的应用；5. 别构酶、共价调节酶、同工酶的概念、性质、生物学意义。第一节 酶 通 论一、酶的概念 （一）酶的生物学意义 N2 + 3H2 _某些微生物_2NH3 （二）酶是生物催化剂 1酶与一般催化剂的共同点 （1）用量少而催化效率高 （2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生变化 （3）降低反应所需的活化能 例 2H2O22H2O+O2 反 应活化能非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol

36、2酶作为生物催化剂的特殊点 （1）高的催化效率 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。 例 2H2O22H2O+O2 1mol H2O2酶能催化 5106mol H2O2的分解 1mol Fe3+只能催化610-4mol H2O2的分解 转换数（turnover number, TN or kcat）: 每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。 （2）高的专一性（3）温和的反应条件 （4）酶在体内受到严格调控 如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰

37、调节、酶原活化等。 （5）酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关 （三）酶的化学本质 1大多数酶是蛋白质（Most enzymes are proteins） 1926年美国Sumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。 20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。 2某些RNA有催化活性 1982年美国T. Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性 198

38、3年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E. coli tRNA的前体加工。 Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。 3抗体酶（abzyme） 抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。 抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。 1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。 4有些

39、DNA也有催化活性 1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。 （四）酶的组成 1单纯蛋白质酶类 2缀合蛋白质酶类 全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子） 辅酶（coenzyme）：与酶结合比较松弛，可透析除去。如辅酶I、辅酶II。 辅基（prosthetic group）：与酶结合紧密（以共价键结合），透析不能除去，须用化学的方法除去。如细胞色素氧化酶中的铁卟啉。 （五）根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类 1单体酶（monomeric enzyme） 2寡聚酶（oligomeric enzyme） 3多酶复合物（multienzyme complex） 二、酶的命名和

40、分类 1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。 （一）命名 1系统名称（systematic name） （1）标明底物，催化反应的性质 例:G-6-PF-6-P G-6-P异构酶 （2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。 例1： 丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶 例2： 脂肪+H2O 脂酸+甘油 脂肪水解酶 2习惯名称（recommended name） （1）底物 （2）反应性质 （3）底物，反应性质 （4）来源或其它特点 （二）系统分类法及编号 1分类: 6大

41、类酶，氧转水 裂异连2编号: 用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1 Enzyme Handbook， Thomas E Barman编，Vol I, Vol II 1969年。 Enzyme Handbook，Thomas E. Barman编 Supplement I, 1974年。 （三）六大类酶催化反应的性质 1氧化还原酶类（oxido-reductases） 催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。 氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O

42、或H2O2 。例：邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶） 邻苯二酚 邻苯醌脱氢酶类：直接催化底物脱氢 例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶） 2转移酶类（transferases） 催化基团的转移 例：谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸： 酮戊二酸氨基转移酶） 3水解酶类（hydrolases） 4裂合酶类（lyases） 从底物移去一个基团而形成双键或逆反应 例1：例2：5异构酶类（isomerase） 催化异构化反应 例：6连接酶类（ligases, 也称synthetases合成酶类） 将两个小分子合成一个大分子，

43、通常需要ATP供能。 例： 乙酸 + CoA-SH + ATP 乙酰-S-CoA + AMP + PPi在某些细菌中可发生以下反应：半胱氨酸丙酮酸NH3H2S 半胱氨酸去硫氢基酶 CO2NH3H2O氨甲酰磷酸2ADPPi氨甲酰磷酸合成酶I三、酶的分离、提纯及活力测定 （一）酶的分离提纯 1选材 2破碎细胞 3抽提 4去核酸、去多糖 5纯化 6保存 由于酶的特殊性，在纯化过程中要注意 :1全部操作在低温04。 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量-巯基乙醇。 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 步骤酶活

44、力蛋白质浓度比活力总活力(NH4)2SO4 沉淀乙醇沉淀总活力单位体积的酶活力(U/ml)分离溶液总体积(ml)纯化倍数每次比活力/第一次比活力回收率每次总活力/第一次总活力（二）酶活力的测定（P336） 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性）：催化某一化学反应的能力。用一定条件下催化某一化学反应的反应速率来表示。酶活力的测定：单位时间酶催化的化学反应量；或完成一定反应所需要的时间。 1测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed） （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反

45、应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使SE。 2酶活力和比活力表示方式 （1）酶活力（enzyme activity） 酶活力的定义 酶单位的定义：酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U）。1961年国际酶单位（IU），1972年Katal（简称Kat）单位 。习惯上沿用的单位如 :乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。 （2）酶的比活力（specific activity，也称比活性） 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力= 酶活力（U

