7O香叶基槲皮素及IGF1RsiRNA对乳腺癌细胞MDAMB231的作用研究临床医学

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1、论文题目：阳离子脂质体共载 7-O-香叶基槲皮素及 IGF-1R-siRNA 对乳腺癌细 胞 MDA-MB-231 的作用研究 摘要 .IABSTRACT .II前言 .- 1 -一、材料 .- 2 -1.1 细胞株 .- 2 -1.2 药品及主要试剂 .- 2 -1.3 实验仪器 .- 3 -1.4 所需溶液 .- 4 -1.4.1 PBS 缓冲液（pH 7.2） .- 4 -1.4.2 胰蛋白酶的配置 .- 4 -二、实验方法 .- 4 -2.1 SIRNA 的合成 .- 4 -2.2 共载药系统的构建 .- 4 -2.2.1 CDO14/GQ 载药脂质体的构建 .- 4 -2.2.2 纳

2、米共转运系统的构建 .- 4 -2.3 脂质体及共转运系统的物理性质表征 .- 5 -2.4 细胞培养 .- 5 -2.5 肿瘤细胞增殖测定 .- 5 -2.6 AO/EB 双染法色检测凋亡.- 5 -2.7 AV/PI 双染法检测细胞凋亡.- 6 -2.8 WESTERN BLOT检测蛋白 .- 6 -2.8.1 蛋白的提取 .- 6 -2.8.2 蛋白定量 .- 6 -2.8.3 蛋白样品的处理 .- 6 -2.8.4 电泳及转膜 .- 7 -2.8.5 Western blot 抗体孵育 .- 7 -2.8.6 显影 .- 7 -三、结果 .- 8 -3.1 载药脂质体及纳米共转运系统的

3、粒径及 ZETA电位 .- 8 -3.2 载药脂质体及共转运系统对细胞的增殖抑制作用 .- 8 -3.3 载药脂质体及共转运系统对细胞形态的影响 .- 9 -3.4 载药脂质体及共转运系统的促细胞凋亡作用 .- 10 -3.5 载药脂质体及共转运系统对细胞中 IGF-1R 及相关凋亡蛋白表达的影响- 11 -四、讨论 .- 12 -五、结论 .- 13 -参考文献 .- 14 -综述 .- 16 -综述参考文献 .- 21 -阳离子脂质体共载 7-O-香叶基槲皮素及 IGF-1R-siRNA对乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的作用研究摘要目的：目的：以肽头部阳离子脂质体 CDO14 为载体，

4、构建荷载 7-O-香叶基槲皮素(GQ)和 IGF-1R-siRNA（siIGF）的纳米共转运系统 CDO14/GQ-siIGF，考察其体外抗乳腺癌细胞 MDA-MB-231 作用。方法：方法：（1）用阳离子脂质体 CDO14 包载 GQ 构建载药脂质体 CDO14/GQ，将脂质体 CDO14 及 CDO14/GQ 分别与 siIGF 复合，构建基因复合物 CDO14-siIGF 及共转运系统 CDO14/GQ-siIGF；采用激光粒度仪检测基因复合物、载药脂质体和共转运系统的粒径及 Zeta 电位；（2）采用 CCK-8 法检测载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌细胞 MDA-MB-2

5、31 增殖的影响；采用 AO/EB 和 AV/PI 染色法检测载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的促凋亡作用；采用 Western blot 法考察载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中 IGF-1R 蛋白以及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。结果：结果：（1）所构建的载药脂质体、基因复合物及共转运系统的粒径均在100200 nm 之间；空白脂质体及载药脂质体的 Zeta 电位在 40-50 mV 之间，与siIGF 复合后降至 30 mV 左右。 （2）CCK-8 法检测表明，siIGF

6、和 GQ 均能抑制人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的增殖，二者合用后抑制作用增强；AO/EB 和 AV/PI 染色结果表明，siIGF 和 GQ 均能促进人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 凋亡，二者合用后促凋亡作用增强；Western blot 分析表明，CDO14/GQ-siIGF 能下调 IGF-1R 蛋白表达，上调促凋亡蛋白 Bax 和 Caspase-3 的表达，下调抑凋亡蛋白 Bcl-2 的表达，作用强于单用 CDO14/GQ 或 CDO14-siIGF。结论：结论：纳米共转运系统 CDO14/GQ-siIGF 荷载的 GQ 与 siIGF 具有协同抗乳腺癌作用。关键词：乳腺癌

