槟榔芋生理生化分子鉴定

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1、摘 要近几年，槟榔芋的营养价值与药用价值、市场所需量以及收入都稳步上升，给当地很多种植户带来了很多高收益，导致越来越多的农户都选择去发展种植槟榔芋，以至于槟榔芋各种病害的爆发率也随之增长，为了能够有效的防治槟榔芋所带来的病虫害，将对其槟榔芋菌株病原菌进行分子鉴定，本次试验材料是实验室前期从槟榔芋叶片和叶柄病健交界处分离得到的7株病原菌进行试验，通过形态特征、生长特性、理化特征、DNA测序、分子鉴定、序列分析比对等进行初步鉴定，得出这些菌株都具有一定的耐盐耐热性，最适宜生长温度37，具运动性，为杆状、兼性好氧菌、革兰氏阳性菌。葡萄糖提供最佳碳源，甘露醇、蔗糖依次、蛋白胨、酵母提供菌株利用氮源。最

2、后根据对比基因库得出菌株CPB-001为斯卡氏鸟状芽孢杆菌， CPB-004为巴伦戈尔茨拟杆菌，而CPB-010、CPB-012、CPB-022、CPB-023则为同一菌属芽孢杆菌。田间回接所有菌株球茎腐烂，腐烂程度不同，对叶片无反应。关键词：槟榔芋；生理生化；分子鉴定AbstractInrecentyears,thenutritionalvalue,medicinalvalue,marketdemandandincomeofarecatarohaveincreasedsteadily,whichhasbroughtalotofhighprofitstomanylocalfarmers,res

3、ultinginmoreandmorefarmerschoosingtogrowarecataro,sothattheoutbreakrateofvariousdiseasesofarecatarohasalsoincreased.Inordertoeffectivelycontrolthediseasesandinsectpestscausedbyarecataro,arecawillbeThemolecularidentificationofthepathogensoftarostrainswascarriedout.Thematerialsofthistestwere7pathogens

4、isolatedfromthehealthyboundaryofleavesandpetiolesofformerseniorsisters.Throughthepreliminaryidentificationofmorphologicalcharacteristics,growthcharacteristics,physicalandchemicalcharacteristics,DNAsequencing,molecularidentificationandsequenceanalysis,itwasconcludedthatthesestrainshavecertainsaltandh

5、eatresistanceandaremostsuitableforgrowthThetemperatureis37,whichisathletic,rod-shaped,facultativeaerobicbacteriaandGram-positivebacteria.Glucoseprovidesthebestcarbonsource,mannitol,sucroseinturn,peptone,yeastprovidesthebestnitrogensource.Finally,accordingtothecomparativegenelibrary,thestrainsCPB-001

6、areavianscabbybacillus,CPB-004areBacteroidesvalengellans,andCPB-010,CPB-012,CPB-022andCPB-023arebacillusofthesamegenus.Thecormsofallthestrainswererottenandhadnoresponsetotheleaves.Thecormsofallthestrainswererottenandhadnoresponsetotheleaves.Key words: areca nut；physiological and biochemical ；Identif

7、ication目 录槟榔芋病原菌的鉴定1第一章 引 言11.1 槟榔芋的识别概述11.1.1 槟榔芋的简介11.1.2 槟榔芋的现状11.2 槟榔芋病虫害11.2.1 槟榔芋虫害21.2.3 软腐病21.3 槟榔芋研究现状及目的意义3第二章 材料与方法32.1 材料与方法32.1.1 实验材料、试剂、仪器32.1.2 菌种培养与保存32.2实验方法42.2.1 菌体的形态学观察与革兰氏染色42.2.2 需氧性42.2.3 运动性42.3 碳氮源利用52.3.1 氮源利用52.3.2 碳源利用52.4 基本生长条件62.4.1 温度对病原菌的最适生长62.4.2 盐浓度对病原菌的最适生长62.4

8、.3 pH值对病原菌的最适生长62.5 细菌基因组DNA提取72.5.1 DNA提取72.6 田间活体回接试验7第三章 结果与分析83.1菌体的形态学观察与革兰氏染色结果83.1.1 革兰氏染色结果83.2需氧性、运动性结果93.2.2 运动性结果93.3碳氮源利用103.3.1氮源利用结果103.3.2碳源利用结果123.4基本生长条件结果133.4.1 温度对病原菌的最适生长结果133.4.2 需盐性结果143.4.3 pH值对病原菌的最适生长结果143.5分子鉴定结果153.5.1 细菌基因组 DNA 提取163.5.2 PCR 产物的电泳检测163.5.3 DNA 片段测序、建进化树1