46、/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。 ） （3）转换数（TN or kcat)：在最适底物浓度时，每分钟或每秒钟每分子酶转换底物的分子数。（4）分子活性（molecular activity）：在最适底物浓度时，每分钟每分子酶转换底物的分子数。（5）催化中心活性（catalytic center activity：每分钟每一个催化中心所转换底物的分子数。3. 酶活力的测定方法 （1）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。 优点：简便、迅速、准确。 一个样品可多次测定，有利于动力学

47、研究。可检测到10-9mol/L水平的变化。 例: 人血清乳酸脱氢酶活力的测定（2）荧光法（fluorometry） 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。 （3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。 P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光吸收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性 （4）电化学法（electrochemical method

48、） 有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度的变化或气体的变化（如O2、CO2、NH3等）。 例: 葡萄糖氧化酶活性的测定 第二节 酶的作用动力学（kinetics）P351 什么是动力学？ 什么是酶作用动力学？一 底物浓度对酶反应速度的影响 1米氏方程的提出 中间复合物学说： 第二步: ESE+P VES 1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程 2米氏方程的推导 基本前提：反应方程式: 在米氏方程推导中引入3个假设: （2） SES ESS E=ES平衡法推导：裂合酶：催化底物移去一个基团而形成双键的反应及其逆反应。连接酶

49、：催化有ATP参与的合成反应。不同之处：1. 裂合酶催化的合成反应不需要ATP的参与，称为合酶。连接酶催化的反应需要ATP参与，称为合成酶。合酶与合成酶的区别。2. 裂合酶催化底物合成双键。稳态法推导： 1925年Briggs和Haldame对米氏方程作了一次重要的修正，提出了稳态的概念。 所谓稳态是指反应进行一定时间后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，亦即ES的净生成速度为零，此时ES的浓度不再改变，达到稳态，也称恒态。稳态法推导要点 推导方法（P357） 结果: 3米氏方程的讨论 （1）SKm时：v= Vmax 符合零级反应动力学。（3） SKm 时：v= Vmax /2。 Km代表反

50、应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。（4）酶被底物饱和的百分数4米氏常数的意义 米氏常数的物理意义 有关米氏常数说明几点 （1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关 （2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该 酶的最适底物。 （3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关，所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。 （4）Km与Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情况下即 k2k3，Km=Ks。在Km=Ks 时，Km可表示酶和底物的亲和力。 5米氏常数的求法 （1）v对S作图 （2）双倒数作图法（Li

51、neweaver-Burk作图法） 将米氏方程改写成 （3）v对 作图（Eadie-Hofstee法） （4） S/v 对S作图（Hanes-Woolf法） （5）直接线性作图法（Eisenthal和Cornish-Bowden法） Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图二 双底物双产物反应（P363） 双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 :有序反应 （orderd reactions）双底物 序列反应（sequential reactions） 随机反应 （random reactions）双产物的反应 乒乓反应（ping pong reactions）1序列有

52、序反应（ordered reactions 写作 ordered Bi Bi） 2序列随机反应（random reactions，写作Random Bi Bi） 3乒乓反应（ping pong reactions，写作uni uni uni uni ping pong or Ping Pong Bi Bi） 三 酶浓度对酶反应速度的影响 1反应速度与酶浓度成正比 SEVE 2V与E 关系的几点讨论 四 pH对酶反应速度的影响 1酶反应的最适pH（optimum pH） 酶的最适pH不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度; 缓冲液的种类、浓度; 酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。例: 碱性

53、磷酸酶催化磷酸苯酯水解时s为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 ； s为2.5x10-2 M，最适pH为10.0 2pH影响反应速度的原因 ( 1 ) pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。 ( 2 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。五 温度对酶反应速度的影响 1最适温度（optimum temperature） 最适温度与最适pH一样，也不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度, 溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。例: 反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。六 激活剂对酶反应速度的影响 什么是激活剂（activator）?酶的激活剂1. 无机离子 （

54、1）一些金属离子，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等。 专一性 有的金属离子可以互相替代 有的离子间有拮抗作用 （2）阴离子：如Cl-、Br-、I-、CN- 等 （3）氢离子 2. 有机分子（1）某些还原剂如Cys、GSH等（2）EDTA3. 具有蛋白质性质的大分子，如酶原可被一些蛋白酶激活，蛋白酶可看作为激活剂。 七 酶的抑制作用和抑制作用动力学 什么是抑制作用（inhibition）?研究抑制作用的意义 1、不可逆抑制作用（irreversible inhibition） E+IEI例: DFP（DIFP）对胰凝乳蛋白酶的抑制 2、可逆抑制作用(reversible inhibition)及其动力学 （1）竞争性抑制作用（competitive inhibition）