7、 7-O-香叶基槲皮素 siIGF 纳米共转运系统 脂质体Effects of 7-O- geranylquercetin and IGF-1R-siRNA codelivered by a cationic liposome on breast cancer cell line MDA-MB-231Tu YananABSTRACTObjective: To construct a nanosystem for the co-delivery of 7-O-geranylquercetin (GQ) and IGF-1R-siRNA using the peptide cationic lip

8、osome CDO14 as a vector and investigate their synergistic effects to breast cancer cell line MDA-MB-231 in vitro.Methods: (1) Drug-carrying liposome CDO14/GQ was constructed by loading GQ with cationic liposome CDO14. Liposomes CDO14 and CDO14/GQ were combined with siIGF to form the complex CDO14-si

9、IGF and co-delivery system CDO14/GQ-siIGF, respectively. Particle size and Zeta potential of the the complex, drug-carrying liposomes and co-delivery system were characterized by laser particle size analyzer. (2) CCK-8 assay were used to detect the effect of the complex, drug-carrying liposome and c

10、o-delivery system on the viability of MDA-MB-231 cells. AO/EB and AV/PI staining were used to detect the pro-apoptosis effect of the complex, drug-carrying liposome and co-delivery system on MDA-MB-231 cells. Western blot assay was used to detect the expression of IGF-1R protein and apoptosis-relate

11、d proteins Bcl-2, Bax and Caspase-3 in MDA-MB-231 cells.Results: (1) The particle sizes of liposome CDO14, complex CDO14-siIGF and co-delivery system CDO14/GQ-siIGF were 100200 nm, the Zeta potential of CDO14 and CDO14/GQ were 40-50 mV which then decreased to about 30 mV after combining with siIGF.

12、(2)CCK-8 assay showed that both CDO14-siIGF and CDO14/GQ could inhibit the proliferation of cells, and the inhibitory effect was enhanced after their combination. AO/EB and AV/PI stainingsindicated that both CDO14-siIGF and CDO14/GQ could promote the apoptosis of cells, and the pro-apoptosis effect

13、of CDO14/GQ-siRNA was more remarkable than that of CDO14/GQ and CDO14-siIGF. Western blot assay demonstrated that CDO14/GQ-siIGF more significantly down-regulated the expression of IGF-1R and Bcl-2, up-regulated the expression of Bax and Caspase-3 compared with CDO14/GQ and CDO14-siIGF.Conclusion: G

14、Q and siIGF in the co-delivery nanosystem showed synergistic effect to breast cancer cell MDA-MB-231.Key words：7-O-geranylquercetin IGF-1R-siRNA co-delivery nanosystem liposome- 1 -前言近些年来，由于我国工业化程度的不断加深、人口老龄化的日益严重、生活环境愈发恶劣以及不健康的现代生活方式，中国居民患癌率逐年上升。根据最新的统计数据，癌症已经成为威胁中国居民生命健康的主要疾病之一。其中乳腺癌发病率是所有类型癌症的前五名

15、，女性发病的首位，而且乳腺癌致死约占女性全部死因的五分之一1。乳腺癌源于乳腺的腺上皮组织细胞的癌变，而且乳腺癌细胞非常松散，容易脱落并随着血管或者淋巴管播散至全身，对生命造成巨大威胁。目前针对乳腺癌的治疗，一般是根据患者的身体条件和癌细胞的发展程度，酌情采取手术切除、放疗这类局部疗法或化疗这种全身疗法。但是这些传统的疗法存在较大的局限性，比如化疗会造成比较严重的全身毒性，而且容易使癌细胞产生抗药性，严重影响治疗效果。基因治疗具有高疗效、强靶向作用和低毒性的特点，是一种极具潜力的治疗乳腺癌的手段。基因治疗是通过基因载体将治疗基因传递到靶细胞，然后通过治疗基因作用于靶点基因，起到治疗的效果。基因沉

16、默是基因治疗的一种常见的手段，它通过将小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)传递到靶细胞，与靶 mRNA 结合成双链 RNA，然后被 RNA 诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）水解，从而抑制靶细胞内靶基因的表达，达到治疗目的2,3。因为 RNA 具有很高的特异性，所以基因沉默有效的避免了全身毒性，且具有很高的疗效，远远优于传统的化疗4-6。但是 RNA在人体中很容易被降解，这一缺陷导致该疗法很难用于临床，而开发一种高效、靶向的基因载体是解决这一问题的重要方法。胰岛素样生长因子（Insulin-like g