9、63.6 田间活体回接结果18第四章 讨论与展望194.1 讨论与展望19参 考 文 献20致 谢22槟榔芋病原菌的鉴定第一章 引 言1.1 槟榔芋的识别概述1.1.1 槟榔芋的简介槟榔芋属天南星科芋属球茎用变种 (Colocasia esculenta L.var.cormosus Chang) 魁芋类型, 产自广西、广东、福建等地。槟榔芋的块茎呈椭圆形或圆形, 长度为3040 cm, 直径1215 cm, 外皮粗糙、棕黄色至棕红色, 剖而观之, 香味浓郁，内呈槟榔纹，故名槟榔芋1。每年种植的季节在惊蛰、春分时节开始，霜降时即可收获。槟榔芋不仅淀粉含量颇高，肉质口感细腻，营养丰富，具有特殊的

10、风味，而且还含有蛋白质和不饱和脂肪酸，可以促进人体所需的能量物质。槟榔芋还具有补气养肾、健脾胃的功效，可以用来做饮食点心、药用食用，是滋补身体的营养佳品，从科学营养学角度来说，槟榔芋与马铃薯相比较，其营养价值来说毫不逊色2于马铃薯。槟榔芋又可以作药用，本草纲目记载槟榔芋芋梗气味辛冷，无毒，可治蛇、虫、蜂等蛰咬3。清朝年间列为大清贡品，因此槟榔芋被称为皇室贡品。1.1.2 槟榔芋的现状种植槟榔芋主要位于我国福建省宁德市福鼎和龙岩一些地区，福鼎芋的历史悠久，是宁德市福鼎极具特色的农业市场经济竞争力的出口农产品，为当地农户的主要经济来源4。福鼎芋以质优、珍贵、稀有而占领国内外市场。由于槟榔芋营养价值

11、丰富、富含淀粉、蛋白质，深受消费者青睐。槟榔芋喜高温多湿气候，生长适温2730，稳产高产，耐贮运，在秋淡季上市可获较高经济效益，是农业结构调整，增加农民收入的一个好的推广项目种芋提纯，芋田的选择，整畦与培土，肥水管理等是槟榔芋提纯复壮与高优栽培的重要手段5。2011年11月22日，中华人民共和国农业部批准对“福鼎槟榔芋”实施农产品地理标志登记保护。1.2 槟榔芋病虫害1.2.1 槟榔芋虫害斜纹夜蛾是一种喜温性、杂食性、暴食性害虫, 幼虫食叶，严重时只剩下叶脉。初夏季为盛发期，昼伏夜出, 白天躲藏植株茂密叶丛中或土缝下,黄昏开始活动,对酸、甜、光等有趋性、以夜晚812时活动最盛。一年可多代繁衍，

12、且繁衍世代重叠，无滞育表现，是为害槟榔芋的主要虫害之一。地下害虫种类也很多，芋蚜也是危害槟榔芋的主要害虫之一，芋蚜别名瓜蚜、棉蚜，该虫主要严重为害芋苗期6。但无论是哪种地下害虫都是使得地下球茎感病，影响槟榔芋地下球茎质量，从而严重影响槟榔芋的产量。1.2.2 槟榔芋疫病害目前威胁槟榔芋较大的病虫害有疫病、软腐病、斜纹夜蛾、芋单线天蛾、蛴螬和蚜虫等，其中芋疫病对槟榔芋的危害最大。槟榔芋疫病也称芋瘟，发病率和软腐病基本一致，主要发生在每年年中7。该病害具传染性，是靠真菌侵染槟榔芋造成的，影响其整个生长过程以及收成时的产量和质量。芋疫病主要为害叶片和叶柄，也可为害球茎 (也称芋头) ，也具有传染性，

13、如果不能及时采取有效措施加以防治则会大面积爆发芋瘟，已感染病害的芋叶会感染临近植株并不断扩大自身感染面积直至最后病叶枯烂仅剩叶脉8。芋污斑病同芋疫病一样，但芋污斑病只为害叶片。感染初期叶片主要表现为淡黄色，中期叶片表现淡褐色至暗褐色，感染后期叶片在病斑上会长出黑色霉状物9。1.2.3 软腐病软腐病又称之为茎腐病，他发病率高、迅速，时间短、散发出恶臭，整株植株枯萎腐烂，就会导致槟榔芋产量绝收10。有害病虫不断增加，危害增加产量减少，同时也打击了芋农种植的积极性。主要危害在叶柄和球茎，叶柄多发生于下部，初呈水渍状暗绿色，发病时间不断延长，发病部位面积扩大，颜色加深，呈黄褐色、腐烂发臭，病叶变黄卷缩

