具生物活性的重组鸡催乳素的制备1

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1、精品论文推荐具生物活性的重组鸡催乳素的制备1岳光芳 1，陈益填 2 ，刘颖 1，李万利 1，施振旦 11 华南农业大学动物科学学院，广州五山 (510642)2 广东省家禽研究所，广州柯木塱 (510645)E-mail: zdshi摘要：将鸡催乳素（PRL）成熟肽cDNA 片段插入原核表达载体pRSET A 的Nhe I和Hind III位点之间，构建重组表达质粒pPRL-SCAU。将此质粒转化大肠杆菌Escherichia coli菌株BL21（DE3）, 将重组菌在含氨苄青霉素的LB 培养基中培养，再经IPTG 诱导，可以诱导 表达相对分子质量约为24500的重组鸡PRL。经0.1mmo

2、l/L IPTG诱导4 h 后，表达量达到最高，占总菌体蛋白的30%左右。表达的重组鸡PRL含组氨酸标记，以包涵体形式存在，可经50%Ni-NTA 树脂分离纯化，然后在透析复性后分离出可溶性部分。将此可溶性重组鸡PRL对3月龄的鸽子左侧嗉囊处在相同位置隔24h2次皮内注射，能够显著促进嗉囊上皮的增生。 经与天然鸡催乳素的增生效果相比，所表达的重组鸡PRL的生物学活性为天然催乳素的17%至25%。关键词：鸡PRL融合蛋白；表达和纯化；复性；生物活性 中图分类号：S8310. 引言催乳素（Prolactin，PRL）,是腺垂体催乳素细胞分泌的多肽激素。PRL与生长激素(Growth hormone

3、，GH)和胎盘催乳素(Placental Lactogens，PLs)属于同一家族。在不同的脊椎动物， PRL表现出广泛的生物学功能，包括电解质平衡、生长和发育、内分泌和代谢、行为、繁殖 以及免疫调控和保护等约300多种功能1。在哺乳动物的研究中发现，PRL对生殖活动具有 双重调节作用。PRL通过促进性腺促黄体素受体的表达，具有促进繁殖活动的作用25。而 在季节性分泌高峰时，高浓度PRL又往往表现出抑制繁殖活动68。在禽（鸟）类，PRL是 促进母禽就巢孵卵行为和调控生殖活动的关键激素9；此外PRL也密切参与鸟类和许多哺乳 动物繁殖季节活动的调节，如夏季光照延长时PRL分泌升高，抑制促性腺素分泌

4、抑制繁殖活 动911。而另一些研究则发现，PRL具有促进体外培养的禽类卵泡细胞促性腺激素受体的表 达和促进孕酮分泌的作用1213。这些都提示，PRL对动物繁殖活动具有促进和抑制的双重 调控作用，这两种不同的调控作用可能分别发生在下丘脑和性腺。要分别研究PRL的两种调 控机制，需要获得大量具有生物活性的PRL以用于离体和在体的研究工作。本文因此制备了 重组鸡PRL，并利用鸽子嗉囊上皮细胞增生反应14，检测了该重组PRL的生物学活性。1. 材料和方法1.1 质粒和菌株含有PRL 成熟肽cDNA 的重组质粒鸡pPRL-RSET15，表达大肠杆菌Escherichia coli菌 株BL21(DE3)

5、 和pRSET A 载体由华南农业大学动物遗传育种与繁殖实验室保存。1.2 试剂和酶类Pfu 聚合酶、Taq 聚合酶、dNTP s、UNIQ 210 质粒小量抽提试剂盒为上海生工产品。 PCR 引物为上海英骏公司合成。限制性内切酶Nhe，Hind 为Fermentas产品，Ex Taq DNA 聚合酶，DL2000 相对分子质量标准，T4 连接酶、胶回收试剂盒、CIAP 、相应缓冲液、IPTG1本课题得到高等学校博士点专项基金(20050564001)，国家自然科学基金(30671504)的资助。- 6 -为TaKaRa 产品，用于纯化的带有His-tag 的50%Ni-NTA 凝胶（Qiag

6、en）为自基因公司（广州）产品。1.3 PRL原核表达载体的构建和成熟肽重组融合蛋白的表达根据家鸡PRL 成熟肽的序列，设计并由上海英骏公司合成一对引物:上游引物G061021_0006序列为：5-ATAGCTAGCCTGCCAATCTGCCCCATT-3（编码 区130147位），含有Nhe I酶切位点。下游引物G061021_0007 序列为：5-CAGAAGCTTAGCAATTGCTATCATGGATTA-3（编码区707727位），含有Hind III酶切位点。以含有PRL成熟肽的重组质粒pPRL-RSET为模板进行PCR 扩增，将PCR 扩增片段经 Nhe I和Hind III双酶切