17、rowth factors, IGFs）信息系统能够调控细胞的增殖、分化、成熟和凋亡7,8。IGFs 信息系统由 IGFs，胰岛素样生长因子受体（Insulin-like growth factor 1, 2 receptor, IGF-1R, IGF-2R）和胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-like growth factor-binding proteins, IGFBP）这三部分组成。该系统对机体的调控机制是在 IGFBP 的调控下，不同类型的 IGFs 与 IGFs 受体结合，释放不同信号，诱导下游细胞进行增殖、迁移、凋亡等活动9。据已有研究表明，IGFs 信息系统与癌症的产

18、生和发展有着密切联系，因此 IGFs 系统是基因治疗的理想靶点10,11。利用 IGFs 系统作为靶点治疗癌症有三种方式，分别是抑制 IGFs 的产生、抑制 IGFs 受体的活性、调节IGFBP 的功能。阳离子脂质体（cationic lipsome）是目前应用最多的非病毒基因载体，具有易制备、低毒性、易代谢、不易引发免疫排斥、转染效率高的优点12。其基本结构类似于磷脂双分子层，并带有正电荷，能够与靶基因上的负电荷作用，可以延长治疗基因或药物在体内的存留时间，提高治疗效果。本研究中使用本课题组自主开发的肽头部阳离子脂质体 CDO14，前期研究证明，这种阳离子脂质体比市面上的商品脂质体更加高效、

19、- 2 -安全、毒副作用小13,14。槲皮素是一种广泛分布于植物体内的类黄酮复合物，具有抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒、保护心脑血管等多种效用，而且有研究表明，槲皮素是已知的最强抗癌药物之一，在极低的浓度就能够抑制癌细胞的增殖15-17。7-O-香叶基槲皮素(7-O-geranylquercetin, GQ)是本课题组自主研发的一种槲皮素的氧烃化衍生物。根据之前研究结果，发现相比于槲皮素，该衍生物的脂溶性更好，抗癌效果更明显19。综合疗法是癌症治疗的一个重要治疗手段，基因治疗与化疗联用以提高治疗效果是当前研究的热点。本研究以自主开发的肽头部阳离子脂质体 CDO14 为载体，负载抗肿瘤药物 7-O-

20、香叶基槲皮素和 IGF-1R-siRNA，构建纳米共载药系统，并研究该系统对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的体外抗肿瘤效果，以期开发一种治疗乳腺癌的有效手段，并为肿瘤的协同疗法开拓思路。一、材料1.1 细胞株人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞，购于中科院上海细胞生物学研究所。1.2 药品及主要试剂肽型阳离子类脂质 CDO14、7-O-香叶基槲皮素为本实验室自主设计、合成，结构经质谱和核磁共振鉴定；经过柱层析、重结晶等方法纯化，经过 HPLC 测定，纯度大于 98%。DMEM 培养基：Gibco，美国胎牛血清：Gibco，美国二甲亚砜(DMSO)： Solarbio，西班牙胰酶：Gibc

21、o，美国PBS：中杉金桥，北京Cell Counting Kit-8 （CCK-8）：biotool，中国AO/EB 双染试剂盒，Solarbio，北京Annexiin V-FITC 凋亡试剂盒：三箭生物，天津甲醇（色谱纯）：TEDIA，美国siRNA：Invitrogen，美国96 孔细胞培养板、24 孔细胞培养板购自中国 Nest Biotechnology 公司RIPI 裂解液（强）：碧云天，上海BCA 蛋白浓度测定试剂盒：碧云天，上海- 3 -2loading buffer：Takara，日本丙烯酰胺：Solarbio，北京SDS：Solarbio，北京过硫酸铵：Solarbio，北京

22、TEMED：Sigma，美国Tris：Solarbio，北京ECL 化学发光自显影试剂盒：碧云天，上海兔抗人 IGF 抗体：Proteintech，美国兔抗人 Bcl-2 抗体：Proteintech，美国兔抗人 Caspase-3 抗体：Proteintech，美国兔抗人 Bax 抗体：Proteintech，美国兔抗人 actin 抗体：Proteintech，美国HRP-羊抗兔 IgG 抗体：Proteintech，美国彩虹 Marker：Thermo，美国脱脂奶粉：BD，美国1.3 实验仪器超净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备，上海二氧化碳培养箱Thermo 公司，美国超纯水装置Ca

23、scada 公司，美国XQ-LS-S2 高压灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂，上海H-1650 离心机湘仪，长沙酶标仪倒置显微镜 TE200-UThermo 公司，美国Nikon 公司，日本HC-3081R 高速冷冻离心机中科中佳科学仪器有限公司，安徽微量移液器Eppendorf 公司，德国AL104 电子天平Mettler-Toledo 公司，美国荧光显微镜 TE2000-UNikon 公司，日本流式细胞仪Becton Dickinson 公司， 美国激光散射粒度仪DYY-6C 型湿转电泳仪脱色摇床凝胶成像仪Horiba 公司，日本北京六一仪器厂，北京六一仪器厂，北京Thermo 公司，