14、，危害严重时则全部枯死。球茎内部腐烂，腐烂部分均产生恶臭，毁灭性极大，是一种常见病原危细菌。其种芋内可能携带病原细菌，或在残病体中携带病原细菌，若未加强田间管理或未及时清理带病植株以及残病体，当种芋带有伤口直接栽培，或地下球茎或叶柄基部病菌易带有伤口时，均易被病菌侵入繁殖，从而影响槟榔芋产量。1.3 槟榔芋研究现状及目的意义福鼎槟榔芋独特的风味与体大形美的外观是由于福鼎市当地特殊的母岩、母质、土类、土层厚度、肥力和土壤养分、质地、酸碱度，以及独特的管理方法。槟榔芋淀粉含量高，肉质细腻，营养丰富，可食用率高，风味独特，又其产量高，经济效益好，种植比例持续增加11。2017年福鼎全市种植槟榔芋面积

15、达 1.3 万亩，总产量 1.5 万吨，总产值 4.8 亿元，是该市农民脱贫致富的好项目之一12。种植槟榔芋促进我国农业发展，带来了巨大的经济效益。但由于缺乏相关的知识，长期大量使用农药，导致槟榔芋的耐药性降低，而当地农户采用传统的种芋繁殖更容易导致种芋退化、抵抗力下降易感染病菌13。长期依靠化学药剂解决病虫害问题始终治标不治本，环境土地都将受到影响，增加了病原菌产生耐药性的风险，导致防效下降槟榔芋的平均施肥增产率为氮肥钾肥磷肥14。化学农药对槟榔芋产量影响很大故必须严格控制低毒农药的使用次数和用量。为了找到并能有效合理解决槟榔芋软腐病的耐药性，本次试验将往届师姐分离出的病原菌菌株进行分子鉴定

16、，通过DNA测序分析病原菌所属菌属。第二章 材料与方法2.1 材料与方法2.1.1 实验材料、试剂、仪器本次试验研究病原菌株的基本生长特性、形态学观察、分子鉴定。试验所需的试验材料、试剂、主要仪器如下：材 料：从槟榔芋叶片和叶柄病健交界处分离得到的7株病原菌。试剂：NA培养基，NB培养基，细菌DNA提取试剂盒，染剂等。仪器：试管，锥形瓶，量筒，玻片，离心管，超纯水系统（美国，MILLI-Q），灭菌锅（致微厦门仪器有限公司，GR60-DA），移液枪（法国吉尔森，Ppetman系列），恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司，KLH-250FD），超净工作台（苏州净化设备有限公司，WE-CJ-1D），

17、显微镜（宁波舜宇仪器有限公司，E5）。2.1.2 菌种培养与保存菌株转管配置的基础培养基，121高压高压灭菌备用，与超净工作台中按一转四进行接种与保存，37恒温培养箱培养24h，菌种长出后放置4冰箱储存。1、NA固体培养基：营养琼脂（33.0g/L）,琼脂或琼脂粉（10.0g/L），按上比例称量后加热溶解（可在电磁炉中进行）加热时用玻璃棒一边加热一边搅拌，迅速分装，放入121高压蒸汽灭菌锅里灭20min，摆斜面待冷却备用。2、NB培养基（营养肉汤）：牛肉浸膏（18g/L），按比例称量后加热溶解（可在电磁炉中进行）加热时用玻璃棒一边加热一边搅拌，溶解后迅速分装，放入121高压蒸汽灭菌锅里灭20m

18、in，冷却备用。3、半固体培养基：牛肉浸膏（18g/L），琼脂或琼脂粉（7.5g/L）,按比例称量后加热溶解（可在电磁炉中进行）加热时用玻璃棒一边加热一边搅拌，试管分装，放入121高压蒸汽灭菌锅里灭20min，冷却备用。2.2实验方法2.2.1 菌体的形态学观察与革兰氏染色将培养完成的试验菌株进行进一步革兰氏染色实验。1：涂片固定：用全新的载玻片，洗洁精洗净后煮沸，95%乙醇清洗，洗净晾干后备用。在无菌操作条件下在载玻片上滴加一滴生理盐水，用接种环挑出菌液滴在生理盐水中，火焰上缓慢加热至晾干。2：结晶紫初染1min后蒸馏水冲洗。3：加碘液媒染，覆盖涂面染约1min，水洗。4：乙醇脱色30s(脱

