生物腐殖酸高产菌株的筛选

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1、 实习报告 题 目：生物腐殖酸高产菌株的筛选 姓 名： 黄 兆 峰 学 号： 080500130 学 院： 生物科学与工程学院 专 业： 微生物工程 年 级： 2005 生物腐植酸高产菌株的筛选摘要：腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中，目前已在工农业、医学与环境保护等方面发挥着重要的作用。福建省诏安县绿洲生化有限公司自主研制的生物腐植酸，富含多种有益微生物，已在水产养殖、水质改良、发酵泥炭生产高养分绿色环保肥料等方面取得了良好的社会经济效益。但由于生产仍是土法建堆的模式，并未筛选功能明确的

2、发酵菌种进行发酵，因此存在产酸低、产品质量不稳定等缺陷。为此，本课题以工厂发酵原料与发酵产品为基质，进行腐植酸高产菌株的分离筛选，测试初筛的单一菌株产腐植酸的能力，并开展了优势单一菌株的复合发酵与扩大发酵研究，结果如下：1）从发酵蔗渣原料与发酵产品中进行菌种分离，经耐45高温和降解纤维素试验，共初筛获得12株能在45下生长且降解纤维素良好的菌株，其中细菌11株，霉菌1株。2）将初筛的菌株以模拟工厂发酵生产腐植酸的条件对其产腐植酸能力进行测试。通过300ml三角瓶发酵,以产腐植酸为指标，测定分离菌株25号菌和A号菌产腐植酸为最优，12#和E号菌次之。其中25号菌株腐植酸含量增长为6.98%，A号

3、增长6.63%，12号菌增长5.63%， E号增长5.22%。由于A号菌为霉菌，所以暂不考虑其发酵能力。故筛选出12号菌，25号菌和E号菌为优势菌株。关键词：菌种筛选，腐植酸含量，分离纯化 第一章 前言1.1腐植酸的概述腐植酸（Humic Acid, 简称 HA）是有机物质经微生物一系列分解和合成而形成的一种多种类分子有机物，它广泛存在于风化煤、泥炭和褐煤中。近年来，腐植酸类物质的应用越来越广，涵盖了农业、医药、工业等多个领域。腐植酸在农业上的应用以肥料为主。一方面，其本身就可以促进作物呼吸和新陈代谢、促进各种酶特别是糖转化酶的活性、促进细胞发育和植物生长、增强植物吸收养分能力等，从而提高作物

4、的产量。另一方面，腐植酸对化肥和微肥有明显的增效作用，它能与化学肥料复配成有机无机复合肥，增加肥效，减少化肥被固定和流失，提高化肥的利用率；同时，腐植酸结构单元上含有羧基、羟基、醇羟基、醌基、半醌基、甲氧基、烯醇基、胺基等多种活性功能团，作为一种源广价廉的天然螯合剂，腐植酸与土壤中难溶于水的微量元素等螯合后使得微量元素很容易被作物吸收和运转。自然界腐植酸广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及煤炭中。我国是腐植酸资源大国，其资源储量大，分布广，品位好1，2,3。近年来，我国也通过秸杆发酵生产人工合成腐植酸类物质的生化腐植酸4。腐植酸类物质的基本性质和特征决定了它在保持农业生态系统健康中有着重要的应

5、用意义，因而也越来越引起人们的重视5。1.2 腐植酸的形成关于腐植酸形成的微生物学机理在20世纪主要有七种影响着我国学术界。一是瓦克斯曼提出的木质素-蛋白质复合体学说；二是威廉斯提出的微生物作用学说；三是微生物合成假说；四是植物和微生物细胞自溶假说；五是科诺诺娃学说；六是恩德斯提出的植物残体形成腐植酸的过程和煤化机制；七是我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论,即水解阶段产酸阶段合成和聚合阶段。指出参与厌氧发酵形成腐植酸的微生物不是一个纯菌种,而是由多个微生物生理群联合作用的结果。在此对我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论进行阐述。边文骅学者从自然界选取优