24、美国- 4 -1.4 所需溶液1.4.1 PBS 缓冲液（pH 7.2）NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO412H2O 3.58 g，KH2PO4 0.27 g，溶解于 0.8 L 三蒸水中，调 pH 值至 7.2，定容至 1 L。121 高压灭菌 30 min，4 保存。1.4.2 胰蛋白酶的配置精密称取 0.25 g 胰蛋白酶粉末和 0.02 g EDTA-2Na，用 PBS 缓冲液充分溶解并定容至 100 mL，用 0.22 m 微孔滤膜滤过除菌，无菌分装后至 4 冰箱保存。二、实验方法2.1 siRNA 的合成siRNA由上海吉马公司合成。IGF-1R-siRN

25、A以下简称siIGF，阴性对照siRNA以下简称siN.C（此序列不与人类基因序列同源），序列见表1。表1 siRNA的序列siRNA 名称siRNA 序列Sense 5-UAGAUAUCUCGCGUCAUACdTdT-3siIGFAntisense 3-GUAUGACGCGAGAUAUCUAdTdT-5Sense 5-CACAAGUAGGAAGUUCGGAdTdT-3siN.CAntisense 3-UCCGAACUUCCUACUUGUGdTdT-52.2 共载药系统的构建2.2.1 CDO14/GQ 载药脂质体的构建称取 GQ 0.1 mg、类脂 CDO14 1 mg 、10 mg/mL

26、DOPE 80.4 L 和甲醇 1 mL 混匀，用旋转蒸发仪蒸发 5-10 min，取 1 mL 三蒸水水化。储存于冰箱 4 ，备用。2.2.2 纳米共转运系统的构建将载药脂质体 CDO14/GQ 经超声处理后取 25 L 加入无血清培养基至体积达 500 L，混匀，即得到脂质体稀释液；取 siIGF 1 g/L 母液 1 L，加入无血清培养基至体积达 500 L，混匀，即得到 siIGF 稀释液；最后将 siIGF 稀释液缓慢加入脂质体稀释液中，混匀并避免出现沉淀，混合液室温静置 20 min，形成脂质体基因复合物。- 5 -2.3 脂质体及共转运系统的物理性质表征用激光散射粒度仪，于 25

27、 ，光散射角度 90条件下检测制备的载药脂质体的粒径及 Zeta 电位。具体实验步骤如下：打开仪器和软件，让仪器预热 30 min，载药脂质体超声 10 min，用移液枪取 20 L 制备的载药脂质体稀释于 1 mL 三蒸水中，分别检测粒径和 Zeta 电位。2.4 细胞培养将人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于装有含10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶中，于37 、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养24 h。待细胞生长至单层汇合时，吸取并弃去细胞培养液，用已经于37 水浴中预热的PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化，适时吸弃胰蛋白酶，待所有细胞收缩呈

28、圆形时，立即加入培养基以终止胰酶的消化作用。后反复轻轻吹打，以制成细胞悬液，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬后按适当的比例传到新的培养瓶中继续培养。2.5 肿瘤细胞增殖测定取人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞，以 4000-5000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，使每孔最终细胞悬液体积为 100 L。将细胞培养于 37 、5% CO2、100%湿度的培养箱中，孵育 18-22 h 后使细胞密度达到约 50%。用脂质体 CDO14 荷载 siIGF，其中CDO14：siIGF=25：1，使 CDO14 与 siIGF 复合，室温下静置 20 min，形成复合物。设置空白组、

29、Control 组、CDO14-siN.C 组、CDO14-siIGF 组、CDO14/GQ 组及CDO14/GQ-siIGF 组，每组 6 个复孔。每孔中 siIGF 用量为 0.1 g，CDO14 用量为 2.5 g，GQ 终浓度为 5 M。给药后的培养板置于 37 、5% CO2、100%湿度的培养箱中继续培养 24 h。然后用 CCK-8 法进行细胞增殖测定。用在 37 水浴下预热后的 PBS洗涤细胞培养板 3 次，每次 100 L。在避光条件下每孔加入空白培养基 100 L 和CCK-8 溶液 10 L，再继续在 CO2培养箱中孵育 1-2 h。后用酶标仪测定 450 nm 下的吸光

