实时定量PCR步骤(详细)

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1、半定量和实时定量 PCR 步骤实验原理：RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起， 提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。 RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。 另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建 cDNA 文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及 S1核酸酶分析在内的 RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总 RNA或poly（A）+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、 oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一

2、步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。 cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进 行PCR。在一步法 RT-PCR中，逆转录和 PCR在同时为逆转录和 PCR优化的条件下，在一只管中顺次进 行。实验步骤：Trizol 法 RNA 提取步骤1、提取总 RNA2、逆转录反应3、 PCR 反应以下实验步骤仅供参考：1 样品 RNA 的抽提 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15秒 后，15到30C孵育2到3

3、分钟。4C下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿 相，中间层以及无色水相上层。 RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60% 。 RNA沉淀将水相上层转移到一干净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA ,混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的 RNA沉淀将在 管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗 RNA沉淀。混匀后，4C下70

4、00rpm离心5分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥 5-10分钟。 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无 RNA酶的水40 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA溶液保存于-80 C待用。2 RNA 质量检测1 ）紫外吸收法测定先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后，读取其在分光光 度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 gRNA/ml。样品RNA浓度（/ml）计算公式为：A260 稀释倍数X40 g/ml。具 体计

5、算如下：RNA 溶于 40 kDEPC 水中，取 5ul, 1:100 稀释至 495 /I 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度=0.211 区0 猱0 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/ k取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为：35 k 冷.84 g/口 肚=29.4 g / 纯度检测RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8到 2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C, 10 ml的10 XMOPS电泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液（12.3 M）

6、。10 MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4M MOPS , pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25止溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1 WOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 准备RNA样品取3RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加 EB于甲醛上样染液中至终浓度为10/ml。加热至70C孵育15分钟使样品变性。 电泳上样前凝胶须预电泳 5min，随后将样品加入上样孔。5 -6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2 -3cm。 紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种

7、类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA （tRNA和5S核糖体RNA ）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由 mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现 DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更 高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成 反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量1逆转录buffer2(115逆转录MMLV0.5 112上游引物0.2 116DEPC 水5 113下游引物0.2

8、117RNA模版2 114dNTP0.1 118总体积10 1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70C干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5卩,1 37 C水浴60分钟。 取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80C待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（3-actin ）实时定量PCR 3-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3 胺10倍稀释（加水27卩并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 反应体

9、系如下：标准品反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 115Taq酶1 112阳性模板上游引物 F0.5 116阳性模板DNA5 113阳性模板下游引物 R0.5 117ddH2O32.5 114dNTP0.5 118总体积50 11轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 口15Taq酶1 (112内参照上游引物F0.5 卩16待测样品cDNA5 113内参照下游引物R0.5 卩17ddH2O32.5 114dNTP0.5 卩18总体积50 11轻弹管底将溶液混合，6000

10、rpm短暂离心。 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93 C 2分钟，然后93C 1分钟，55C 2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量序号反应物剂量110 XPCR缓冲液2.5 ul5dNTP混合液3 112MgCI 2溶液1.5 116Taq酶1 113上游引物F0.5 117cDNA1 114下游引物R0.5 118加水至总体积为25 11轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94 C 1分钟；55C 1分钟；72 C 1分钟

11、）； 72oC延伸5分钟。 PCR产物与DNA Ladder在2 %琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增 条带。 将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1X1O10,依次 稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量PCR所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 115Taq酶2 112上游引物F1 116待测样品cDNA5 113下游引物R1 117ddH2O30 114dNTP1

12、118总体积50 11轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于 Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为： 93C 2分钟预变性，然 后按93C 1分钟，55C 1分钟，72C 1分钟，共40做个循环，最后 72C 7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0 ,并遵循以下原则：弓I物与模板的序列紧密互补；弓I物与引物之间避免形成 稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。PCR实验步骤一、组织抽提：1. 取组织块50-100嗎用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻

13、璃匀浆器加入 1ml Trizol 抽打匀浆3. 移入 1.5ml 新离心管用 5 ml 针头抽打4. 冰上孵育 5 分钟5. 离心12,000g 4 C 5 分钟 取上清液移入 1.5ml新离心管6. 加 0.2 ml 氯仿，震荡，冰上孵育 5 分钟7. 离心12,000g 4 C 10分钟 取上层液相移入1.5ml 新离心管8. 加 0.5 mI 异丙醇，震荡，冰上孵育 5 分钟9. 离心12,000g 4 C 5 分钟 弃去上清液10. 加入 1 ml 75% 乙醇，震荡11. 离心7,500g,4C ,5分钟 弃去上清液12. 室温下使之变透明13. 加入DEPC处理水10卩l -35

14、卩l溶解RN（ 可 保存在液氮或低温冰箱）走RNA变性电泳观察18s , 28s条带，分光光度 计检测260/280吸光度比值，计算 RNA浓度二、RT反应体系RT 反应体系（第一步）：约 20 分钟RNA抽提物 5 卩IRadome引物 2 卩IRNA sin 0.5卩 l1. 65C 15 分钟2. 立即放入冰浴RT 反应体系（第二步）：约 2 小时RNA sin 0.5卩 l10mM dNTP11l5X RT 缓冲液41l25mM MgCl241lAMV 逆转录酶31l1.37 C 1.5 小时2. 94 C 5 -10 分钟3. 反应物保存于-20C或进行PCR三PCR反应体系1）、P

15、CR反应体系：约4.5小时25mM MgCl221lCDNA 莫板2.51l10X PCR缓冲液51lddH2O341l10mM dNTP11lTaq 酶0.51l上下游引物 10pmol/ 1l 2.51lX2轻质石蜡油501l10011.94 C 2 分钟，55C 1分钟，72 C 2分钟为第一个步 1 个循环2.94 C 45 秒，55C 40秒，72 C 1分钟 为第二步30 个循环3.72 C 10 分钟4.取出后4C 5分钟后-20C保存或走电泳2）、PCR反应体系：约5 小时25mM MgCl2 31 lCDNA模板5i l10X PCR缓冲液51lddH2O301 l10mM

16、dNTP11lTaq 酶11 l上下游引物 10pmol/ 1l2.51 lX2轻质石蜡油501 l10011.94 C 2 分钟，55C 1分钟，72 C2 分钟 为第一个步 1 个循环2.94 C 45秒，50C 40秒，72C 1分钟为第二步40个循环3. 72 C 10 分钟4. 取出后4C 5分钟后-20C保存或走电泳四、电泳：约 1.25 小时5. 放入梳子，浇板，待凝固6. 加8卩l PCR反应产物+2卩l溴酚兰7. 电泳 50-80V （每cm 5V）1. 配0.5 X TBE电泳缓冲液 300 ml2. 胶浓度 1.7% （40ml 0.5 X TBE 力口 0.68g 胶）3. 微波炉中火 2分钟溶解胶4. 冷却至60C加入溴乙锭 2卩l （10mg/ml的终浓度0.5g/ml )