6、质活性污泥为菌种，在室内富集培养扩大，优化生产条件，在500mL、5000mL发酵器发酵试验的基础上，扩大为1m3、20m3环流厌氧发酵器的中试生产规模均获得了良好的效果。从而认识到，腐植酸是有机物质（动、植物残体）在适当的温度、湿度、酸碱度和厌氧条件下，通过功能不同的多种微生物的代谢，形成腐植酸的过程，这一过程大概分为三个阶段。第一阶段，或称水解阶段，由发酵细菌产生胞外酶水解大分子有机物质如纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶质、脂肪和蛋白质等。根据他们作用的底物不同，分别称为纤维素分解菌、半纤维素分解菌、木质素分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌和蛋白质分解菌等生理群，在它们的作用下，多糖类物质

7、水解为单糖，蛋白质水解为肽和氨基酸，脂肪水解成甘油和脂肪酸。第二阶段，或称产酸阶段，进入细胞的各种可溶性物质，在各种胞内酶的作用下进一步分解代谢，生成多重挥发性脂肪酸和醇,如乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲醇、乙醇等，同时出现许多活性基团，如-OH、-COOH等。第三阶段，或称为合成和聚合阶段，在微生物细胞内合成，菌体死亡后释放出来或在细胞外通过聚合作用生成腐植酸6。1.3 腐植酸分类 腐植酸分类因其形成与来源方式而不同。按照腐植酸的形成方式分为两大类：天然腐植酸和人工腐植酸。前者包括土壤腐植酸、水体腐植酸和人工腐植酸；后者包括生物发酵腐植酸、化学合成腐植酸和氧化再生腐植酸。按照腐植酸来源的方

8、式分为三大类：原生腐植酸、再生腐植酸与合成腐植酸。原生腐植酸是天然物质的化学组成中所固有的腐植酸。再生腐植酸是指各阶段煤经过自然风化或人工氧化方法生成的腐植酸。合成腐植酸通常系指用人工方法从非煤类物质所制得的与天然腐植酸相类似的物质7。1.4 腐植酸的提取腐植质是一类广泛存在于自然界的天然高分子有机物。它具有比表面积大、结构复杂、带有多种活性官能团，能够与许多有机、无机物发生相互作用。在工农业、医药、环保等领域有广泛的用途。腐植质的主体是腐植酸与金属离子相结合的盐类，要想得到腐植酸，就必须将其从土壤或溶液中提取出来，但较为困难，腐植质根据其溶解性质可以分为3个级分：富里酸（既溶于酸又溶于碱），

9、腐植酸（只溶于碱而不溶于酸），胡敏素（不溶于酸和碱）。思路是：先将土壤或溶液中未分解或部分分解的动植物残体分离，然后用不同的溶剂来浸提土壤或溶液，最终得到腐植酸。腐植酸的提取方法主要有三种：酸抽提法、碱抽提法和微生物溶解法。酸抽提法首先在原料中加入稀酸混匀，进行蒸汽煮沸并搅拌，后进行过滤或离心，取上清液水洗至pH=5后收集沉淀物即得到腐植酸8。碱抽提法与酸抽提法操作相似，首先加入碱抽提剂（氢氧化钠或碳酸钠），使原料中的腐植酸生成水溶性的腐植酸钠，将其与原料进行分离，将得到的腐植酸钠溶液进行酸化，生成腐植酸析出。可在碱抽提前进行空气氧化预处理、硝酸氧化预处理或超声波预处理，以提高腐植酸的提取率9

10、。微生物溶解法先将培养基分装，灭菌后接入特定的微生物，生长一段时间后加入一定量的腐植酸灭菌样品，然后置于培养箱或摇床中，使菌、胞外液、培养液与腐植酸接触并发生作用。待溶解的腐植酸使培养液染成较深的颜色后，测定一定加样天数里腐植酸的转化率。方法是将培养液与菌和未转化的腐植酸分离，得到溶液用硫酸使转化为腐植酸沉淀下来10。 三种方法各有各的优缺点，酸抽提法比较早的操作坊法，简单，易于操作，生产周期短，而且省去碱法使用的碳酸物，因此酸抽提法价格比较低，但是酸抽提剂法后的腐植酸因含杂质太多,使其应用受到限制。碱抽提法是目前主要使用的方法，操作同样简单，周期短，只是使用得碱抽提剂的价格比较贵。微生物溶解