30、度，利用 OD 值计算出细胞增殖率（ODtreatment-OD空白）/(ODcontrol-OD空白)100%）。2.6 AO/EB 双染法色检测凋亡将人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞以 2-3104个/孔的密度接种于 24 孔细胞培养板中，使每孔最终细胞悬液体积达 1 mL。将细胞于 37 、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养 24 h 后，分别加入不同药物，设置 Control 组、CDO14-siN.C 组、CDO14/GQ 组、CDO14-siIGF 组和 CDO14/GQ-siIGF 组。再于 CO2培养箱中培养 24 h，去掉培养基，- 6 -用已于 37 水浴预热的

31、PBS 洗 2 遍，按照 1 mL PBS 中加入 20 L 工作液的比例配制染色液，再每孔加入 500 L 前述染色液，室温放置 2-5 min 后于荧光显微镜下观察。2.7 AV/PI 双染法检测细胞凋亡将人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞以 0.5-2105个/孔（每孔细胞悬液 2 mL）的密度接种于 6 孔板，孵育培养 24 h。设置 Control 组、CDO14-siN.C 组、CDO14/GQ 组、CDO14-siIGF 组和 CDO14/GQ-siIGF 组。按照分组加药处理细胞，每孔中 siIGF 用量为2 g，CDO14 用量为 50 g，GQ 终浓度为 5 M。培养 2

32、4 h 后用 PBS 清洗一遍，加入适量 0.25%胰酶消化液，1200 rpm 离心 5 min，弃上清，收集细胞。将收集的细胞重悬于 500 L 结合缓冲液，加入 5 L Annexin V，于室温下避光孵育 10 min 后加入 5 L PI，避光室温孵育 5 min，加入 500 L PBS，使用流式细胞仪 1 h 内检测。2.8 Western blot 检测蛋白2.8.1 蛋白的提取将人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞以 0.5-2105个/孔（每孔细胞悬液 2 mL）的密度接种于 6 孔板，孵育培养 24 h。设置 Control 组、CDO14-siN.C 组、CDO14/G

33、Q 组、CDO14-siIGF 组和 CDO14/GQ-siIGF 组。按照分组加药处理细胞，每孔中 siIGF 用量为2 g，CDO14 用量为 50 g，GQ 终浓度为 5 M。将 6 孔培养板放置于培养箱中继续培养 24 h。弃去上清培养基，用 PBS 液洗涤细胞 3 遍。每孔加入 1 mL 的 PBS，用细胞刮棒刮下细胞并收集于 1.5 mL EP 管中，1000 rpm 离心 5 min，弃上清，每 EP 管加入 100 L 裂解液(含 1% PMSF)，冰上裂解 20 min，每 5 min 将 EP 管中混合物进行混匀震荡，裂解完毕后于 12000 rpm、4 离心 5 min，

34、吸出细胞上清液，并移入另一个EP 管中放置于-80 冰箱保存备用。2.8.2 蛋白定量用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定提取的蛋白浓度。然后根据测定结果将各组蛋白浓度调整至实验所需的同一浓度备用。2.8.3 蛋白样品的处理取调整浓度后的蛋白样品，分别加入适量的 2Loading buffer，等体积稀释至1Loading buffer。置于沸水浴中，100 加热 5 min 使其变性，冷却至室温后于-20 保存。- 7 -2.8.4 电泳及转膜根据目标蛋白分子量配制适宜比例的 SDS-PAGE 分离胶，并制备 5%的浓缩胶，待胶凝后加电泳缓冲液，用准备好的蛋白样品进行上样，保证每孔上样量、上样

35、浓度均相同。蛋白通过浓缩胶层时使用电压为 80 V，分离胶层电压 120 V，直到溴酚蓝指示剂到达分离胶层的底部，停止电泳。根据相应分子量的蛋白 Marker 切取所需蛋白所在位置的凝胶，并剪取与凝胶大小相同的 PVDF 膜。PVDF 膜放入甲醇中活化 10 s 后再放入转膜缓冲液中浸润 1 min。在转膜仪的阳极一侧按顺序依次放入海绵垫、3 张滤纸、PVDF 膜、凝胶、3 张滤纸、海绵垫，标记 PVDF 膜以了解蛋白顺序，尽量排除气泡，采用湿转法转膜。2.8.5 Western blot 抗体孵育转膜完成后，取出 PVDF 膜，首先用 5%的脱脂奶粉对 PVDF 膜进行封闭。在室温下置于摇床

