补阳还五汤及有效部位生物碱和苷对大鼠血小板聚

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1、精品论文大全补阳还五汤及有效部位生物碱和苷对大鼠血小板聚集及血小板环核苷酸的影响1江劲波 1，杨静 2，邓常青*31. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙（410007）；2. 中国中医科学院西苑医院，北京（100091）；3. 湖南中医药大学病理生理实验室，长沙（410007）摘要：目的：探讨补阳还五汤及其有效部位生物碱和苷抗血小板聚集及机制。方法：大鼠 分别给予补阳还五汤原方、生物碱、苷和抵克利得，进行 ADP 诱导的血小板聚集实验。取 聚集试验前、后的血小板提取 cAMP、cGMP，采用放免法检测 cAMP、cGMP。结果：各组 血小板聚集比较，生物碱组、苷组和抵克利得组血小板聚集强度

2、与空白组相比显著降低 (P0.01)。原方组血小板聚集强度与空白组相比显著降低(P0.05)。血小板聚集后 cAMP 含 量降低（P0.01)，而原方、生物碱、苷和抵克利得均可抑制 ADP 诱导的血小板 cAMP 下 降（P0.05P0.01）。血小板聚集后 cGMP 含量降低（P0.01），原方、生物碱、苷和抵 克利得也可抑制聚集后血小板 cGMP 下降（P0.05P0.01）结论：生物碱、苷、原方和 抵克利得可抑制 ADP 诱导的大鼠血小板聚集, 各药可抑制血小板聚集后血小板内 cAMP、 cGMP 的下降，提示其抗血小板聚集作用是通过抑制聚集后血小板内环核苷酸降低而实现 的。关键词：补阳

3、还五汤有效部位血小板聚集 环磷酸腺苷 环磷酸鸟苷动脉血栓形成是心脑血管缺血性疾病的主要原因之一。在动脉血栓形成过程中，血小板 活化是其主要原因之一，其中血小板聚集是血小板活化过程中不可缺少的环节。血小板内环 磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸尿苷（cGMP）是细胞内信号传递的第二信使，各种诱导剂作 用于血小板时首先与其特异的受体作用，通过共同途径第二信使，从而促使血小板聚集，引 起血小板活化1。目前研究表明，升高cAMP、cGMP的药物能抑制诱聚剂诱导的血小板聚集 2，3。补阳还五汤是治疗缺血性脑血管病的方剂，已有的研究表明，该方具有抗动脉血栓的作 用。在对血小板活化的研究中发现，补阳还五汤对生理状

4、态下大鼠血液中血小板活化因子 (PAF)无明显影响，但对血栓形成大鼠动脉血中 PAF 含量的升高具有明显抑制作用4。大鼠 口服给药后，对电刺激动脉血栓模型和静脉血栓模型均有抑制作用5，6。新近我们研究表明， 该方中抗缺血性脑损伤的主要有效部位为生物碱、多糖、苷、苷元7，由于生物碱和苷为其 中主要的水溶性有效部位，因而推测该方中此两类有效部位也可能为其中抗血栓作用的物质 基础之一。因此，本研究从对血小板聚集及血小板 cAMP、cGMP 的影响研究了该方及有效 部位的抗血小板作用及机制。1 材料1.1 药物和试剂补阳还五汤原方由黄芪 60g、赤芍 9g、川芎 6g、当归 9g、地龙 9g、桃仁 9

5、g、红花 9g1 基金项目教育部科学技术研究重点项目（No.204100）;湖南省教育厅重点项目（No.03A033）；国家自 然科学基金项目（No. 30572301）*通讯作者：邓常青，Tel：07315381123，E-mail: dchangq；地址：长沙市韶山中路 113 号 邮编 410007。-5-组成。上述药物由本院药剂科一次性购齐，按该方组成比例制备补阳还五汤原方提取液，生药浓度 1g/ml。再由原方提取液采用酸碱沉淀、离子交换树脂层析等方法提取生物碱、苷， 浓度为生物碱 0.18g/ml，苷 0.34g/ml。两类有效部位分离完全，相互之间无混杂，以高压液 相色谱法测定有效

