高原鼠兔微卫星富集文库构建与引物筛选

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1、硕士学位论文高原鼠兔微卫星富集文库构建与引物筛选 指 导 教 师 申 请 学 位 级 别 学科专业名称 动物学 论 文 提 交 日 期 论文答辩日期 培 养 单 位 学 位 授 予 单 位 Dissertation of Master Degree,Northwest Institute of Plateau Biology, CASGraduate School of the Chinese Academy of SciencesDecember, 2007, Xining, Qinghai, ChinaConstruction of enriched microsatellite libr

2、iaries of plateau pika and isolation of lociKexin Li (Zoology)DirectedByProfessor Yanming Zhang目录中文摘要本研究采用分子生物学技术构建了高原鼠兔微卫星富集文库，并筛选出一套多态性较高的微卫星标记。该标记可对高原鼠兔个体间进行准确的身份鉴定，进而，为探讨高原鼠兔婚配制度、迁移扩散以及种群遗传多样性保持机制奠定了基础。根据生物素与链霉亲和素的强亲和性原理，用链霉亲和素包被的磁珠亲和捕捉与生物素标记的14种微卫星寡核苷酸探针退火结合的含有接头和高原鼠兔微卫星序列的单链DNA片段，获得单链目的片段，经PCR

3、扩增形成双链，然后连接到pMD18-T载体上，转化至高效感受态细胞DH10B中，成功构建出高原鼠兔基因组微卫星富集文库。测序结果发现，阳性克隆率为73.4%，说明构建的高原鼠兔基因组微卫星富集文库为一高质量的文库。从构建的微卫星文库中挑取克隆提取质粒进行测序，根据其侧翼的保守序列设计出120对引物，经过PCR扩增和STR扫描，最终筛选出13对多态性好的微卫星引物适合进行微卫星分析。在48个样本的13个微卫星位点上,等位基因的数目从6到16不等,等位基因的大小分布在147bp到302bp之间。对这些位点进行遗传学分析，发现这些微卫星的PIC值从0.598至0.870，说明这些位点的多态信息含量较

4、高，达到了进行种群遗传学分析的要求。微卫星富集文库的建立以及引物的筛选将为高原鼠兔亲缘关系鉴定和基因流动模式研究提供大量的微卫星标记。关键词：高原鼠兔；微卫星；富集文库；多态性；等位基因7AbstractThe enriched micresatellite libraries of plateau pika were constructed and a suit of high polymorphic loci were isolated. The relationship among individuals within a family will be determined exactl

5、y using this marker suit. Furthermore, this will contribute to determine mating pattern, migration and dispurse and maintain of high genetic diversity.The microsatellite enriched library of plateau pika was constructed according to the strong affinity between biotin and streptavidin. First, genome D

6、NA was cut up by using ultrasonicator which was innovation of our methods. Then the liker-ligated DNA fragments were annealed to biotinylated microsatellite oligo-probe, so microsatellite repeats can be captured by streptavidin-coated magnetic beads，PCR amplification was performed to obtain double-s

7、tranded targeted fragments and ligated into pMD18-T vector and electransformed into DH10B competent cell. The sequencing results showed that 73.4% of clones contained microsatellite indicating a high degree of microsatellite enrichmentPlasmids were extracted from the clones and sequenced, then 120 p

8、airs of primers were designed. After amplification and STR scanning, we get 13 pairs of polymorphic primers that can be used in microsatellite analysis. The number of allele ranges from 6 to 16 at 13 locus on 48 samples, the size of the allele is between 147bp and 302bp, and the PIC value is between

9、 0.598 and 0.870 which indicates high polymorphic information content and can be used in population genetics study. The construction of microsatellite enriched library of plateau pika and the characterization of the locus will provide us with lots of microsatellite markers in population genetics stu

10、dy such as parantage determination and so on.Key words：plateau pika; microsatellite; enriched libraries; polymorphism; allele；目录第一章前言11.1 分子标记主要类型、原理与特点11.2 微卫星概述31.2.1 微卫星起源与特征31.2.2微卫星的分布51.2.3 微卫星的优势51.2.4 微卫星的突变机制61.2.5微卫星突变的理论模型61.2.6 微卫星的应用71.2.7 微卫星DNA标记的局限性7第二章材料与方法92.1试剂与仪器设备92.1.1 主要试

11、剂及配制92.1.2 主要仪器及设备112.2 实验流程122.2.1 实验动物122.2.2 微卫星富集文库构建流程图122.2.3 组织取样、保存与基因组提取132.3 超声打碎基因组DNA142.4 DNA末端补平142.5 沉淀浓缩DNA，胶回收142.5.1 沉淀浓缩DNA142.6 连接接头162.7 检测连接效果162.8 杂交172.9 富集172.10 PCR扩增18211 插入片段与载体的连接182.12 Millipore 膜纯化182.13 电转化与涂板182.13.1 电转化流程182.13.2 电击杯的清洗过程192.13.3 注意事项19214 挑克隆培养与质粒提