19、色为最关键一步，掌握好脱色时间），水洗晾干。5：复染，用蕃红染液复染30s，晾干，最后镜检观察结果并记录试验菌株的颜色判断为革兰氏阴阳性菌。2.2.2 需氧性按所需培养菌株用量配置基础培养基，每个菌种三组重复组一组对照组，装于试管中后121高压灭菌20min。无菌操作条件下用外径为1.5mm 的接种针以直针穿刺接种法将菌液刺于半固体培养基中，37恒温培养箱中培养24h，观察记录结果。此试验为研究试验菌株的需氧情况，判断7组试验菌为好氧型细菌还是厌氧型细菌。2.2.3 运动性细菌的运动性一般与其具是否有无鞭毛有关，故采用半固体培养方法进行培养。无菌操作条件下：用接种环接种（每个菌种接2个试管，一

20、组空白对照），点燃酒精灯，左手夹住两根试管，斜面向上45度角，灼烧接种环、右手拔棉塞，试管口过火，取菌、直接用直针棒接种、标记、37恒温培养箱中培养24h、最后观察菌株生长情况。如菌株生长向四周云雾状扩散，则试验菌株有运动性，否则反之。2.3 碳氮源利用2.3.1 氮源利用氮源培养液所需药品如下：a、葡萄糖 10.00 g/L、Na2HPO4 2.13 g/L、FeSO4 7H2O 0.50 g/L 、 H2PO4 1.36 g/L、MgSO47H2O 0.20 g/L、CaCl2 5.00g/L。b、被测底物硝酸钾 0.1% ，硫酸铵2g/L ，蛋白胨2g/L ，酵母粉2g/L。1、分装试管

21、，121高压灭菌 20 min，冷却备用。每组设置3个重复组和一组不加任何氮源的对照组，调节pH值至7.0 。2、制备菌悬液：取试验菌液，加入23mL蒸馏水振荡，制成菌悬液。菌悬液按比例1:100（V：V）稀释，并接种于不同配制的基础培养液中，3、将试验菌株放于37恒温培养3天和7天，第3天和7天后分别观察试管中菌液的浑浊度，与对照管进行对比。如菌液浑浊，则表明该培养液中的被测底物提供氮源，有利于菌株生长。2.3.2 碳源利用碳源培养液所需试剂如下：a、 主要试剂CaCl22H2O 0.10 g/L、K2HPO4 0.50 g/L 、4(NH4)2SO4 2.00 g/L、NaH2PO4H2O

22、 0.50 g/L、MgSO47H2O 0.20 g/L。b、 被测底物终浓度为0.5%的葡萄糖、蔗糖和甘露醇和0.2%的柠檬酸。1、 分装试管，培养液121高压灭菌 20 min，冷却备用。再使用 0.22um孔径的有机细菌过滤器过滤灭菌。2、 制备菌悬液：取试验菌液，加入23mL蒸馏水振荡，制成菌悬液。按1:100（V：V）比例稀释菌液，空白培养液作对照组。连续移种培养三代，37恒温培养，如果菌液一直呈现出浑浊，则表明该培养液中的被测底物提供碳源，该碳源有利于菌株生长。2.4 基本生长条件2.4.1 温度对病原菌的最适生长1、准备菌液：将试验菌先进行接种摇床培养，摇床条件为温度37、转速1

23、50 r/min、培养时间24 h，24h后观察试管菌液浑浊程度可以后取出进行下一步操作。2、配置培养液，分装试管，培养液121高压灭菌 20 min，冷却备用。设置六个不同梯度的温度4、20、30、37、45、65。3、无菌操作条件下将培养菌液取出用0.75无菌生理盐水稀释1000倍做菌悬液备用，菌液按1:100（V：V）比例稀释并接于NB培养液中，3个试验组和一组加等量无菌生理盐水的空白对照，37恒温培养48h，早中晚每8h测各组菌液在波长600下的吸光值，记录数据，绘制生长曲线图。2.4.2 盐浓度对病原菌的最适生长1、准备菌液：将试验菌株先接种摇床培养，摇床条件为温度37、转速150

24、r/min、培养时间24 h后进行下一步操作。2、配置培养液，分装试管，121高压灭菌 20 min，冷却备用。设置4个不同 NaCl浓度（2%、5%、7%和10%）。3、无菌操作条件下将菌液1:100（V：V）比例稀释，接种于不同盐浓度培养基中，每组3个重复，等量无菌营养肉汤培养基作对照。37恒温箱培养，3天和7天后观察与未接种的对照管对比，测各组菌液在波长600下的吸光值，记录数据，绘制菌株的生长曲线图。2.4.3 pH值对病原菌的最适生长1、准备菌液：将试验菌株先接种摇床培养，摇床条件为温度37、转速150 r/min、培养时间24 h后进行下一步操作。2、配置培养液，分装试管，121高