36、慢摇封闭 2 h。封闭后取出 PVDF 膜用 TBST 缓冲液清洗，之后将 PVDF 膜孵育特定一抗，4 孵育过夜；次日，将 PVDF 膜从一抗中取出，用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，之后弃去 TBST。将 PVDF 膜孵育至相对应的二抗中，室温下置于摇床慢摇 2 h。之后，将 PVDF 膜从二抗中取出，继续用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，之后弃去 TBST。表 2 蛋白的名称、分子量、分离胶浓度、转膜时间及抗体稀释比例蛋白名称分子量（kDa）分离胶浓度转膜时间（min）抗体稀释比例-actin4312%431:3000bax2030%201:3000bcl-2

37、2630%261:1500casepase-33212%321:1000IGF-1R10012%1001:15002.8.6 显影使用 ECL 发光液，按照 ECL 试剂盒的说明书操作，进行显色反应。取适量 A 液和 B 液 1：1 充分混匀，制备成显影工作液。首先将 PVDF 膜放置于凝胶成像仪中，在PVDF 膜上均匀滴加显影工作液，保证显影液均匀的覆盖在整个膜上，开始显影，曝光时间约为 30 s2 min，并于分析软件中进行灰度分析，以 actin 作为对照校正系统误差后，作为蛋白表达的相对水平。- 8 -三、结果3.1 载药脂质体及纳米共转运系统的粒径及 Zeta 电位载药脂质体 CDO

38、14/GQ、CDO14 与 siN.C 形成的复合物、CDO14 与 siIGF 形成的复合物、CDO14/GQ 与 siIGF 形成的复合物的粒径均在 100-200 nm 之间。载药脂质体CDO14/GQ 的 Zeta 电位在 40-50 mV 之间，CDO14 与 CDO14/GQ 分别与 siIGF 形成的复合物及共转运系统的 Zeta 电位在 30 mV 左右。由于脂质体带正电荷，荷载带负电荷的 siIGF 后 Zeta 电位下降。表 2 载药脂质体及共转运系统的粒径及 zeta 电位脂质体粒径(nm)PDI Zeta 电位CDO14/GQ164.80.275 44CDO14-siN

39、.C178.80.308 36.9CDO14-siIGF171.20.170 27.1CDO14/GQ-siIGF172.10.354 32.73.2 载药脂质体及共转运系统对细胞的增殖抑制作用各载药系统作用于人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞 24 h 后，用 CCK-8 法检测其增殖率。如图 1 所示，CDO14-siN.C 对细胞存活无明显影响；CDO14-siIGF 及 CDO14/GQ对细胞增殖有一定抑制作用；CDO14-siIGF 与 GQ 共载给药后明显抑制细胞增殖。结果表明，脂质体 CDO14 能荷载 GQ 或 siIGF 进入细胞，并且 GQ 和 siIGF 能抑制MDA-

40、MB-231 细胞增殖，以 CDO14 共载 GQ 和 siIGF 具有协同抑制作用。- 9 -图 1 载药脂质体及共转运系统对 MDA-MB-231 细胞增殖的影响与 Control 组比较*p0.013.3 载药脂质体及共转运系统对细胞形态的影响人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞经 AO/EB 染色后在倒置荧光显微镜下观察，由图 2可见，仅给予 CDO14-siN.C 与 Control 组相比没有明显差别，仍呈现明亮绿色荧光；单独给予 CDO14-siIGF 或 CDO14/GQ 后细胞数减少，部分细胞呈橘黄色荧光；CDO14/GQ-siIGF 共载给药时，与单独荷载 GQ 或 siI

41、GF 相比，细胞凋亡更加明显，呈橘黄色荧光的细胞数增加。实验证明细胞在 siIGF、GQ 以及二者联合作用下产生了凋亡，联合给药增强了促凋亡作用。- 10 -图 2 载药脂质体及共转运系统对 MDA-MB-231 细胞形态的影响3.4 载药脂质体及共转运系统的促细胞凋亡作用本实验采用流式细胞仪检测载药脂质体及共转运系统对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的促凋亡作用。由图 3 可见，仅给予 CDO14-siN.C 与 Control 组相比没有明显差别；单独给予 CDO14-siIGF 或 CDO14/GQ 后细胞凋亡数增加；CDO14/GQ-siIGF 共载给药时，与单独荷载 GQ 或 s

42、iIGF 相比，细胞凋亡更加明显。实验证明细胞在 siIGF、GQ以及二者联合作用下产生了凋亡，联合给药增强了促凋亡作用。Comment l1: 星号太小看不清Comment U2: 老师，已经改了- 11 -图 3 载药脂质体及共转运系对 MDA-MB-231 细胞的促凋亡作用与 Control 组比较*p 0.013.5 载药脂质体及共转运系统对细胞中 IGF-1R 及相关凋亡蛋白表达的影响本实验采用蛋白印迹法考察了 GQ 与 siIGF 共载给药对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中 IGF-1R 蛋白及凋亡相关蛋白表达的影响。结果如图 4 所示，细胞经 CDO14-siIGF、CDO