12、取202.14.1 碱裂解法原理202.14.2 质粒提取202.15 质粒测序202.16 拼接与设计引物212.17 初步筛选多态性的微卫星引物222.17.1 PCR 扩增222.17.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳222.18 筛选并荧光标记多态性好的引物232.19 数据处理24第三章 结 果253.1 基因组提取结果253.2 基因组超声结果253.3 超声片段回收结果263.4 本试验选用的接头序列263.5 生物素标记的探针序列273.6 各探针两次杂交时不同的杂交温度293.7 微卫星富集文库构建结果293.8 基因型判读结果293.9引物筛选统计结果30第四章讨 论324.1实验方

13、案的分析324.1.1 获得微卫星的途径324.1.2 破碎基因组DNA的方法254.1.3 对超声片段大小的选择254.1.4 转化方法的选择254.1.5 富集次数的优化264.1.6 PCR次数的优化264.1.7 探针种类的选择264.2 实验条件分析264.2.1 样品的采集与保存264.2.2 PCR反应条件274.2.3 电泳284.2.4 凝胶染色294.3 对实验结果的分析294.3.1 对文库质量的分析294.3.2 对引物序列质量的分析30参考文献40个人简历及发表文章目录44致 谢42学位论文原创性声明42前 言 第一章前言高原鼠兔（Ochotona curzoniae

14、）是青藏高原特有的植食性小哺乳动物（张堰铭等，2005；曲家鹏等，2007）。该动物在高寒草甸生态系统的食物链中起着重要作用，同时也是加剧草地退化最主要的物种之一。由于高原鼠兔婚配制度呈现多种模式，当年出生幼体具有很强的恋巢性，两性个体均参与迁移（Dobson等，1998），因此，被认为是研究动物种群遗传学的理想模型。微卫星标记是种群遗传学研究最主要的手段之一，可详细分析和探讨高原鼠兔种群遗传结构、婚配制度、亲缘关系以及基因流动模式等问题，进而在分子水平上揭示其适应高寒环境的行为学和遗传学机制。1 文献综述分子标记(molecular marker)是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来

15、的可直接反映生物体在DNA水平上差异的一类新型的遗传标记(方宣钧等, 2001)。20世纪70年代以后人们开始应用分子生物学技术进行种群生物学研究，等位酶是最早使用的遗传标记。虽然等位酶在历史上曾为种群遗传和行为生态学研究提供了巨大的支持，但也遇到了巨大的挑战，因而已经退出历史舞台。与其他标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：（1）直接以DNA的形式表现，稳定性高；（2）遍布整个基因组，具有极大的丰富性；（3）多态性高，变异类型丰富，如插入，缺失，替代等。（4）表现为中性，不受自然选择的影响；（5）许多为共显性遗传，进而区别纯合体和杂合体。目前，分子标记已广泛用于遗传图谱的构建；遗

16、传多样性分析；基因定位；分子标记辅助等研究。1.1 分子标记主要类型、原理与特点 （1） RFLP又称DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism， RFLP)。1980年RFLP被提出后就开创了应用DNA多态性作为遗传标记的新阶段。其基本原理是：含有相同酶切位点的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量大小不同的同源等位片段，通过电泳等方法可以分离检测这些片段。凡是可以引起酶切位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生

17、变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。 RFLP标记的主要特点有：（1）数量多，几乎遍布整个基因组；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性遗传，能够区分纯合子和杂合子；但是需要大量DNA样品，检测技术繁杂，难以用于大规模进行。（2） RAPD 又称随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA ）。其基本原理与PCR技术一致。PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种体外快速扩增核苷酸序列的方法，其原理与细胞内的DNA复制过程相类似。该技术是在细胞外建立反应体系，在较高的

18、温度下（通常在90-94摄氏度下）进行双链变性，以解开的单链DNA做为模板，在适当的退火温度下，加入的引物与模板的特定区域相结合，在聚合酶的作用下，反应体系中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）被相应地加入到相应位置从而形成新生链。由于每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，所以在此过程中，DNA数量呈现几何级数增长，经数个循环后，就能将痕量的DNA片段扩增数百万倍。RAPD标记技术就是用随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后通过凝胶电泳分离扩增片段。如果基因组DNA在特定的引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点发生相应的变化，导致PCR

19、产物增加、缺少或发生分子量变化，形成RAPD标记。 RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）除极少数共显性外，其它均为显性遗传，因此不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射自显影等技术；（4）仅需要少量的DNA样品，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。   （3）AFLP 又称扩增片段长度多态性（Amplification Fragment Length Polimorphism）该技术是RFLP的改进型，结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型

20、少、信息量小以及RAPD技术不稳定等缺点。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段而产生的扩增产物的多态性。其基本技术原理是：首先采用限制性内切酶酶切基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性酶切片段后；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在凝胶上分开，为此在引物的3 端 加入1-3个选择性碱基，使那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合成为模板，扩增后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异性的扩增产物分离。从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的。 AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶

21、及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辨率高，结果可靠； （4）SNP（single nucleotide polymorphism, 单核苷酸多态性）是第三代的分子标记，主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。引起核苷酸变化的原因主要有替代，插入和缺失（in/del）等，而替代又分为转换(transition)和颠换(transversion)。由于转换和颠换更容易发生，因而也是S

22、NP的主要产生原因。核苷酸是DNA的基本单位，而碱基是核苷酸的组成单位，当某一核苷酸内的单个碱基发生了变异，就会导致整个核苷酸的变异，进而造成DNA排列顺序的改变。 理论上讲，DNA链上的某一核苷酸可以呈现出四种碱基中的任何一种，即最多可有四多态性，但实际上，并没有发现四等位多态性，三等位多态性几乎也可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的SNP。虽然等位基因数目少，但数量庞大，因而也可以应用于种群生物学分析。SNP具有一下特点：1、SNP数量多，分布广泛。2、SNP适于快速、规模化筛查。3、SNP等位基因频率的容易估计。4、易于进行基因分型。1.2 微卫星概述1.2.1

23、微卫星起源与特征20世纪60年代，在氯化铯密度梯度离心中，发现一小部分DNA的浮力密度曲线带与主DNA带发生偏离，这小部分DNA属于串联重复序列，被称为卫星DNA。1981年，在球蛋白的等位基因研究中发现了以TG为单元的串联重复，称为微卫星(Miesfeld et al., 1981; Spritz ,1981)。又称为短串联重复序列（short tandem repeats STRs）或简单序列重复（simple sequence repeats）。微卫星是一类由几个（多为1-6个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，由核心序列和两侧的侧翼序列所构成。侧翼序列使微卫星特异的

24、定位于染色体某一部分，核心序列中的重复单位（16bp）发生若干次重复，使整个核心序列达到几十至几百个碱基对。由于重复次数的不同以及重复程度不一致而造成这些序列的多态性（Ashley and Dow,1994），这一变异性正是SSR标记产生的基础。根据Webber 1990年提出的标准，微卫星的重复类型可以分为：单一型（perfect）如：CACACACACACA；复合型（compound）如：CACACACATGTGTGTGTG；间断型（intersperse）如：CACACACATTCACACACAC；重复序列在基因组中相当丰富，尤其是真核生物，其中比较重要且特殊的是核苷酸的串联重复序列。不

25、同的微卫星按其具有碱基重叠和互补的重复单元归为一种，例如（A）n序列和（T）n序列是等效的，同理(AC)n 与(CA)n、(TG)n、(GT)n也是等效的，应该兼并为同一类型的微卫星序列（Mukund V. Katti,2001）。由于微卫星的广泛使用，我们对它的突变行为，功能进化及其在不同物种基因组中分布的认识提高得很快。通常情况下，某一微卫星位点上等位基因长度在5到40个重复单位的范围内变动，但是也可能会出现更多重复的长链。2，3，4核苷酸的重复，是应用于分子遗传学的最常见最普通的选择，而2核苷酸重复是大部分物种中的最常见的重复单位，单核苷酸重复是最不可靠的，因为它在扩增时会遇到麻烦，更长

26、的重复类型也很少见，而且检验他们进化的数据也很少(Kimberly A. Selkoe and Robert J. Toonen,2006) 。 微卫星位点周围的DNA被称为侧翼区。因为侧翼区的序列在相同物种的不同个体之间甚至不同物种之间是高度保守的，一个特定的微卫星位点可以通过它的侧翼序列进行鉴定，我们可以设计短链DNA又称寡核苷酸或者引物，让他结合在侧翼区通过PCR反应引导微卫星位点的扩增。1.2.2微卫星的分布微卫星在原核和真核生物基因组中广泛存在，它分布于整个基因组的不同位置，包括编码区和非编码区，存在于编码区的微卫星会导致蛋白序列的重复（Mukund et al. ,2001）进而导

27、致某种疾病的发生。最容易出现在编码区的微卫星是3核苷酸和6核苷酸重复，因为他们不会引起读码框滑动。有人发现除(AT)n以外的含A丰富的微卫星（如AG、AAG、AAAC和AAAG等）在多数真核生物基因组内数量都较多，这可能与它们来源于polyA结构有关。微卫星的重复单位以23个核苷酸为主，也有一些微卫星的重复单位为1个核苷酸，而4个或4个以上的就很少见。微卫星序列以不同的丰度普遍存在于各种生物基因组中，微卫星的平均密度在不同分类群的物种之间以及同一分类群的不同物种之间差异很大，甚至在同一物种的不同染色体上微卫星密度也存在很大差异（Mukund et al. ,2001）。在真核生物中其发生频度明

28、显高于根据碱基组成预测随发生的频度(Epplen et al., 1993; Tautz and Renz, 1984)。真核生物内有大量微卫星序列的存在可能成为其进化优势和生物多样性的分子基础(Kashi et al., 1997; Wren et al., 2000)。不同物种微卫星的出现频度和平均长度相差悬殊，人类基因组中微卫星序列的比例占到3%，而大鼠和小鼠的微卫星出现频度是人的两倍。1.2.3 微卫星的优势自微卫星被提出以后，由于其巨大的优越性，就广泛被应用于种群遗传学与行为生态学等领域。微卫星的优越性主要体现在以下几个方面：1、取样简单。由于微卫星是以PCR为基础的，而PCR仅需要