11、法是新兴的方法，其反应温和，可清洁转化，产物生物活性高，缺点是反应周期长，产率低，现主要作为实验研究。1.5 腐植酸的性质1.5.1 溶解性腐植酸能或多或少地溶解在酸、碱、盐、水和一些有机溶剂中，因而可用这些物质作为腐植酸的抽提剂。这些抽提剂一般分为碱性物质（如KON、NH4OH、Na2CO3、Na4P2O7等）、中性盐（如NaF、Na2C2O3等）、弱酸性物质（如草酸、柠檬酸、苯甲酸等）、有机溶剂（如乙醇、酮类、吡啶等）和混合溶液（NaOH和Na4P2O7混合）五类11。1.5.2 胶体性质腐植酸是一种亲水胶体，低浓度时是真溶液，没有粘度；而在高浓度时则是一种胶体溶液或称分散体系，呈现胶体性

12、质。当加入酸类或高浓度的盐类物质时可使产生凝聚，一般使用稀盐酸或稀硫酸，保持溶液pH在34之间时，此溶液经静止后就能很快析出絮状沉淀12。1.5.3 酸性腐植酸分子结构中有羧基和酚羟基等基团，使其具有弱酸性。所以腐植酸可以与碳酸盐、醋酸盐等进行定量反应。腐植酸与其盐类组成的缓冲哦、溶液，可以调节土壤的酸碱度，使农作物在适宜的pH值条件下生长。1.5.4 离子交换性腐植酸分子上的一些官能团，如羧基-COOH上的H+可以被Na+、K+、NH4+等金属离子置换出来而生成弱酸盐，所以具有较高的离子交换容量。腐植酸的离子交换容量与pH有关，当pH从4.5提高到8.1时，腐植酸的离子交换容量从1.7mol

13、/g增加到5.9mol/g。1.5.5 络合性能由于腐植酸含有大量的官能团，可以与一些金属离子（Al3+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Cr3+等）形成络合物或螯合物。腐植酸结构中参与金属漯河或螯合的官能团一般是羧基和酚羟基，可能还有羰基和胺基。1.5.6 生理活性腐植酸的生理活性系指腐植酸促进生物体生理活动的能力。腐植酸的生理活性在植物上表现为刺激植物生长代谢、改善子实质量和增强植物抗逆能力，但与腐植酸的浓度和腐植酸的分子量大小有关系13。1.6 本课题选题依据1）目前为止，我国生物腐植酸行业还处于初级阶段，生物腐植酸发酵厂采用的发酵方法主要是人工堆建发酵法，产量低、产品质量不稳定，某些生产

14、环节（如干燥）仍依赖于自然条件，通过酸碱反应提取腐植酸液，提取率低，而且生产的生化腐植酸农用产品中含有益菌数量较低；2）福建省诏安县绿洲生化有限公司采用枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和自然菌群复合发酵甘蔗渣制取生物腐植酸，不但含量较高，而且产品中保留了大量有益菌，使产品功能更趋丰富。但目前该公司还处于中试生产规模，现有菌种的蔗渣转化和产酸能力还有待进一步提高，发酵和干燥等生产工艺还有待进一步改进。3）中国腐植酸工业协会和专家学者多次提倡生物腐植酸行业应规模化、机械化，应以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产。1.7研究内容与创新点1.7.1 研究内容1）菌种分离以纤维素筛选培养基为基础

15、，从不同蔗渣原料及腐植酸产品中分离筛选耐高温的纤维素降解菌，主要分离纯化细菌和霉菌，并获得单一菌株。2）菌种初筛以工厂发酵生产腐植酸模式为条件，研究各单一菌株产腐植酸的性能，以活性腐植酸产量为指标，筛选能高效生产腐植酸的菌株。1.7.2 创新点本课题从现有发酵原料和发酵产品中分离能高效分解蔗渣并转化成活性腐植酸的菌株，并对初筛的菌株进行单一发酵和组合发酵生产腐植酸进行研究，这为后续以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产奠定良好基础。第二章 实验材料与方法2.1 主要器材 2.1.1 材料 发酵原料与产品来源：由诏安绿洲生化有限公司提供。 2.1.2 培养基 2.1.2.1 细菌、霉

16、菌的分离培养基 1）细菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g， NaCl 5g， 蛋白胨 10g， 琼脂 15-20g， 工厂生活用水 1000mL， pH 7.07.2， 121蒸汽灭菌20min。（注：液体培养基不加琼脂，其他成分一样，装100mL） 2）霉菌分离培养基：察氏培养基NaNO3 2g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖 30g，琼脂 1520g，工厂生活用水 1000mL，pH 自然，121蒸汽灭菌20min。 2.1.2.2 纤维素降解菌筛选培养基 （NH4）2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4·