6、部位中质控物的含量，对两类有效部位进行质量控制，其中生物碱中川芎 嗪含量为 9.76mg/g 生物碱；苷中黄芪甲苷含量为 2.39mg/g 苷，苦杏仁苷含量为 17.9mg/g 苷。 临用前分别配制浓度为原方 750g/L,生物碱 20.9g/L,苷 163g/L。抵克利得（Ticlopidine）为杭 州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司产品，0.25g/片，批号：059，临用时以蒸馏水配成 3g/L。3.8枸橼酸钠、10水合氯醛、10三氯醋酸溶液、水饱和乙醚、全血血小板聚集专用稀 释缓冲液为国产分析纯自配；二磷酸腺苷(ADP),由苏州大学江苏省血液学研究所提供，浓度 为 50mol/L。cAM

7、P、cGMP 放射免疫分析试剂盒由上海中医药大学核医学中心提供。1.2 动物SD 大鼠，雌雄各半，体重(210.0 20.0)g，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供。2实验方法2.1 实验分组及给药方法大鼠按性别、体重分层，随机分 5 组，即空白组腹腔注射（ip）生理盐水 10ml/kg；补 阳还五汤原方组 ip 原方 11.25g/kg; 生物碱组 ip 生物碱 205mg/kg;苷组 ip 苷 1630mg/kg;抵克 利得组灌胃（ig）抵克利得 30mg/kg,。2.2 实验方法各组于实验前 12 小时按上剂量给药 1 次。禁食 12 小时。12 小时后，再给药一次，剂量同前。第 2 次

8、给药 2 小时后，以 10%水合氯醛(0.3ml/100g,ip)麻醉，分离左侧颈总动脉插管 取血，以装有 3.8%枸橼酸钠的 10ml 塑料离心管取血至 6ml，血与抗凝剂体积比为 9：1,上 下轻轻颠倒 3 次混匀。以 1000rpm 离心 10 分钟，吸取上层富血小板血浆（PRP），并取 50ulPRP 进行血小板计数。取 0.5mlPRP 加入 0.5ml 血小板聚集专用稀释缓冲液及 20ulADP，以自动平衡血小板 聚集仪（QX-200 型，上海医大仪器厂）进行全血血小板聚集实验，记录 5 分钟血小板聚集 率。取聚集后的 PRP 置于冰浴中终止反应，并于 43000rpm 离心 10

9、 分钟，弃上清液， 为聚集后血小板。取聚集前 0.5mlPRP 加入 0.5ml 血小板聚集专用稀释缓冲液 3000rpm 离心15 分钟，去上清液，为聚集前血小板。将聚集前和聚集后血小板中分别加入 0.5ml 生理盐水 使血小板悬浮，并加入 0.5ml10%三氯醋酸混匀，室温下放置 2 小时，使血小板充分破壁。1640*g 离心 10 分钟，分别吸取上清液 500l 于另一试管中，每管中加入水饱和乙醚0.5ml，混匀后，静置弃乙醚层，再反复萃取 2 次，以去除三氯醋酸。将各管管盖打开，放入烤箱中以 60烘干，待乙醚全部散尽后，即得血小板 cAMP和 cGMP，置于20保存。以上玻璃试管均硅化

10、处理。按试剂盒说明书采用放免法检测 cAMP、cGMP，并对血小板提取的 cAMP、cGMP以血小板数进行校正，结果以“pmol/109 血小板数”表示。2.3 统计方法以 SPSS10.0 进行统计分析。多组间均数比较及两两比较以单因素方差分析和 q 检验进 行分析，前后比较采用配对 t 检验。3. 结果各组血小板聚集率比较见表 1。各给药组血小板聚集率均低于空白组，以原方聚集抑制 率略低。提示各药对 ADP 诱导的血小板聚集具有抑制作用。Table 1 Comparison of platelet aggregation potency in different groups（ x s）G

11、roupnPlatelet aggregation ()Inhibition rate（）Control65.31 1.53Alkaloid63.52 0.9833.83Glycoside63.62 1.4931.95BHD64.17 1.8721.62Ticlopidine63.52 1.2833.83P0.05, P0.01, vs control group各组血小板 cAMP、cGMP 比较见表 2。各组血小板聚集后与聚集前比较，血小板内 cAMP 含量均显著降低（P0.05P0.01）。以各组聚集后血小板内 cAMP 下降率比较， 各给药组下降率均显著低于空白组（P0.05P0.01

12、）。各组血小板聚集后与聚集前比较，血小板内 cGMP 含量均显著降低（P0.05P0.01）。 以各组聚集后血小板内 cGMP 下降率比较，各给药组下降率均显著低于空白组（P0.05P0.01）。Table 2 Comparison of levels of cAMP and cGMP in platelet in different groups（ x s）GroupncAMP（pmol/109 platelet）cGMP（pmol/109 platelet）BeforeaggregationAfteraggregationDeclining rate（）BeforeaggregationA