29、痕量的样本即可以进行扩增，因此可以对研究物种进行非损伤性取样，且样本保存简单，放在95%的乙醇中常温保持即可。由于微卫星序列一般较短，因此降解的DNA仍可作为模板进行扩增。2、位点信息含量丰富。由于微卫星突变速率较快，每一次插入缺失或替代均可产生新的变异，较高的变异率导致了较高的等位基因多样性。因此，可为种群遗传学研究提供强有力的工具。3、样品检测容易。由于微卫星的多态性是以等位基因的长度来体现的，因而，扩增后的等位基因可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或荧光扫描进行基因分型。4、呈现共显性遗传，能够鉴别纯合子与杂合子。 1.2.4 微卫星的突变机制从进化角度上讲，微卫星的发生，成长和死亡是一个动态的

30、过程，每一次突变都会导致微卫星的增长或缩短（Subbaya，et al.,2003）, 不同类型的突变使微卫星的多态性在进化角度上处于一个平衡状态。最近的研究表明，随着微卫星长度的增加，微卫星更倾向于发生长度减少的突变(Xu et al.，2000),较长的等位基因突变为更短的的等位基因，从而阻止基因的无限增长(Ellegren 2000)。微卫星序列区域的突变速率明显高于其他区域，主要可以通过DNA滑链错配（replication slippage）和DNA重组（recombination）两个突变机制来解释(Henderson and Petes, 1992)。对大肠杆菌和酵母的研究显示，

31、微卫星序列发生复制时，新生链和模板链经常会有短暂的解链现象，在两条链重新通过碱基配对结合时容易发生错误配对，如突出的环出现在新产生链上，将导致微卫星序列变长，相反，出现在模板链上时，则使微卫星序列变短。1.2.5微卫星突变的理论模型 当前被广泛应用的基因突变模型为无限等位基因模型（infinite allele model IAM），在该模型中，每次突变事件都会产生一个新的等位基因，且新等位基因大小与亲代等位基因无关（Wright, 1939; Kimura and Crow, 1964）。这种突变可以通过电泳检测到。经验研究表明，实际的模式较逐步突变模型更接近于无限等位基因模型，（Li, 1

32、976；Ramshaw et al., 1979，Fuerst and Ferrel, 1980）。无限等位基因模型已经成为解决种群遗传学分析的首选模型。多数微卫星突变进化的模型由SMM（stepwise mutation model）(Ohta and Kimura, 1973)衍生而来的。在该模型中，等位基因用核苷酸的数目表示，一个突变是设想增加或减少了一个单位的等位基因大小或状态，而且在该模型中，微卫星突变以固定的速率增加或减少(Kimmel and Chakraborty, 1996; Kimmel et al., 1996; Shriver et al., 1993; Valdes

33、et al., 1993)。目前认为，基因组内微卫星长度分布来源于微卫星长度改变和点突变的平衡(Bell and Jurka, 1997; Kruglyak et al., 1998)。也有不少学者对这些模型提出了质疑（Shriver et al., 1993，Di Rienzo et al.,1994）。实际的情况应该介于两个无限等位基因模型之间。1.2.6 微卫星的应用虽然微卫星是一种高频变异序列，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。微卫星两端的侧

34、翼序列在生物的基因组中特别是在具有高度近缘关系的物种间具有不同程度的保守性，这种保守性以及物种间某些染色体区段的共线性使得种间扩增成为可能。SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）高度多态；（3）中性标记，在多数情况下，微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对生物个体的有害或次级效应。（4）共显性标记，微卫星标记遵循孟德尔遗传法则，呈共显性遗传，因此能很好地区分纯合子与杂合子。（5）实验重复性好，检测容易；（6）它以PCR为基础，可以用痕量非损伤性取样。（7）通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨率高，可检测出单拷贝差异等。正是由于这些特点，这一技术很快便发展为一种分子标

35、记（何平，1998），并在自然种群的许多研究中得到了广泛应用（孙梅，1999）。如个体间亲缘关系鉴定与家系标识，生物遗传作图、群体遗传研究等方面（Dib C et al.,1996）。1.2.7 微卫星DNA标记的局限性虽然多态性的微卫星引物在种群遗传学研究中得到了广泛应用，但是也遇到了很大的挑战。1、跨种扩增困难。用微卫星进行亲缘关系鉴定的基础是PCR，对物种个体进行基因扩增时需要特定的引物序列，而且引物结合域必须没有变异或者变异很少以避免在不同个体间扩增时引起差异。然而，不同物种微卫星的侧翼序列常有所不同，这就使得一些特定物种的引物很难进行跨种扩增。2、无效等位基因现象。无效等位基因就是指