25、压灭菌 20 min，冷却备用。设置设置了pH为5、6、7、8、9、五个不同pH梯度。培养基用试纸和酸度计校准。3、无菌操作条件下将菌液1:100（V：V）比例稀释，并接种于各个不同梯度pH的新鲜营养肉汤培养基中，3个试验组和一组等量无菌生理盐水的空白对照，置于37恒温箱培养培养48h，隔8h测各组菌液在波长600下的吸光值，记录数据，并绘制生长曲线图。2.5 细菌基因组DNA提取2.5.1 DNA提取培养菌液，进行摇床培养10到20h，结束后根据细菌基因组DNA 取试剂盒说明书按说明书上的步骤提取7组菌株 DNA，菌酶缓冲液现配现用，利用16SrDNA扩增引物，上游引物为27F（5-AGAG

26、TTTGATCCTGGCTCAG-3），下游引物为1492R(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)。对提取后 DNA菌液进行跑琼脂凝胶电泳查看DNA是否有条带，若有则提取成功、最后送至武汉生物公司对比测序，得出测序结果构建进化树最后比对细菌基因库得出实验菌属于哪种菌属。 PCR 扩增的引物为上游引物 27F 和下游引物1492R，如下表PCR反应体系和PCR扩增体系，放置在4 下保存。PCR反应体系：组分为10Taq PCR Buffer（Mg2）5ul，dNTPS Mix(2.5mol/L) 4ul，上游引物（27F）2ul，下游引物（1492R）2ul，ddH2O32.4

27、ul，rTaq(5v/ul)0.6ul，DNA4ul，总体系50ul。PCR扩增程序：温度94 预变性、时间10min，94 变性30s，55退火30s，72 延伸1min，循环30次，72再延伸10min。2.5.2 16rsDNA序列测定在细菌鉴定中的应用在生物细菌分型鉴定中，有时会遇到不活跃的独特菌株, 则无法准确鉴定改独特菌株的种类，所以一般情况下都会用到16SrDNA序列用于测定独特菌株、对菌株进行细菌分型鉴定，鉴定结果准确度高。发现和描述新的细菌种类, 核糖体16SrDNA基因序列全长约1550bp, 分为保守区和可变区16, 保守区域设计引物，可变区可以用于细菌分类鉴定17。16

28、rsDNA序列测定是通过鉴定细菌 DNA 来区分种属,鉴定得出的结果准确性、可靠性高于其它18。2.6 田间活体回接试验槟榔芋育苗从福鼎邮寄过来，在实验基地进行田间种植栽培，2019年三月栽培播种，隔天浇水，育苗长出后进行除草，施肥等田间管理。于2019年九十月份待芋头成熟后进行活体回接，将7株实验菌37摇床培养10小时，0.75%生理盐水稀释，离心管分装实验菌液，带上一次性注射器，剪刀，纱布，酒精灯，75%的酒精等用具去田间回接，挖开芋头根块茎块，注射菌液芋头球茎，剪刀沾上菌液后对芋叶片裁剪，实验结束后做标记，14天后续观察并记录芋叶与球茎的腐烂情况。第3章 结果与分析3.1菌体的形态学观察

29、与革兰氏染色结果3.1.1 革兰氏染色结果试验结果表明7株菌株均为革兰氏阳性菌，杆状菌，结果见图3 -1，图3-2所示。 图3-1 CPB-010染色结果 图3-2 CPB-023染色结果经过试验得到菌体结果，7株试验菌株全为杆状、分为短杆、长杆，圆形或者近圆形，菌株光滑湿润，全为革兰氏紫色阳性菌。如表3-1所示。表3-1菌株形态和革兰氏染色结果病原菌菌株菌株形状菌株形态革兰氏染色CPB-001杆状近圆形，边缘完整光滑湿润阳CPB-004杆状圆形，边缘不完整，光滑湿润阳CPB-010杆状近圆形，边缘完整，光滑半湿润阳CPB-012杆状椭圆，柱状，圆形，湿润光滑阳CPB-022杆状椭圆，柱状，圆

30、形，湿润光滑阳CPB-023杆状圆形，光滑半湿润阳CPB-025杆状近圆形，边缘不完整，光滑湿润阳3.2需氧性、运动性结果3.2.1需氧性结果试验结果表明7株病原菌在试管培养基中均能全部生长,部分结果如图3-3，图3-4，图中最左边为对照，右边两管为试验组，可以看出菌体不仅在沿着直针穿插途径方向生长，在附近的培养基处及培养基表面也生长了，所以菌株为兼性好氧菌。各菌株需氧性如表3-2所示。 图3-3 CPB-023需氧性结果 图3-4 CPB-012需氧性结果 表3-2 菌株需氧性结果病原菌菌株好氧厌性CPB-001兼性好氧菌CPB-004兼性好氧菌CPB-010兼性好氧菌CPB-012兼性好氧