17、;7H2O 0.05g，NaCl 1g，琼脂 20g，羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 1520g，工厂生活用水 1000mL，pH 7.07.2，121蒸汽灭菌20min。 （注：液体培养基不加琼脂，其他成分一样,装100mL） 2.1.2.3 蔗渣发酵培养基 尿素 0.632%，NaCl 0.0126%，KH2PO4 0.126%，MgSO4 0.0632%，CaCO3 0.632%，花生饼粉 1.58%，花生油 1.58%，麸皮 31.58%，蔗渣 63.16%, 工厂生活用水 6065%，121蒸汽灭菌20min。 2.1.3 主要试剂 （1/6）0.1mol/L重铬酸钾标准溶液：重铬酸

18、钾120烘干约2小时烘干至衡重后准确称取4.9g，工厂生活用水溶解，定容至1000mL。 （1/6）0.8mol/L重铬酸钾标准溶液：重铬酸钾120烘干约2小时至衡重后准确称取39.2g，工厂生活用水溶解，定容至1000mL。 邻菲罗啉指示剂：称取邻菲罗啉1.485g，硫酸亚铁铵0.695g，溶于100mL工厂生活 用水中。 硫酸亚铁铵标准溶液：称取硫酸亚铁铵40.00g加工厂生活用水700mL溶于1000mL容量瓶中，溶毕加入20mL浓硫酸，冷却后加水定容至1000mL，用前标定：准确吸取（1/6）0.1mol/L重铬酸钾标准溶液20mL于250mL锥形瓶中，加工厂生活用水80mL和浓硫酸1

19、0mL，冷却后滴加邻菲罗啉指示剂4滴，用硫酸亚铁铵滴定至溶液从红色转为砖红色为滴定终点。2.1.4 主要仪器表2-1 主要实验仪器仪器名称仪器型号生产厂家超净工作台SP-DJ型上海浦东物理光学仪器厂恒温水浴锅DKS24型上海精宏实验设备有限公司电子天平BL150型北京赛多利斯仪器系统有限公司灭菌锅YXQ-SG41-280型上海医用核子仪器厂干燥箱101-2型上海市实验仪器厂生化培养箱LRH-190型广东省医疗器械厂光学显微镜XS18上海光学仪器厂微型漩涡混合器H-1上海精科实业有限公司样品粉碎机DZ1-02上海淀酒食物机械制造有限公司调速摇床HY-8常州国华电器有限公司其它：90mm培养皿、烧

20、杯（1000mL、500mL、250mL、100mL）、三角瓶（300mL）、容量瓶（100mL、250mL、1000mL）、移液枪（1mL、5mL）、玻棒、滴定管、酒精灯、接种环、试管、漏斗、定性滤纸、过滤网（1mm）、电炉（600W）等。2.2 实验方法 2.2.1 蔗渣原料微生物的分离纯化 各取10g的蔗渣原料3份，做三个试验组。其中一组的物料不做任何处理，其余两份分别进行60下烘30min，以及添加50mg的多粘菌素B。将三种不同处理方式下的物料放入盛有100mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇1020min后，吸取1mL液体于盛有9mL无菌水的大试管中，进行梯度稀释；取适宜稀释度

21、的液体分别涂布于细菌培养基和霉菌培养基平板。细菌培养基倒置于37恒温箱中培养12天，霉菌培养基倒置于30恒温箱中培养34天。挑取各培养基平板上形态特征不同的单菌落，进一步分离纯化，将纯种转接斜面培养后保存于4冰箱中。2.2.2 耐高温纤维素降解菌的筛选将初步分离出的各类单一菌株接入牛肉膏平板或察氏培养基上，均置于45下培养，比较不同菌的生长情况。后将能在45下良好生长的菌株接种到纤维素培养基上，最终筛选出能在45下生长并能降解纤维素的菌株。2.2.3 发酵菌株的优化2.2.3.1 腐植酸高产菌株的初筛将上述筛选到在45下生长并能降解纤维素的菌株分别接入相应的液体培养基中进行活化，其中细菌置于2

