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1、货号：MS2608规格：100管/96样山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase , SDH试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：SH （EC1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。测定原理：SH催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原 NAD生成NADH测定340nm吸光度增加速率可以 计算SH舌性。自备实验用品及仪器：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制：提取液：液体100mL<1瓶，4C保存；试剂一：液体10m&l
2、t;1瓶，4C保存；试剂二：粉剂< 1瓶，4C保存；粗酶液提取：1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL为5001000: 1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超 声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或200Vy超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4C 离心10mi n,取上清，置冰上待测。2、组织：按照组织质量（g）:提取液体积（mL）为1： 510的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4C离心10min,取上清，置冰上待测。3、血清（浆）样
3、品：直接检测。测定步骤：1、 分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至340nm蒸馏水调零。2、样本测定（1）在试剂二中加入7.6mL试剂一和11.4mL蒸馏水充分溶解，置于37C （哺乳动物）或25C （其它物种）水浴5min；用不完的试剂4C保存一周；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10卩L样本和190卩L试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2,计算 A=A2-A1SH活性计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）SH活力的计算单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。S
4、H（nmol/min/mL） = A<V 反总十（& <d）< 109十V 样十T=1608< A2、 组织、细菌或细胞中SDKS力的计算：（1）按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SH( nmol/min /mg prot)= AXV 反总 *( & x d)x 109宁(V 样 x Cpr)宁 T=1608X A A* Cpr( 2)按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SHnmol/min /g 鲜重)=A AXV 反总 * ( &a
5、mp; x d) x 109 * (WX V样* V 样总)* T=1608x A A*W( 3)按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SHnm ol/min /104cell )= A AXV 反总* (& x d) x 109 * (500 XV 样*V 样总)* T=3.216 x A A V反总：反应体系总体积，2x 10-4 L ; £ : NADH摩尔消光系数，6.22 x 103 L / mol /cm ; d: 比色皿光径，1cm V样：加入样本体积，0.01 mL V样总：加入提取液体积，1
6、 mL T:反应 时间，2 min ； Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL； W样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、血清(浆)SH活力的计算单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SH(nm ol/min /mL ) = A AxV 反总*( £ x d)x 109 *V 样* T=3216x A A2、组织、细菌或细胞中SH活力的计算：(1) 按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SH (nm ol/mi n /mg prot
7、) = A AxV 反总 *( £ x d)x 109 * (V 样x Cpr) * T=3216x A A* Cpr(2) 按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SHnm ol/min /g 鲜重)=A AxV 反总* ( £ x d) x 109 * (Wx V 样*V 样总)* T=3216x A A*W(3) 按细菌或细胞密度计算：单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。SHnm ol/min /104cell )= A AxV 反总 * ( £ x d) x 109 * (500 XV样*V样总)* T=6.426 x A A V反总：反应体系总体积，2x 10-4 L ; £ : NADH摩尔消光系数，6.22 x 103 L / mol /cm ; d： 96孔板光径，0.5cm； V样：加入样本体积，0.01 mL; V样总：加入提取液体积，1 mL; T: 反应时间，2 min ； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL W样本质量，g； 500:细菌或细胞总数， 500万。第1页，共2页
山梨醇脱氢酶(sorbitoldehydrogenase,SDH)试剂盒说明书