7、后克隆入质粒pRSET A 的相应酶切位点之间，构建重组表达质粒鸡 PR-PRL并转化E. coli BL21(DE3)。进行PCR 鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，以确定阅读框架 的正确性。挑取含重组子鸡PR-PRL的细菌单菌落于LB 液体培养基（含氨苄青霉素100 g/mL） 中，用IPTG 诱导表达重组蛋白，SDS-PAGE 分析重组蛋白的表达和分子大小， 并用Ni-NTA 凝胶在变性条件下按说明书纯化蛋白，最后用含有8 mol/L 尿素的洗脱液洗脱 下PRL 重组融合蛋白。1.4 重组质粒的转化和鉴定所构建的重组质粒pPRL-SCAU、转化E. coli XL 12 Blue, 筛选阳性菌落

8、进行PCR 和酶切 鉴定, 最后将鉴定正常的质粒交大连宝生物和上海博亚生物工程公司进行测序。1.5 重组蛋白的表达和鉴定将重组质粒转化E. coliBL 21 (DE3) , 经LB 培养基培养后, 用IPTG 诱导表达重组蛋 白。SDS-PAGE 分析重组蛋白的表达和分子大小, 并检验通过Ni-NTA 凝胶(Q iagen) 纯化 的带有His-Tag 的重组蛋白的分子大小和蛋白纯化情况。1.6 鸡PRL成熟肽重组融合蛋白的复性和浓缩溶液I至溶液VITris-HCl 0.01 mol/L， NaH2PO4 0.1 mol/L，尿素从溶液至溶液分别为6、4、4、2、2 和0 mol/L，pH

9、值分别为4.5、4.5、5.5、6.0、7.0 和7.5。将装有蛋白的透析袋置于透析液 中， 4搅拌下依次用以上透析液各透析45 h。透析后用聚乙二醇适当吸收透析袋中的液 体以浓缩蛋白，最后用蒸馏水充分清洗透析袋45 次后吸取上清液，用紫外分光光度计（Eppendorf Biophotometer 6131）测定蛋白浓度后- 20 冷冻保存备用。1.7 动物试验处理由广州市良田鸽业有限公司提供质量大致相同的3月龄白羽王鸽后备种鸽（质量600g左 右），平均分成3组，分别在位于左侧嗉囊表面皮肤皮内注射重组鸡PRL25g（n=6），50g（n=5）和天然鸡PRL 5g（n=6）。试验前先在鸽子颈下

10、胸骨处左侧嗉囊位置用油性笔标记 注射位置，然后在该位置皮内第1次注射不同剂量的催乳素，第2次24h之后在相同位置注射， 注射后20h，检查注射的催乳素已被完全吸收后宰杀并取嗉囊，分开左右两侧分别在相同位 置的相同面积刮去嗉囊上皮。将每组每只鸽子注射的左侧嗉囊上皮作为处理组，而未注射的 右侧嗉囊作为对照组。将刮出的嗉囊上皮放入已经称质量的离心管，之后将样品在50烘12h 达恒重，记录质量数据并分析。1.8 数据处理先用双因子方差分析法分析各处理鸽的嗉囊上皮增生情况，然后在各处理剂量内左右两 侧进行t检验，另也将每剂量组的右侧（对照组）上皮增生质量进行方差分析和多重比较。 再计算单位PRL对上皮增

11、生的促进作用:（左侧嗉囊增生质重/右侧嗉囊增生质重）/注射催乳 素质量,然后将重组催乳素的促进作用与天然催乳素的促进作用相比，得出重组催乳素的相 对活性。2. 结果和分析2.1 原核表达载体的构建2.1.1 PCR以重组阳性质粒 pPRL-RSET 为模板, 用引物 G061021_0006 和 G061021_0007 扩增出 1条约 616 bp 的特异性片段。2.1.2酶切鉴定用Nhe I和Hind III双酶切构建的重组质粒, 都可相应得到正确的酶切片段649bp, 说明已 经成功构建了pPRL-SCAU质粒。2.1.3测序鉴定(数据未列出)经上海英骏生物技术有限公司测序,重组质粒所克

12、隆的序列均正确插入表达载体的相应 克隆位点, 各质粒都具有正确的阅读框架。表明PR-PRL编码序列和其模板序列完全相同。2.2 PRL 成熟肽重组融合蛋白的表达和纯化重组质粒pPRL-SCAU 经PCR 鉴定、酶切鉴定和测序证明其序列维持了正确的阅读框 架。其表达产物为1条199氨基酸残基的多肽，包含来自于载体pRSET A 的14个氨基酸残基 序列（含6His 标签），之后的PRL 成熟肽的213个氨基酸残基的片段，理论相对分子质量 约为24500。含pPRL-SCAU 重组质粒的E. coli BL21（DE3）在LB 液体培养基（含氨苄青 霉素100 g/mL）中37振摇培养，D600n