36、某一微卫星位点的等位基因通过多次PCR扩增仍未达到检测水平的基因（EE Dakin and JC Avise，2004）。另外，引物结合部位的点突变、插入或缺失都可能导致微卫星扩增失败。3、隐性等位基因多态性现象。微卫星在鉴定亲缘关系时是根据扩增片断长度进行基因分型的，这个特点决定了只有长度不同的等位基因才能被检测出。但事实上来源不同而长度相等的等位基因却很常见。目前针对微卫星的研究普遍是基于等位基因之间的差异只是重复次数不同的假设，通过使用与重复序列两端的侧翼序列配对的引物进行PCR扩增，再经电泳分离不同等位基因。但是，该方法没有真实反映出微卫星位点在DNA序列上的变异。本研究发现，如果仅通

37、过STR扫描，单一型的微卫星和间断型的微卫星有时根本无法区别。另外，可能出现同源异型(微卫星重复序列相同，但PCR产物长度不同)或者是异源同型(微卫星重复序列不同，但PCR产物长度相同)。因此，单纯使用PCR产物片段进行研究可能得出错误结果。同型异源会使种群等位多态性降低，并且当突变率较高的时候，容易高估种群的基因流动(Garza and Freimer, 1996; Rousset 1996;Viard et al., 1998; Blankenship et al., 2002; Epperson, 2005)。材料与方法第二章材料与方法2.1试剂与仪器设备2.1.1 主要试剂及配制Taq

38、 DNA聚合酶、10×buffer、MgCl2、dNTP均购自Takara公司；RNA酶自制、DL2000Markers购自天根公司；6上样缓冲液购自华美公司；琼脂糖（Agarose）：Spain生产，生化试剂；蛋白酶K（Proteinase K）：Merke原装；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺（APS）、TEMED、硼酸、甲醛、TrisCl饱和酚（PH8.0）、氯仿、异丙醇、醋酸钠等均为国产分析纯；组织裂解液组分：（Tris 50mmol/L，EDTA 100mmol/L，NaCl 100mmol/L，SDS 0.5%；Tris-HCl 贮存液（1mol/L PH8.0）：12

39、.1g Tris，溶于80ml水中，加4.2ml左右浓盐酸，调节PH值至8.0，定容到100ml，分装后高压灭菌；EDTA贮存液（0.5mol/L PH8.0）：在80ml水中加入18.61g EDTA-Na2·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌；用NaOH（约2g）调PH至8.0；定容至100ml，分装后灭菌；10×TBE缓冲液：500ml水中加入108g Tris、55g硼酸、9.3g的Na2EDTA，加水定容至1000ml；20×SSC缓冲液组分：3M NaCl，0. 3M NaCitrate 在500ml水中加入175.5g NaCl，88.0g NaCit

40、rate（294.1g/Mol），纯水定容至1L，高压灭菌；20SDS：把200gSDS 溶解至500ml水中，纯水定容至1000ml；杂交富集缓冲液组分：6×SSC ，0.1%的SDS 300ml20×SSC，5ml 20SDS纯水定容至1000ml；NaCl：5M ，292.2g NaCl (58.44 g/Mol)溶解在500ml水中，纯水定容至1L；结合与洗脱缓冲液组分：10mM Tris，（PH7.5）1.0 mM EDTA，1M NaCl 在500ml水中加入10ml1M Tris，2ml 0.5M EDTA，200ml 5M NaCl ,纯水定容至1000ml

41、，分装高压灭菌；TE缓冲液组分：10mM TrisHCl，（PH=8.0），0.1 mM EDTA（PH=8.0） 将10ml1M Tris（PH8.0），0.2ml 0.5M EDTA 加入到500ml水中，纯水定容至1000ml，分装高压灭菌；2×SSC，0.1% SDS：把100ml 20×SSC, 5ml 20SDS 用纯水定容至1000ml；1×SSC，0.1% SDS：把50ml 20×SSC, 5ml 20SDS 用纯水定容至1000ml；BW Buffer（10mM Tris（PH7.5）；1.0mM EDTA；1MNaCl）；SOC:

42、酵母粉5g ，胰蛋白胨20g，NaCl 0.58g，KCl 0.187g，MgCl2 2.03g，MgSO4 4.92g，Glu 3.76g，纯水定容至1000ml，高压灭菌；LB固体培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl 8g，琼脂粉 15g，纯水定容至1000ml；X-Gal（20mg/ml）：X-Gal 1g，用二甲基甲酰胺定容至20ml；IPTG（200mg/ml）：IPTG 2.5g ，用纯水定容至10ml； 杂交液组分：0.25M Na2HPO4 PH7.2，7% SDS，1 mM EDTA PH8.0，1%BSA 250ml 1M Na2HPO4，（141.96g/mol）

43、，350ml 20SDS，2ml 0.5 M EDTA，10g BSA 纯水定容至1000ml；溶液的配制：1.0M TrisHCl（PH8.0）50ml，稳定DNA质粒； 0.5M EDTA（PH8.0）20ml，抑制Danes降解作用；用纯水定容至1000ml，此溶液的PH 要求是8.0；0.4NNaOH的配制：16gNaOH（分子量40）用纯水定容至1000ml；作用是使染色体DNA和质粒DNA变性PH<9,核酸稳定；1.8%SDS的配制：18gSDS（分子量288.4）用纯水定容至1000ml；破坏膜，解聚核蛋白以及形成蛋白质变性复合物以利于沉淀；溶液的配制：乙酸钾（分子量98.