31、菌CPB-022兼性好氧菌CPB-023兼性好氧菌CPB-025兼性好氧菌3.2.2 运动性结果试验结果表明7株病原菌在半固体基础培养基试管中，培养过后观察到菌种沿着接种针表面方向生长并向四周游离扩散，光滑湿润，米黄色，表明7组实验菌株均具有运动性。部分试验结果见图3-5右为试验菌组、左为对照组，图3-6左1为对照组，全部菌株运动性结果详情见表3-3。 图3-5 CPB-010运动性结果 图3-6 CPB-012运动性结果病原菌菌株运动性CPB-001具有运动性CPB-004具有运动性CPB-010具有运动性CPB-012具有运动性CPB-022具有运动性CPB-023具有运动性CPB-025

32、具有运动性表3-3菌株运动性结果3.3碳氮源利用3.3.1氮源利用结果试验得出，试验组试管培养基中菌液出现浑浊、而空白对照组清澈。说明7种菌株能利用蛋白胨、教母粉提供氮源，有利于菌株生长。而分别加到硫酸铵氮源和硝酸钾氮源培养基的试管中都没有出现浑浊与空白对照组出现澄清现象，说硫酸铵、硝酸钾不提供菌株氮源，不利于菌种生长。如图3-7、3-8、3-9、3-10所示部分氮源利用。全部菌种需要氮源利用情况如表3-4所示。7种试验菌株部利用氮源实验结果如下，三个重复组，图3-7最右边为对照组，与试验菌都呈现澄清，菌株不利用该底物为氮源，图3-8、3-9最左边为对照组澄清，试验菌株出现浑浊，说明菌株利用该

33、底物作为氮源、图3-10最左边对照组与右边试验菌株澄清。 图3-7 CPB-001硫酸铵利用情况 图3-8 CPB-025酵母利用情况 图3-9 CPB-010蛋白胨利用情况 图3-10 CPB-022硝酸钾利用情况 表3-4菌株氮源利用结果病原菌菌株硝酸钾硫酸铵蛋白胨酵母粉CPB-001CPB-004CPB-010CPB-012CPB-022CPB-023CPB-025注：可利用；：不可利用3.3.2碳源利用结果试验结果表明，连续三代移种培养每48小时观察一次、第一代移种时菌株在葡萄糖、蔗糖、甘露醇培养基中均出现浑浊，但不明显，移种2-3代时葡萄糖、蔗糖、甘露醇浑浊度比之前更明显，而葡萄糖、

34、蔗糖的浑浊度最明显则说明菌株利用碳源率最高，甘露醇利用率比前两者较低，柠檬酸与对照组从第一代开始均为澄清状态，故菌株不利用该底物作为碳源。如图3-11最左为对照、最右为柠檬酸，图3-12右2为柠檬酸、最左为对照，图3-13左3为柠檬酸，左4为对照。表明7种试验菌株利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇作为基本碳源、有利于菌株生长。而柠檬酸基础碳源培养基与对照组一样澄清，说明菌株不利于该底物作为碳源。 图3-11 CPB-012第一代移种 图3-12 CPB-022第二代移种 图3-13 CPB-001第三代移种7株病原菌全部利用碳源试验如表3-5所示。病原菌菌株葡萄糖蔗糖甘露醇柠檬酸CPB-001CPB-0

35、04CPB-010CPB-012CPB-022CPB-023CPB-025表3-5 菌株碳源利用结果注：可利用；：不可利用3.4基本生长条件结果3.4.1 温度对病原菌的最适生长结果7种病原菌菌株在不同温度培养下鉴定结果如各图所示，其中所有病原菌在2045皆能生长,4和65几乎不生长，37为菌株的最适温度生长，30和20条件下菌株的生长情况次之，所有的菌株会随着温度升高而受到抑制，生长速度变缓慢。如图3-14所示。 图3-14 最适温度3.4.2 需盐性结果结果表明7株试验菌株在不同NaCl浓度为2%、5%、7%、10%的生长情况下，菌株的吸光值随盐浓度的增加而降低，表明盐浓度越高，越不利于菌

36、株生长。其中对照组和2%的盐浓度生长情况最佳较高，培养时间越长对照组与试验组的吸光值也上升，10%NaCl情况下菌株几乎不生长。如图3-15、3-16所示 图3-15 3天需盐性结果 图3-16 7天需盐性结果 3.4.3 pH值对病原菌的最适生长结果7株病原菌在不同pH值的培养下的鉴定结果绘制生长曲线如各下图3-17所示，根据生长曲线图结果可以看出可以各菌株病原菌在pH为5、6、7、8、9范围内都能生长，其中pH值为7时生长最为旺盛，pH值为6次于pH值为7，pH为5和9时比较弱，培养时间越长，菌液生长情况越好，结果表明pH值越高或者低于最适pH值范围反倒会抑制菌株生长。 图3-17 最适p