43、14/GQ 及 CDO14/GQ-siIGF 作用 24 h 后，均可使 Bcl-2 表达下调，Caspase-3、Bax 表达上调，其中共转运系统较 CDO14/GQ 或 CDO14-siIGF 单独作用增强；CDO14/GQ、CDO14-siIGF、CDO14/GQ-siIGF 作用细胞 24 h 后均可下调 IGF-1R蛋白表达。- 12 -图 4 载药脂质体及共载药系统对 MDA-MB-231 细胞中 IGF-1R 及相关凋亡蛋白表达的影响与 Control 组比较*p 0.01四、讨论基因治疗是一种极具潜力的癌症治疗手段，但是目前的实际疗效仍然有限。将化学疗法与基因治疗联用，开发出一

44、种协同抗癌系统，既可减少化疗用药的剂量，降低化疗的全身毒副作用及抗药性，也可以达到治疗的效果20。本研究以自主开发的肽头部阳离子脂质体 CDO14 为载体，负载抗肿瘤药物 GQ 和 siIGF，构建纳米共载药系统，而且研究发现对乳腺癌有良好的治疗作用。- 13 -目前，常用的阳离子脂质体有 DOTAP 和 lipofectamine2000。两者都是优良的基因治疗载体，但是均存在一定缺陷，如 DOTAP 转染的效率相对较低，lipofectamine2000细胞毒性较大。本研究中使用的 CDO14 是本课题组自主开发出的脂质体，其转染效率与 lipofectamine2000 相近，而毒性比

45、DOTAP 还低，性能远远高于上述常用脂质体14,21。本课题组前期的研究发现，CDO14 递送的 GQ 能有效抑制非小细胞肺癌 A549 和NCI-H1975 细胞的增殖，并促进其凋亡，也能对乳腺癌 MCF-7 细胞发挥促凋亡作用19,22。还发现负载 survivin siRNA 或 IL-10 siRNA 与 GQ 的 CDO14 共载药系统对乳腺癌细胞也有明显的抑制增殖和促凋亡作用,且作用强于脂质体单独递送 GQ、survivin siRNA 或 IL-10 siRNA23。IGF-1R 与癌细胞的增殖、转移、凋亡有着密切联系，是十分理想的基因治疗靶点。本研究发现 CDO14/GQ-s

46、iIGF 共转运系统对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞也存在促凋亡作用。载药脂质体的粒径、Zeta 电位、稳定性、生物活性等性质与脂质体和被负载药物的质量比有着密切关系。课题组之前的研究结果表明，当 siIGF 与阳离子脂质体CDO14 的质量比为 1：3 时，转染人乳腺癌 MCF-7 细胞的效率最高。当阳离子脂质体CDO14 与 GQ 质量比为 10：1 时，脂质体的包封率和负载 GQ 后的形态最好。基于之前的结果，本研究通过预实验重新确定制备载药脂质体的最佳质量比，发现当 siIGF和 CDO14/GQ 的质量比为 1：25 时，转染效率和 GQ 载药量较好且没有明显的毒性。本实验只初

47、步研究了 CDO14/GQ-siIGF 共转运系统在体外对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞活性的影响、促凋亡作用以及相关蛋白的影响，其深入的分子机制及体内作用还有待进一步研究。五、结论1.成功构建了以阳离子脂质体 CDO14 为载体，共载化学药物 GQ 和基因 siIGF 的纳米共转运系统 CDO14/GQ-siIGF。2.共转运系统 CDO14/GQ-siIGF 能够抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的增殖，促进其凋亡；其作用强于脂质体单独递送 GQ 或 siIGF；GQ 和 siIGF 具有协同抗肿瘤作用。- 14 -参考文献1 陈万青, 郑荣寿. 中国女性乳腺癌发病死亡和生存状

48、况J. 中国肿瘤临床, 2015, 42(13): 668-674.2 Halic M, Moazed D. Dicer-independent primal RNAs trigger RNAi and heterochromatin formationJ. Cell, 2010, 140(4): 504-516.3 孙平, 赵微, 刘毅玲. RNA 干扰技术的原理与应用J. 医学综述, 2011, 17(2): 164-167.4 Zhang Y, Li HM, Sun J. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: A comparative study of th