13、fteraggregationDeclining rate（）Control519.99 4.406.40 3.7067.98 15.315.40 1.982.78 1.9448.52 9.70Alkaloid516.32 2.829.07 5.8744.42 11.105.17 2.083.69 1.3026.64 6.66Glycoside516.18 1.578.38 2.5548.21 12.055.44 1.544.19 2.0822.98 5.74BHD517.52 8.2911.09 3.7236.70 9.185.73 1.824.37 2.2523.73 5.93Ticlop

14、idine516.82 6.7610.38 3.3138.29 9.575.79 1.983.76 2.4835.06 8.76 P0.05, P0.01, vs the same group before aggregation; P0.05, ：P0.01, vs control group4. 讨论血小板彼此粘着现象称之为聚集，通过聚集体的形成，而使血流停止，是正常止血过程 的主要功能。当血小板黏附于血管破损处或受到活化剂作用后即被活化，在 Ca2+的参与下， 活化血小板的膜 GPb/a 暴露出纤维蛋白原受体。一个纤维蛋白原分子可以同时和至少 2 个 GPb/a 结合，因此血小板能通过各

15、自表面的 GPb/a 与纤维蛋白原结合而聚集成团。 血小板无力症患者的血小板缺乏 GPb/a，因而不能发生聚集反应。血小板聚集可由两类不同机制诱发，一为各种化学诱导剂,如 ADP、胶原、凝血酶、花生四烯酸等;另一类由流动状态下的剪切变应力作用所致。其中由弱诱导剂 ADP 诱导血小板聚集的机制主要是通过血 栓烷 A2（TXA2）的形成及有限的颗粒内容物的释放引起。ADP 低浓度（0.5mol/L）时引 起的聚集是可逆的，很快解聚；提高 ADP 浓度（1-2mol/L）则不解聚而出现第二相聚集波； 高浓度 ADP（5mol/L）则出现一个聚集高峰，分不出二相聚集 8。cAMP 作为血小板的第二信使

16、对血小板功能的调节有重要作用,。激活血小板的物质如 凝血酶、TXA 2、PGH2、PGG2 等多数抑制腺苷环化酶(AC) ,降低血小板内cAMP 水平, 而 升高cAMP 的药物能抑制诱聚剂诱导的血小板聚集 2。cAMP 增加时通过以下机制抑制血 小板活化: 促进Ca2+ 摄取, 抑制其释放,降低Ca2+ i 水平。血小板内Ca 2+对血小板的功能 起枢纽作用, 如血小板的形态改变、聚集和释放均是Ca2+ i 增加的结果。血小板诱聚剂 如肾上腺素、ADP、凝血酶均可通过各自受体、使Ca 2+ i 增加。血小板Ca 2+在静息状态下 大部分处于结合状态或贮存状态, 60 % 以上贮存在致密管道系

17、统中(DTS) 。cAMP 增加时 激活cAMP 依赖性蛋白激酶使DTS 膜上钙泵蛋白磷酸化，促进Ca2+ 摄取, 抑制其释放。 影响血小板肌球蛋白磷酸化, 进而抑制肌球蛋白与肌动蛋白的结合, 抑制血小板活化。由 于Ca2+ i 降低, 减少了磷脂酶C 和磷脂酶A 的激活, 从而抑制花生四烯酸(AA ) 自膜释放, 并抑制环氧化酶使前列腺素内过氧化物PGH2、PGG2 合成减少。促进PGE 2和PG I2的合成;抑制TXA2合成, 抑制凝血酶与其受体结合等 10，11。目前对cGMP作用在血小板活化中的作用认识有所不同，一般认为血小板内cGMP升高 也可抑制血小板聚集。其理由是一氧化氮（）经/

18、通路,使血小板内 升高,通过第二信使作用,调节收缩蛋白质的磷酸化水平,并使胞内2+水平下降, 从而抑制血小板的聚集 3。近年来研究发现有些抗血小板药物如一氧化氮或内皮舒张因子 (EDRF) 抗血小板聚集时cGMP 含量增加, 而cAMP无变化, 因此目前认为cAMP和cGMP在 调节血小板功能时发挥协同作用。本研究证明，在由ADP诱导的血小板聚集实验中，生物碱组、苷组、原方组和抵克利得 组均能显著抑制ADP诱导的血小板聚集。说明生物碱、苷、原方和抵克利得可抑制由ADP 诱导的血小板聚集,从而达到抗血小板活化的作用。在对血小板内cAMP、cGMP影响的研究 中发现，各药对静止状态下血小板内cAM