44、14）294.42g和冰乙酸（分子量60.05）115ml，cha-Cha缓冲液，使变性的质粒复性并稳定存在；高盐 3mol/L kick有利于变性的大分子染色体DNA、RNA及SDS-复合物凝聚而沉淀之.纯水定容至1000ml，PH在4.8-5.2；3MNaAC 配制：先把40.824gNaAC （分子量136.08）溶解在水中，再用纯水定容至100ml；6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；40%丙烯酰胺贮存液：190g丙烯酰胺，N,N-亚甲基双丙烯酰胺，溶于300ml水中，37搅拌溶解，加水定容至500ml，装入棕色瓶中4条件下保存；GoldViewTM核酸染料，北京赛百胜

45、基因技术有限公司；2.1.2 主要仪器及设备DYCZ-24B型垂直板电泳槽、DYCP-31D型水平电泳槽、DYY-6C型稳流稳压电泳仪、WD9403C型紫外分析仪，北京六一仪器厂；SBH-循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；MIR-262恒温箱，SANYO电子生物医学有限公司；D37520大离心机，SORVALL公司；HCTP11B.10架盘药物天平，北京医用天平厂；GeneAmp PCR System 2700型PCR扩增仪，ABI公司；FA2004电子天平，上海天平仪器厂；TP-313 DENVER精密电子天平，美国丹佛仪器公司；JB-90-2 型定时恒温磁力搅拌器，上海天平仪器厂

46、；TY-80S 型脱色摇床，南京新校园生物技术研究所；HHS-4S 型电热恒温水浴锅，北京方通达科技有限公司；XW-80A 型旋涡混合器，上海青浦沪西仪器厂；TGLL-18K 型台式高速冷冻离心机，太仓华美生化仪器厂；BC/BD-518A 型冰箱，青岛海尔；BD-326 卧式冷冻柜，青岛海尔；101A-2型干燥箱，上海市实验仪器总厂；PHS-3C型精密PH计，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；各量程移液器， eppendorf公司；DYCP-31A型电泳槽，北京市六一仪器厂；WD-9412恒温水循环器，北京市六一仪器厂；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；SBH-循环水式多用真空泵，郑州长

47、城科工贸有限公司；37恒温箱，SANYO公司生产；D-37520大型离心机,SORVALL公司；SKY-1102C型摇床，SUKUN公司；TH-2-22台式恒温振荡器，江苏太仓市实验仪器厂；-80冰箱，Thermo公司生产；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；2.2 实验流程2.2.1 实验动物实验对象为高原鼠兔（Ochotona curzoniae），2006年6月捕获于青海省果洛州大武地区。2.2.2 微卫星富集文库构建流程图DNA提取超声破碎基因组DNA加接头微卫星探针磁珠亲和捕捉目的链的扩增连接与转化测序与设计引物数据分析微卫星富集文库构建技术路线

48、Outline of microsatellite of enriched libraries2.2.3 组织取样、保存与基因组提取取4只活捕的高原鼠兔，断颈处死后，取肌肉组织，保存于95%乙醇溶液中，室温存放。分别称取等量的四个个体的肌肉组织，等量混合在一起提取基因组DNA。电泳检测DNA提取结果见图1。用SMA3000紫外分光光度计检测DNA样品的OD值，通过波长260nm与280nm的OD比值计算DNA样品的纯度。OD260/OD280值在1.8左右时DNA样品较纯。比值大于1.8，说明样品中RNA未除尽，小于1.6，说明样品中有蛋白质或酚残留。附：基因组提取方法：采用常规酚氯仿法提取高

49、原鼠兔肌肉组织中的基因组DNA，溶于1×TE后-20保存。具体方法如下：1、用自来水将研钵洗刷干净，再用纯水冲洗，高温灭菌，酶灭活，4冰箱预冷备用；2、取出无水乙醇中浸泡的肌肉组织用ddH2O清洗干净，分别称重，四个个体各0.8g；3、在研钵中加入液氮，把组织研磨至细粉状；4、向离心管中加入32ml组织裂解液并混匀，加入预先配制好的蛋白酶K（20mg/ml）1000l，加入RNA酶300l（自制），37水浴锅中保温45min.放入50水浴锅中消化过夜，在最初的一段时间里要经常摇动；5、待组织消化完毕后，向消化液中加入等体积TrisCl饱和苯酚，上下轻轻混匀10分钟，4，13000rp