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62、生命的威胁愈发突出。传统治疗手段包括手术切除，化疗，放疗及综合疗法。传统疗法存在疗效差，易复发，对病人伤害大等缺陷。在过去的几十年里，随着基因技术的发展，基因治疗有望成为肿瘤的一线治疗方案。相对于传统疗法，基因治疗具有高效性，特异性，低脱靶毒性等优点。在基因治疗的各种载体中，纳米颗粒因其优异的性能（低毒，可控，高效，多功能）而受到广泛关注。本文综述了基因治疗和基因治疗载体的发展概况，并重点介绍了纳米颗粒在肿瘤基因治疗中的设计和应用的最新进展，挑战和展望。1.肿瘤基因治疗概况根据最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的 23.91，恶性肿瘤已经成为严重威胁中国居民健康的主要公共卫生问题之

63、一。近十几年来，恶性肿瘤的发病率、死亡率均呈持续上升趋势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过 2200 亿，防控形势严峻。近些年来，肿瘤的治疗手段进步了很多，但效果仍然有限1。即使是在前期能进行有效治疗的前列腺癌和乳腺癌，也很容易复发并表现出极强的抗药性。化疗虽然控制比以前更好，但是其引起的毒性依然会造成恶心、口腔溃疡和认知障碍等副作用。相同地，放疗也会导致腹泻、粘膜炎、皮肤毒性和口干等副作用。同时，长期的化疗或放疗可能会诱导其他类型的癌症的产生2。因此，大量的研究工作致力于开发新的治疗方法，以提高疗效和减少脱靶毒性。所谓基因治疗就是将特异性的外源基因负载到基因载体上，导入靶细胞中，然后通过外源基

64、因的表达、抑制、校正、替代或补偿病变基因，以达到治疗的目的。1990年，美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一项基因治疗研究，治愈了一个患有腺苷脱氨酶缺乏症的四岁女孩3。自此，基因治疗成为研究的热点，而且大部分基因治疗试验都是针对实体和血液恶性肿瘤的治疗。迄今为止，有多例慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、脑癌和其他的肿瘤的基因治疗的成功试验已被报道，然而却只有少数基因治疗产品能在临床得到应用。这些案例表明，基因治疗虽然在肿瘤治疗方面具有很好的前景，但是它们的临床应用依然饱受限制4。其根本原因在于目前的基因治疗还存在药效和药代动力学差、靶点特异性差、全身给药毒性大的缺点，而基因治疗载体的

65、发展是解决这些问题的重要途径。纳米颗粒，粒径一般为 1-1000 nm，可以由多种材料合成，具有良好的生物相容性，对细胞的生长和代谢没有明显的影响。并且可以通过设计特定结构的纳米分子，实现对肿瘤的靶向，提高基因传递效能5。纳米颗粒能够改善基因治疗的药代动力学、提高对肿瘤靶向能力、携带多个治疗基因，是一种具有极大潜力的基因治疗载体。2.肿瘤基因治疗方法2.1 自杀基因治疗- 17 -自杀基因治疗是各种基因治疗方法中疗效较好，发展前景较大的方法，也称为分子疗法。自杀基因治疗的作用机制是通过自杀基因表达，产生治疗性蛋白或将无毒化合物转化为有毒药物，杀死肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。在已报道自杀基

66、因系统中，腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)，胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)，BCL-2 样蛋白 4 基因(BAX)以强烈的肿瘤细胞毒性而受到广泛关注。HSV-tk/GCV 是目前研究最深入的自杀基因治疗系统之一。HSV-tk 基因可产生病毒胸苷激酶，该激酶可将无毒前体 GCV 磷酸化为单磷酸更昔洛韦，并通过宿主激酶进一步转化为三磷酸 GCV。三磷酸 GCV 取代 DNA 合成过程中的鸟嘌呤5三磷酸，阻碍 DNA 链的延长，诱导肿瘤细胞凋亡。这种方法在一些癌症的临床前和临床治疗中显示出良好的疗效6。同样地，CD 能将无毒前体 5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为 5-氟尿嘧啶(5-FU)，再通过内源性酶转化为强效嘧啶抗代谢物(5-FDUMP, 5-FDUTP, 5-FUTP)，诱导细胞凋亡。CD/5-FC 系统在神经胶质瘤、神经鞘瘤和乳腺癌中的疗效已得到证实7。BAX 是 BCL-2 蛋白家族中首次发现的促凋亡蛋白。它通过激活细胞凋亡蛋白酶通路并诱导凋亡分子(如细胞色素 c)从线粒体释放到细胞质，从而在细胞内传递促凋亡信号。通过这种机制，过