19、P、cGMP含量均无明显影响；血小板聚集后cAMP、 cGMP降低，而补阳还五汤原方、生物碱、苷和抵克利得均可抑制血小板聚集后细胞内cAMP、 cGMP的下降，提示补阳还五汤及其有效部位具有抗血小板聚集作用，其作用是通过抑制诱 聚剂诱导后血小板内cAMP、cGMP下降而实现的。参考文献1 韩谷鸣，姚倩，李洪莲，等.穿心莲黄酮对血小板活化反应的抑制作用及机理研究J.中国中西医结合杂 志,2000,20:527529.2 刘俊田,邱培伦.cAMP 在血小板调节中的作用J.国外医生理病理科学与临床分册,1987,7:185186.3 周忠江,叶海燕,吴赛珠,等.N前体左旋精氨酸相关肽对大鼠血小板聚集

20、、血栓形成及血浆、cGMP、2 的影响J.第一军医大学学报,1999,19 :540542.4 张继平，李长龄，张玉萍等. 补阳还五汤对大鼠动脉血栓形成前后血小板活化因子含量的影响J.中国 中西医结合杂志，1998,18:730732.5 张继平，李长龄，张玉萍，等. 补阳还五汤对大鼠动脉血栓形成前后血中血小板活化因子含量的影响J.中国中西医结合杂志，1998,18:730732.6 张继平，张玉萍，文凤妮，等. 补阳还五汤对大鼠静脉血栓形成前后静脉血中血小板活化因子含量的影 响J. 中国实验方剂学杂志，1998,4:1822.7邓常青，王敏，唐映红，等. 补阳还五汤及其有效部位组方对沙鼠脑缺

21、血再灌注后海马 CA1 区神经元损 伤的影响J.中国中医基础医学杂志，2001,7:3841.8 王振义，李家增,阮长耿等主编.血栓与止血基础理论与临床M.上海:上海科学技术出版社,2004:6371.9 许澍淮.环核苷酸与血小板功能J.生理科学进展,1992,23:318322.10 王振义.血小板功能的病理生理进展J.中华内科学杂志,1984,23:768770.Effect of Buyang Huanwu Decoction and Its Active Fractions Such as Alkaloid and Glycoside on Platelet Aggregation a

22、nd Cyclic Nucleotide in RatsJiang Jingbo1, Yang Jing 2, Deng Changqing *3(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha410007, China; 2.Xiyuan Hospital, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing100091,China; 3.Laboratory of Pathophysiology

23、 of Hunan University of Traditional ChineseMedicine, Changsha 410007, China)AbstractObjective: To explore effect of Buyang Huanwu Decoction (BHD) and its active fractions such as Alkaloid and Glycoside extracted from BHD on platelet aggregation and its mechanism in rats. Methods: The rats were admin

24、istered with BHD,Alkaloid,Glycoside, and Ticlopidine respectively and platelet aggregation was induced by ADP. The levels of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in the plasma in rats before and after platelet aggregation were measured by radioimmunoassay.

25、Results: Potency of platelet aggregation of BHD, Alkaloid, Glycoside, Ticlopidine groups were markedly lower than that of the control group (p0.05, p0.01). The levels ofcAMP were decreased after platelet aggregation (P0.01), BHD, Alkaloid, Glycoside and Ticlopidine could inhibit the decrease of cAMP

26、 induced by ADP in platelets (P0.05, P0.01). The levels of cGMP were decreased after platelet aggregation (P0.01), BHD, Alkaloid, Glycoside and Ticlopidine could inhibit the decrease of cGMP in platelets after aggregation(P0.05, P0.01). Conclusion: Alkaloid Glycoside, BHD, and Ticlopidine could inhi

27、bit platelet aggregation induced by ADP,inhibit the decrease of cAMP and cGMP after platelet aggregation. This suggested that its antiplatelet aggregation may be related to inhiting decrease of cyclic-nucleotide in platelets after aggregation.Keywords：Buyang Huanwu Decoction; Active fractions ; Platelet aggregation;Cyclic nucleotide