50、m离心10分钟；6、离心结束后，转移上清液（尽量吸取上清，以不吸取到下层的蛋白质层和苯酚层为标准）至一新管中；7、加入等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇混合液（体积比为25：24：1），缓慢振荡10分钟后，4，13000rpm离心10min；8、转移上清液于一新管中，加入等体积的氯仿异戊醇混合液（体积比为24：1），缓慢晃动10分钟，4，13000rpm离心10min；9、取上清液于一新离心管中，加入1/10体积的3M NaAC、2倍体积-20预冷的无水乙醇沉淀DNA，缓慢摇匀后于-20放置1h，取出离心管轻轻晃动便可见白色絮状沉淀产生，用枪头挑出沉淀于一新管中；10、用70%酒精溶液洗涤沉淀2次，

51、弃上清；11、将DNA样品置于真空干燥器中干燥15分钟左右，蒸发掉痕量乙醇；12、根据沉淀量加入适量（50l）1M TE(PH8.0)缓冲液，置于4冰箱溶解过夜；沉淀。2.3 超声打碎基因组DNA（1）吸取DNA溶液（大约30 ng）于一灭菌的1.5ml离心管中，加入双蒸水补足300l 体系，加入20l Promega T4DNA 聚合酶缓冲液，放在冰上。（2）用纯水清洗变幅竿头，把离心管放入冰水混合物中，在20%的功率下依次用1%的盐酸、0.1M的NaOH和纯水分别超声一次，时间均为2s，间隔1s。准备多个样品备份做梯度，分别超声6s、8s、10s、12s以获得最佳超声效果。把探头伸入上述准

52、备好的DNA溶液中，注意探头应在整个管子的中心，以使每个点的超声波强度相等，从而使超声后的DNA 片段大小更集中。（3）电泳，看超声后片段大小是否在500bp1kb之间，结果见图2。2.4 DNA末端补平将超声后的DNA放入65水浴中自然冷却，以使超声过程中分开的双链复性。由于超声会造成DNA链的断裂而形成粘末端，为了不影响DNA与接头的连接，需要对其进行末端补平从而形成平末端。补平体系为： DNA320l ；dNTP（10mM）6l；10×T4 DNA 聚合酶缓冲液, 40l；T4 DNA 聚合酶（7.9u/l）2l；ddH2O 32l，总体积400l；把盛有上述混合液的EP管放入

53、37水浴中温浴1h。2.5 沉淀浓缩DNA，胶回收2.5.1 沉淀浓缩DNA（1）向上述体系中加入40l 3M 的NaAc和1ml-20预冷的无水乙醇，放入-20冰箱中静置30min；（2）取出预冷过的混合液离心，13000 rpm,10min,弃掉上清；（3）向沉淀中加入70%的乙醇，颠倒数次混匀；（4）13000 rpm, 4离心5min；（5）弃上清，离心机甩一下，吸去上清，室温静置15min，以使酒精挥发干净；（6）向管中加入60l ddH2O溶解，3l上样电泳；2.5.2 凝胶配制与胶回收（1）称取1.6g Promega公司的琼脂糖，放入三角瓶，加入80ml 1×TBE电

54、泳缓冲液，放入微波炉中用中火煮沸（4min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止加热（切不可让胶溶液溢出到微波炉中）。（2）戴上手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却至约40-50。（3） 将胶溶液缓缓倒入凝胶灌制模具，胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面，把梳子插到正确位置，用胶带将梳子相邻的两孔封住形成较大的梳孔。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固（剩下的胶溶液封口后留待以后熔化使用）。（4）在水平电泳槽中加满1×TBE电泳缓冲液。把电泳仪的电压调至8V/cm，注意正负电极的位置连接正确。（5）  待胶完全凝固后（1

55、5-20分钟），小心拔出梳子。将凝胶放入4恒温电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（6）上样：在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ul的移液器将58l的样品加入大加样孔中，另取2l样品加入旁边小孔中，再在另外的孔中加入3l DNA分子量标准物DL2000。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。枪头不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部。将样品缓缓压入加样孔中，切不可使蓝色样品流到孔外。（7）打开电源开关，在电场作用下，带负电的DNA样品将缓缓向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。（8）当溴酚蓝迁

56、移到接近凝胶边缘时，停止电泳，整个电泳过程约4h。取出模具和凝胶。放入凝胶成像系统中拍照。（9）根据照相情况，用新刀片荧光下切下500bp1kbp的片段，称重；（10）QIAquick试剂盒回收DNA，步骤如下：称取胶重，加入3倍体积的QG buffer 至一倍胶重的管子中；将盛有凝胶的离心管放入50水浴中温浴数分钟至胶完全熔化，在此过程中不断摇动管子以助凝胶熔化；等胶完全熔化后，检查混合物的颜色是否为黄色；加入一倍体积的异丙醇于样品混合物中，混匀；把样品加入到柱子中， 13000rpm，4，离心1分钟；加入0.5ml的buffer QG， 13000rpm，4，离心1分钟；加入0.75ml的