37、H3.5分子鉴定结果3.5.1 细菌基因组 DNA 提取 第一次电泳检测，提取纯度、大小，7株试验待测病原菌提取结果如下图 3-18 图 3-18 DNA 提取电泳检测(Maeker2000)3.5.2 PCR 产物的电泳检测 PCR电泳检测结果如下图 3-19，可以看出7种株试验测病原菌的扩增片段在 1500bp左右。 图 3-19 PCR 产物电泳检测（Marker2000）3.5.3 DNA 片段测序、建进化树将提取出来的7株菌株DNA扩增产物送至武汉擎科生物科技公司进行测序，其中CPB-025菌株由于最大量浓度低从而失败无信号，CPB-001、CPB-004、CPB-010、CPB-0

38、12、CPB-022、CPB-023成功。用DNAMAN将全部测序结果进行对比，然后先将6株试验菌株在NCBI官方网站进行比对,其次将得出的比对结果序列再使用MEGA5进行构建进化树，最后找到与菌株DNA序列同源性达90%以上的菌属，以确定试验菌株的所属菌属。根据对比结果构建进化树，其中的 CPB-010、CPB-012、CPB-022、CPB-023为同一属，都属于芽孢杆菌。CPB-012、CPB-022为枯草芽孢杆菌，CPB-010、CPB-023为威德曼尼芽孢杆菌，CPB-004为巴伦戈尔茨拟杆菌、CPB-001为斯卡氏鸟状芽孢杆菌，构图如下图3-20、3-21、3-22、3-23所示，

39、表3-5各菌株DNA构树结果图3-20 CPB-012图3-21 CPB-001图3-22 CPB-004图3-23 CPB-010表3-6 各菌株DNA构树结果病原菌菌株菌属名称（英文）菌属名称（中文）CPB-001Ornithinibacillus scapharcae斯卡氏鸟状芽孢杆菌CPB-004Paenibacillus barengoltzii巴伦戈尔茨拟杆菌CPB-010Bacillus wiedmannii威德曼尼芽孢杆菌CPB-012Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌CPB-022Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌CPB-023Bacillus wie

40、dmannii威德曼尼芽孢杆菌3.6 田间活体回接结果 进行田间回接十五天后观察实验结果，试验菌珠球茎伤口处有不同程度的腐烂，用镊子割开伤口感染处后，菌株内部有明显的腐烂。其中CPB-001、CPB-025、CPB-010、CPB-004腐烂面积比较大，CPB-012、CPB-023、CPB-022腐烂程度较轻，对照组球茎不腐烂，试验菌对叶片不反应。如图3-23、3-24、3-25、3-23、3-24所示。图3-23 球茎对照 图3-24 CPB-023 图3-25 CPB-001 图3-26 叶片对照 图3-27 CPB-022叶片第四章 讨论与展望 4.1 讨论与展望 槟榔芋不仅营养丰富，

41、而且色、香、味俱佳，有着“蔬菜之王”之称。可做为药食，食之有散积理气、解毒补脾、清热镇咳的功能，是滋补身体的营养佳品和最佳选择。虽然槟榔芋作为发展农业经济项目之一，带来的收益可观。但越来越多的农户种植槟榔芋，大量使用化学农药，喷洒杀虫剂，不仅对环境造成污染，水质、土壤也随之贫瘠，也导致槟榔芋本身的耐药性降低，患病率增加，从而造成槟榔芋的产量、经济收入下降。通过本次实验研究槟榔芋的基本特征、分子鉴定得出一定的实验数据，为今后的槟榔芋病害研究提供一个参考数据，提供出有效的研究出防治槟榔芋病虫害的生物学手段。本次实验经过比对得出菌株CPB-001为斯卡氏鸟状芽孢杆菌、CPB-004为巴伦戈尔茨拟杆菌

42、 、而CPB-010、CPB-012、CPB-022、CPB-023为同种菌属芽孢杆菌。此次研究主要是槟榔芋叶柄和叶片处的病害致病菌，病原菌选择7株菌株通过基本形态特征观察、生理生化分子鉴定、提取试验菌株的DNA进行测序、序列分析比对等初步鉴定，最后得出各病原菌的所属菌属。实验得出的数据可作为参考，为今后研究槟榔芋病害提供凭证，以减少软腐病虫害对槟榔芋生产种植上带来的经济损失，提高农民种植槟榔芋的积极性。如今科技发达，生物科技手段越来越精准，希望生物学家们寻找到新的一种无毒、抗性强，耐药性高、污染性低新的生物防治剂。加大对槟榔芋软腐病的研究力度，结合现实、科学改善比对传统防治手段，配合相关的优