13、m 达到0.6 以上后，加入0.1 mmol /L IPTG培养4 h 时， PRL 成熟肽重组蛋白的表达量达到最高，占总菌体蛋白量30%左右；而且加入IPTG 诱导的 带有重组质粒的细菌的生长速度低于未诱导的细菌（图1，图2）；所表达的目的蛋白主要以 包涵体的形式存在。表达的蛋白在变性条件下可以用50%Ni-NTA 树脂洗脱出1 条纯化带， 且相对分子质量与预期相符。图1 重组质粒用0.1 mmol/L IPTG诱导不同时间表达产物的SDS-PAGE分析M：低相分子质量蛋白质marker; 06分别为0.1mmol/L IPTG诱导06h后的表达产物, 箭头所示为目的蛋白图2 不同浓度的IP

14、TG诱导4h后蛋白表达情况M：低相分子质量蛋白质marker；05分别为0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 mmol/L IPTG诱导4h后的表达产物2.3 重组鸡PRL生物活性检测对3月龄鸽子嗉囊外表皮肤皮内注射重组鸡PRL后的嗉囊上皮增生情况见图3。注射5g天然PRL鸽子的左侧嗉囊上皮重量极显著高于右侧未注射一侧的上皮重量（7.3 0.3）mg vs（4.30.7）mg, P0.01。注射50g 重组PRL鸽子的左侧嗉囊上皮重量也是极显著高于右侧 未注射一侧的上皮重量(11.5 0.8)mg vs（6.90.7）mg, P0.05）。但是在注射50g 重组PRL的鸽子组，作

15、为对照的右侧嗉囊上皮重量，显著高 于注射5g 天然PRL鸽子中作为对照组的、右侧未注射侧的上皮重量（6.90.7）mg vs（4.30.7）mg, P0.05）。因此，利用左侧与右 侧嗉囊上皮重量之商，再除以PRL注射质量，得出的单位PRL对上皮增生的促进作用，即换 算出的重组PRL的生物活性，在注射25g重组PRL组为天然PRL组的17%；而在注射50g重 组PRL组的左侧为天然PRL组的 16 %，在右侧为 9.6 %。因此粗略估算，重组PRL的活性应 该达到天然PRL活性的17%25%。嗉囔上皮增生干质量/mgdry weight of crop sac epithelium growt

16、h/mg141210a8a6an=6cac注射 未注射42025505 剂量/gdose/g图3 皮内注射重组PRL对鸽子嗉囊上皮增生情况。以注射中心为原点半径2cm的圆形嗉囊上皮增生干质量。同一组内相同字母表示差异不显著（P0.05）3. 讨论本试验将鸡PRL的成熟肽cDNA插入表达质粒pRSET A的Nhe I和Hind III两位点之间，所 表达的蛋白理论上由213个氨基酸残基组成,其中N端14个残基来自于质粒pRSET A的序列， 其中包含6个组氨酸残基组成的用于纯化的His-tag 标签，以及之后的199个鸡PRL的氨基酸残 基。整个重组鸡PRL的理论相对分子质量为24500。在实验

17、操作中，经过引物设计、PCR扩 增、酶切、连接克隆以及测序，验证了所需要的目的片段已经被正确克隆入表达质粒。而且 所构建的重组表达质粒表达的重组PRL相对分子质量也为24500，与以上理论值相符。同时， 由于重组蛋白可由Ni-NTA 凝胶结合并因此被纯化, 说明蛋白分子中都具有来源于表达载 体pRSET A的6个连续组氨酸序列(His-Tag)。这些结果都说明分子克隆操作和所表达的重组 蛋白分子表达的正确性。表达质粒pRSET A 是T7启动子控制下的融合表达载体, 具有高效表达的能力。因此, 以 此为基础构建的pPRL-SCAU重组表达质粒在E. coli BL21 (DE3) 中用IPTG