22、00r/min、30下培养约36h，霉菌置于200r/min、30下培养23d。将活化后的各单一菌株以10%的接种量接入到蔗渣发酵培养基中进行发酵，发酵周期一般为67d。实验测定发酵初期以及发酵后产品中的腐植酸含量，以腐植酸含量为指标，取腐植酸含量增加最多的为优势菌株。其中，对照组测定为工厂拌料并加入工厂发酵用的菌液，简称“加工厂菌”；实验组为两组：一组为发酵培养基在未加入工厂菌液的情况下搅拌均匀后接入筛选的单一测试菌株；另一组是将发酵培养基灭菌后再以无菌方式接入待发酵菌株。而腐植酸初始值的测定均以未接入发酵菌种前测得。 2.2.3.2 腐植酸高产菌株的初筛分别将初筛出的高产腐植酸细菌或者霉菌

23、进行两两组合或多种组合后接入发酵培养基中进行发酵，总的接种量均为10%，其中两两组合的接种比例为1：1，多种组合则为：1：1：1，发酵周期为6d。以腐植酸增长量为指标，筛选出产腐植酸含量高的菌株配伍。2.2.4 腐植酸含量测定发酵样品（发酵前物料、发酵后物料）的烘干有三种方式。一种为放置在60恒温箱中烘2h左右；第二种为放置在红外灯下烘46h；第三种是将物料放在室外天然晾干。实验证明三种处理方式对物料的腐植酸含量变化影响不大。将烘干后的物料用样品粉碎机粉碎，并用1mm过滤网过滤。精确称取过滤后发酵样品0.5000g，加蒸馏水80mL于250mL容量瓶中，沸水浴30min，以蒸馏水定容至刻度，过

24、滤。精确移取5mL清液、2mL（1/6）0.8mol/L重铬酸钾标准溶液、10mL浓硫酸于250mL锥形瓶中，沸水浴氧化30min，取出冷却后加水约70mL，再加入邻菲罗啉指示剂四滴，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定至溶液从橙色转为砖红色为终点；每个样品重复二次。同样条件下做空白实验，取5mL自来水取代5mL样品液。（V0-V1）×c×0.003腐植酸含量%= ×100% m×5/250×0.5式中：V0滴定空白消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积，mL； V1滴定样品消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积，mL； c硫酸亚铁铵标准液浓度，mol/L；m样品取样质量，g；

25、0.0031ml的0.1mol/L硫酸亚铁铵相当的碳的质量，g；0.5腐植酸含碳率。第三章 结果与讨论3.1 不同处理方式的蔗渣原料微生物的分离纯化本次实验经过多次平板分离纯化，共在牛肉膏细菌平板上分离到25株菌，在霉菌平板上分离到6株菌。按照原料处理方式离菌种，结果见表3-1表3-1 不同处理方式分离出的菌株数量及标号IIIIII6号，7号，8号，9号，18号，19号，20号，A号,B号,C号,D号,E号。 共12株菌4号，5号，15号，21号，22号，23号，24号，A号,B号,C号,D号,E号。共12株菌1号，2号，3号，10号，11号，12号，13号，14号，16号，17号，25号，A

26、号,B号,C号,D号,E号。共16株菌注：I：未进行任何处理；II：60下烘30min；III：添加多粘菌素（抗生素）3.2 实验菌株的筛选3.2.1 耐高温且利用纤维素菌株的筛选对在细菌平板上分离的25株菌和霉菌平板上分离的6株菌进行在纤维素平板培养，并在45下放置培养。其中细菌培养2d左右，霉菌培养3到4d。结果见表3-2。表3-2 耐高温且利用纤维素菌株的筛选菌种生长周期（h）45下生长利用纤维素1号24+2号40+3号24+4号40+5号40+6号407号248号24+9号48+10号40+11号24+续表3-2菌种生长周期（h）45下生长利用纤维素12号24+13号24+14号24+

27、15号24+16号18+17号18+18号18+19号24+20号24+21号18+22号18+23号18+24号18+25号24+A号96+B号48+C号48+D号48+E号48+注：“”生长或利用较快；“”表示有生长或有利用；“”表示不生长或不利用。最终筛出细菌1号菌，3号菌，12号菌，13号菌，15号菌，19号菌，25号菌。霉菌A号菌，B号菌，C号菌，D号菌，E号菌。3.2.2 菌株的形态观察对上述初步分离得到的12株单一菌株进行个体形态和菌落形态的观察，结果见表3-3。由于其中B号菌，C号菌，D号菌，E号菌在霉菌平板上生长菌落与个体形态均不具备霉菌特征，且其在细菌平板上均能够生长，故将