43、质栽培高技术，槟榔芋软腐病的防治现状一定大有改善以及更加优化，带来更大的经济效益，农民收入水平肯定逐步上升。20参 考 文 献1钟三秀.槟榔芋栽培技术J.现代农业科技,2014(09):116.2肖华西,吴卫国,夏新剑.槟榔芋特性及其加工产品J.中国食物与营养,2007(04):22-23.3吴小卿.福鼎槟榔芋芋梗生物碱提取及功能特性的研究D.福建农林大 学,2011. 4袁素华,林挺兴.宁德市福鼎槟榔芋生产现状及对策措施J.东南园艺,2013,1(02):58-59.5缪进金.福鼎槟榔芋提纯复壮与高优栽培J.福建农业,2013(04):20-21.6游世奇,曹雪梅.槟榔芋主要病虫害的发生与综

44、合防治J.现代园艺,2009(09):37-38.7李似清.槟榔芋的生长特性及优质高产栽培技术J.农业与技 术,2015,35(16):143. 8赖元洪.槟榔芋疫病的发生与综合防治J.科学种养,2014(03):33.9许云峰.槟榔芋常见病虫害及防治技术J.现代农业,2011(06):44-45.10许长敏.槟榔芋常见病虫害发生与防治J.现代农村科技,2012（24）:2930. 11许鸿江,余有桥.将乐县槟榔芋的种植表现及栽培技术J.农业科技通 讯,2019(02):239-240. 12阙玉林.福鼎槟榔芋密植覆膜高产栽培技术J.农民致富之 友,2018,(20):146.13叶泉清,钟佳

45、玲,陈媚,蓝志萍,陈郭燕. 槟榔芋疫霉菌生物学特性、致病力测定及田间防治药剂筛选J.南方农业学报,2016,47(04):588-593.14曹榕彬.福建宁德花椰菜和槟榔芋施肥指标体系研究与应用J.云南农业 大学学报(自然科学),2016,31(05):902-909. 15沈萍,陈向东.微生物学实验M.北京,高等教育出版社,201316刘朝军,沈定霞.16SrDNA序列测定在细菌鉴定中的应用J.军医进修学院学报,2011,32(07):774-776+779. 17RelmanDA.The arch for unrecognized pathogensJ.Science,1999,284 (

46、5418) :1308-1310. 18 王浩竹,王正祥。细菌分子鉴定技术的研究进展J.现代园艺,2008（23）：98809881. 1王汉荣 方丽 茹水江 任海英. 槟榔芋疫病的识别与防治J. 中国蔬菜, 2009(21):28-29.2许长敏. 槟榔芋常见病虫害发生与防治J. 现代农村科技, 2012(24):31-32.3黄央江 陈美娇 张丽春. 建宁县槟榔芋疫病与田间小气候的关系及防控技术探讨J. 现代农业科技, 2015(12):144-145.4阙玉林. 福鼎槟榔芋密植覆膜高产栽培技术J. 农民致富之友, 2018(20):152-152.5刘朝军 沈定霞. 16SrDNA序列测

47、定在细菌鉴定中的应用J. 军医进修学院学报, 2011(07):104-106.6戴友峰. 借鉴台湾“精致农业” 促进特色农产品生产J. 赤峰学院学报(自然科学版), 2009(07):63-64.7刘春芳. “土老冒儿”坐上国宴席 福建芋“大有吃头”J. 农产品市场周刊, 2006(20):1-1.8陈美琴. 马蹄筋草坪害虫夜蛾的防治J. 江苏绿化, 1999(03):31-31.9陈彬 王颖 郑晶 黄晓蓉 林杰 彭华毅 邵碧英. 金黄色葡萄球菌五种肠毒素基因PCRDHPLC检测方法的建立J. 食品工业科技, 2015(03):167-172.10邓洪宇 杨玉英 侯广玉 王璐璐. 奶牛阴道嗜酸乳杆菌生物学特性的研究J. 中国微生态学杂志, 2010(02):24-27.11陈文明 郑国斌 姚娟 李沛 王志 陈雄. YE专用高蛋白高RNA酵母菌株的筛选及鉴定J. 食品科技, 2015(04):11-15.12孙守峰 刘超. 水貂绿脓杆菌病的鉴定及药敏试验J. 中国畜禽种业, 2014(11):45-46.23