18、 (0.1mmol/L ) 诱 导表达4h 达到最高表达量,占总菌体蛋白量30%左右(图2)。高效原表达常常使目的蛋白形成 不溶于水的包涵体，这是蛋白在胞内互相凝集而形成的无活性颗粒，造成蛋白不能正确折叠， 使其失去生物活性。因此为了获得具有生物活性的的重组PRL，我们在变性状态下分离纯化 后的重组PRL经过一系列非恒速下降的尿素浓度和非恒速上升的pH值进行透析，对变性蛋白（已稀释）进行缓慢而连续的透析复性，使PRL分子在尿素浓度降低时能够尽量减少中间聚 集体的产生，使其能够正确折叠成为可溶性蛋白。一般一次透析后，约70%80%的重组PRL 成为可溶性蛋白。通过鸽嗉囊上皮增生的生物学测定法测定

19、重组PRL的生物活性，并与天然PRL进行了比 较。首先在两种注射剂量中，都发现促进了嗉囊上皮的增生，这一促进程度在高剂量组更为 显著；而且通过与天然PRL处理鸽子的右侧对照组相比较，高剂量组的未注射的右侧嗉囊上 皮也发生了增生。这可能是由于注射剂量过大（50 g），造成一部分PRL进入血液循环而 又促进了高剂量组（未注射的）右侧嗉囊上皮的增生。按低剂量处理鸽子的嗉囊上皮增生计 算，重组PRL的生物活性约为天然PRL的17%左右；而按高剂量组的左、右两侧嗉囊上皮增 生计算，重组PRL的生物活性应该高于天然PRL的25%。这一差异，可能说明激素的生物效 果与剂量之间并不呈等比例关系，而呈现指数比例

20、关系14。本实验所制备的重组鸡PRL生物学活性比天然PRL的活性低，主要原因可能有以下几方 面：第一是蛋白在透析复性过程中，虽然重组PRL能够溶于水，但可能分子仍具有一定的原 来包涵体的错乱构象，未能够完全恢复天然PRL分子的正确空间构象，致使活性降低。第二， 本次构建的重组PRL，在其N端具有一个来源于表达质粒的14个氨基酸标签的存在，也可能 会一定程度影响重组催乳素的空间构象及其生物活性。第三可能是原核细胞缺乏真核细胞所 特有的翻译后加工修饰系统，如糖基化，而使糖蛋白生物活性减小。有研究表示PRL各种生 物学活性由它的构象调节，PRL存在有糖基化、磷酸化、脱氨基、硫酸化和高相对分子质量 的

21、蛋白多聚体等多种形式11。鸡的PRL在第56个氨基酸残基有一个可选择的糖基化位点（Asn-Gly-Cys），而且鸡垂体分泌的天然PRL中，除了出现一个约23000的PRL外，还存在 有更多量的约26500的糖基化形式的催乳素16。因此本实验由原核表达系统生成的重组PRL 因为缺乏糖基化（相对分子质量等于理论相对分子质量），其活性要比天然PRL要低。本实 验所获得的重组鸡PRL，将能够用于今后的其它研究工作，如调控禽类卵泡发育、以及PRLR 的信号传导等。参考文献1 Freeman ME, La Kanyicska B, Lerant A, et al. Prolactin: Structure

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30、 al. Molecular cloning and characterisation of the Magang goose prolactinJ. General and Comparative Endocrinology, 2008, 155: 208-216Preparation of Bioactive Recombinant Chicken ProlactinYue Guangfang1, Chen Yitian2, Liu Ying1, Li Wanli1, Shi Zhendan11 Department of Animal Science, South China Agric

31、ultural University, Guangzhou, Wushan(510642)2 Guangdong Institute of Poultry Science, Guangzhou, Kemulang (510600)AbstractThe cDNA sequence of chicken prolactin (PRL) mature peptide was cloned into Nhe I and Hind sites of expression vector pRSET A, to construct recombinant plasmid pPRL-SCAU.The rec

32、ombinant plasmid was transfected into the Escherichia coli strain BL21 (DE3). The transfected bacteria was grown in Loria broth medium supplemented ampicillin.After induction with IPTG, the recombinant chicken PRL with a molecular mass of 24.4 kD was expressed.The maximal expression rate, accounting

33、 for 30% of the total bacteria protein, was achieved after 4 h induction with 0.1mmol/L IPTG. and existed in inclusion body. Following purification by 50% Ni-NTA agrose, the recombinant chicken prolactin was refolded by dialysis to become soluble molecules. The bioactivity of such soluble PRL was te

34、sted in 3-month old pigeons. By intra derma administration of soluble recombinant PRL into the skin above the crop sac, in comparison with native chicken prolactin purified from chicken pituitary gland, and examination of growth of crop sac epithelium, it was calculated that the bioactivity of the p

35、repared recombinant chicken prolactin is approximately 17% of that of the native chicken prolactin.This recombinant prolactin will be useful in future studies on prolactin regulation of avian reproductive and other physiological activities.Keywords: recombinant chicken PRL; expression and purification; renaturation; biological activity