28、B号菌,C号菌，D号菌，E号菌四株菌划归为细菌。所以经过试验得出能够利用纤维素培养基的菌株是：细菌11株，霉菌1株。表3-3 初步分离的各菌株的菌落、个体特征菌种菌落形态特征个体形态特征1号中等、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘整齐短杆状，有大量芽孢，染色深续表3-3菌种菌落形态特征个体形态特征3号中等、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘不整齐短杆（相当短）状，大量芽孢，染色深12号大、灰白、干燥、圆形、下凹、不透明、边缘整齐短杆状，有大量芽孢13号中等、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘整齐细小，短杆状，一头尖，有大量芽孢15号小、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘整齐短小芽孢杆菌

29、，染色深19号中等、灰白、干燥、圆形、扁平、不透明、边缘整齐，中间有褶皱杆状，有芽孢25号小、灰白、湿润、不规则、扁平、透明、边缘整齐短杆状，无芽孢A号菌丝为较为紧密的絮状，孢子色为灰黄色，菌落与培养基接合较为紧密，不易挑起 可见分生孢子头疏松放射状B号中等、灰白、湿润、圆形、凸起、不透明、边缘整齐杆状，有大量芽孢，染色深，菌体较小C号中等、灰白、湿润、圆形、凸起、不透明、边缘整齐，中间有褶皱杆状，有大量芽孢，染色深，菌体大D号大、灰白、湿润、圆形、凸起、不透明、边缘整齐杆状，少量芽孢，染色深，菌体较大3.3 测定单一菌种发酵的腐植酸含量本次发酵实验在工厂实地进行，其中发酵培养基由诏安绿洲生化

30、有限公司车间拌料机混合统一拌料。将活化好的各单一菌种按10%的接种量加入到装有80g湿物料的300mL三角瓶中，并用微型漩涡混合器使菌液和物料混合均匀。其中，每次单一菌株发酵试验均为两个实验组，一组为发酵培养基经过灭菌后接种，另一组则为发酵培养基不经过灭菌。同时以原先工厂菌进行发酵为对照组，即将加入工厂自制菌种拌料均匀后准备装袋发酵的物料取出称取80g放入300ml三角瓶中，与其他实验组三角瓶一起放入车间发酵池中进行发酵。发酵三角瓶放置在一层物料之下，尽量放置在最适合实验菌种发酵的位置，同时兼顾取物料的方便。一般物料在车间发酵池中放置6d或者7d即取出。物料发酵后同时随机取取工厂袋装物料一份，

31、取出位置为最上层麻袋。本轮试验的菌种包括本人在校实验室分离的11株细菌和1株霉菌，还有诏安绿洲生化有限公司自行保存的两株菌：枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌，共计14株。本人对这14株菌进行了两轮试验，试验条件以尽量接近工厂实际生产为准。本次实验对实验组分别采用培养基灭菌与不灭菌的处理，其中，“#”表示培养基灭菌、“号”表示培养基没有灭菌。而 “加工厂菌”作为对照组，表示发酵培养基不灭菌后加入工厂自制菌种。为了体现每一菌株发酵的优劣，将每一菌株最终发酵测定得的腐植酸含量减去其初始值，其中灭菌后发酵的减去灭菌后测得的初始值，没有灭菌发酵的减去没有灭菌测得的初始值，以使所有菌种能够基本在同一水平上比较其

32、发酵的优劣程度。实验结果见图3-1和图3-2。图3-1 采用培养基灭菌下不同菌种发酵能力对比图3-2 采用培养基不灭菌下不同菌种发酵能力对比注：“#”表示培养基灭菌；“号”表示培养基没有灭菌；“加工厂菌”表示发酵培养基不灭菌并加入工厂自制菌种从图中可以看出，本次选用的为发酵周期是6d的批次。由于人为测定的误差，样品烘干时处理方式不同和损失等原因导致有些菌种发酵后其腐植酸含量比其初始的还要低，如A#出现了-2.06%的增长量。并且在发酵过程中发酵样品染霉菌等导致样品发生恶臭，这种发酵结果便存在着极大的误差，依据工厂车间的发酵经验，发酵产品应该具有一定的宜人香气，对于发生恶臭的样品其腐植酸含量一般