57、buffer PE， 13000rpm，4，离心1分钟；室温静置5分钟；弃掉滤下液，13000rpm，4，离心1分钟；把柱子放入一个新的1.5ml的灭菌管中，向柱子中央加入50lBuffer EB （10mM Tris-Cl，PH8.5），室温静置5分钟，13000rpm，4，离心1分钟；加入30l EB溶解，3l 加3l loading buffer上样电泳，3lDL2000(TianGen)电泳。2.6 连接接头在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能将具有平末端或者互不粘末端的DNA连接在一起形成重组DNA分子。按照接头与回收DNA100：1的比例，在10l的反应体系中加

58、入回收DNA片段；将碱基互补的寡核苷酸A和磷酸化的寡核苷酸B等摩尔混合，98变性1 min，60退火结合2min，冷却至室温形成具有平末端的接头。采用双链接头2l（50M）、10×T4 DNA 连接缓冲液1l、 T4 连接酶（3u/l）（购自Promega公司）1l、总体积10的体系，在14条件下连接16小时, 70酶灭活15min；2.7 检测连接效果 取加有接头的DNA做PCR,反应体系如下： 模板DNA1l ；dNTP（10mM）0.8l；10×Taq 聚合酶缓冲液1l；Taq DNA 聚合酶（5u/l）0.1lMgCl2（25mM）0.8l上游引物（10pM）0.2

59、lddH2O6.1l；总体积10l。热循环系统为：94预变性5 min后，94变性30 s，62退火30 S，72延伸45s，30个循环后，在72条件下补齐7 min。PCR反应结束后取3l反应液在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。经电泳检测，接头已成功连接。2.8 杂交考虑到碱基互补配对和记数拷贝数起始碱基顺序的差异，将碱基重叠和互补的重复单元兼并为一种重复代表，因此2碱基和3碱基的重复共有14种类型见表1。把上述加过接头的DNA在96变性10min, 迅速冰浴5min,分放于5个灭菌离心管中， T根据探针的Tm值将其分为5组，分别加入到5个离心管中，使之在各自适当的温度下进行杂交，杂交体系为：DN

60、A16l；HB 缓冲液52l（20×SSC）；探针（1uM）各2l，用ddH2O 补足100l。第一次分别放入在低于Tm值2的水浴中杂交6h以上，间隔摇动；再降低2重复杂交一次； 杂交温度见表2。2.9 富集 （1）将20l链霉亲和素包被的磁珠转入1.5ml硅烷化的离心管中，加入150l的BW缓冲液（10mM TrisPH=7.5；1.0mM EDTA；1MNaCl），混匀，将离心管放在磁力架上1分钟，待洗液澄清后，用枪吸弃上清，洗四次；（2）把上述杂交过的100l DNA 加入到盛有洗过的磁珠的离心管中，加入200l HB杂交缓冲液, 43摇床上摇动3h，间隔震动。（3）将离心管放

61、在磁力架上1min，用移液器吸弃HB缓冲液；（4）加入200l 2×SSC和0.1%的SDS溶液，室温下静置5min,然后放在磁力架上1min，吸弃上清；（5）重复上一步；（6）加入200l 45的2×SSC 和0.1%的SDS溶液，45水浴中静置5min,然后放在磁力架上1min，吸弃上清；（7）重复上一步；（8）加入200l 60的2×SSC 和0.1%的SDS溶液，60水浴中静置5min,然后放在磁力架上1min，吸弃上清；（9）重复上一步；（10）向上述混合物中加入60lddH2O，PCR仪上96加热变性10min,迅速放在冰上5min,（11）吸取上清至

62、一新管中；重复杂交富集一次；2.10 PCR扩增 以两次杂交富集洗脱下来的单链DNA为模板做PCR，采用50l反应体系，PCR反应体系如下： DNA 34l， dNTP（10mM）5l，10×Taq 聚合酶缓冲液5l，Taq DNA 聚合酶（5u/l）1l，MgCl2（25mM）4l，正向引物（10pM）0.4l，ddH2O0.6l，总体积50l的扩增体系， 94预变性5 min；94变性30 s，62退火30 S，72延伸45s，30个循环后72补齐7 min，获得双链目的片段。PCR反应结束后取3l反应液在2%琼脂糖凝胶中电泳检测。QIA试剂盒切胶回收纯化PCR产物。电泳检测结果

63、。Qiaquick试剂盒胶回收，步骤同上。211 插入片段与载体的连接关于vector与insert比例的计算方法ug of vector×kb size of insert ×mole ratio of insert/vector=ng of insert kb size of vector连接体系（10l）如下：回收DNA4l，T-vector（50ng/l）0.5l，2×T4 DNA 连接酶缓冲液5l，Promega T4连接酶（3U/l）1l，总体积10l；在4恒温水浴锅中连接16小时,然后70酶灭活15min。2.12 Millipore 膜纯化取一洁净的Millipore纯化膜放入盛满ddH2O的培养皿中，正面朝上，将连接产物移至纯化膜上，室温静置1.5h，将纯化产物移至一新EP管中。2.13 电转