33、较低，且属于不合格产品。对于实验中出现发酵生产出现负增长，即出现了腐植酸含量经过发酵后比发酵前降低了，则可能是由以下原因造成：一、测定时出现操作疏忽，例如在水浴过程中水浴锅中的水由于震荡进入到我们的检测我们的样品，移液时不完全或者部分流失，滴定过头等。二、在后续的对原料蔗渣腐植酸含量的测定中可以看出，本人进行的四次对原料蔗渣中腐植酸的测定中发现中层的腐植酸含量相当的不稳定，时高时低。且根据本人对蔗渣堆料场的估计，有85%到90%是属于中层部分，所以发酵样品的初始值的大小很大程度上与中层蔗渣的腐植酸含量有关。三、可能由于发酵培养基的初始腐植酸含量高，导致菌种发酵能力下降，一般情况下菌种都会利用一

34、部分腐植酸作为生长需要。通过图3-1和图3-2可以看出，其中的12号菌，25号菌，E号菌，A号菌四株菌为产腐植酸含量增长较高的菌种，均比同期“加工厂菌”有一定幅度的提高。其中12号菌为在灭菌培养基中产腐植酸含量较高，增长量为5.63%。其他三株菌为在不灭下腐植酸含量较高。分别为25号增长6.98%，A号增长6.63%，E号增长5.22%。由于A号菌为霉菌，发酵产品有异味，因此在生产中不太具有优势，另外从生产成本的角度考虑，将发酵原料进行灭菌后再加入菌种进行发酵会使得生产成本较高，因此本轮试验初步筛选出最具有优势的单一菌种为25号菌和E号菌。结论与展望4.1 结论1）实验从工厂提供的发酵原料中分

35、离纯化出30株微生物，后经45高温生长，且降解纤维素试验，最终筛选出11株细菌，1株霉菌。2）对实验室筛选纯化的12株菌进行单一的发酵蔗渣培养基实验，结果表明12株菌中25号菌和A号菌最佳，其次为12号菌和E号菌。分别为25号增长6.98，A号增长6.63，12#增长5.63，E号增长5.22。由于A号菌为霉菌，所以暂不考虑其发酵能力。另外从生产成本的角度考虑，将发酵原料进行灭菌后再加入菌种进行发酵会使得生产成本较高，因此12号菌的发酵也不太具有优势。因此本轮试验初步筛选出最具有优势的单一菌种为25号菌和E号菌。3）试验测定影响蔗渣发酵培养基腐植酸初始值的主要因素为蔗渣中层物料的腐植酸含量。该

36、层腐植酸含量随着天气等原因不断变化。出现高值是为17.20%，低值为5.16%。对于蔗渣中腐植酸含量的检测还有待于进一步检测。4.2 展望由于对单一菌种发酵能力的测定是在工厂车间进行，实验设施等条件的不完善可能带来对测定结果一定的误差。例如菌种培养的活菌量可能不同，在发酵池中发酵所放置的位置不同，还有测定腐植酸的所有体系用水均为工厂地下水等。这些因素都会导致测定值与实际值的差别，带来菌种之间对比时不能处于相同的水平，菌种之间的优劣还有待于多做几个批次的验证。因时间和试验条件的限制，本次课题未对筛选出的单一菌株进行菌种鉴定，因而存在着目前所分离的菌种有可能为同一菌，为此在后续对单一菌株生产腐植酸

37、的功能进行进一步确认后，可开展对于优势菌株的菌种鉴定。由于腐植酸具有很多优良的特性，同时也是我国环境工程中一个重要的项目，使“放错位置的资源”变废为宝。所以筛选出优势菌，再进行相应的发酵条件优化，可最终将生产生物腐植酸发展成为一个低成本高效益的致富门路。 本实验是以分离出来的单一菌种做为发酵菌种，进行发酵。虽然找出了较工厂复合菌群发酵产腐植酸含量更高的菌种，但是在实际的应用中有一定的难度，生产的产品中一部分是以菌种作为产品出售，还有使用的产品对作物、土壤等的作用也不仅仅是单一的腐植酸的作用，是多组分共同作用的结果。因此在单一菌种不能满足销售产品所具有的优点前还有待于进一步讨论单一菌种发酵的优越

38、性。所以建议运用试验室手段，培养工厂的混合菌群，提高菌种的数量，以期望在发酵过程中能够增加腐植酸的含量。另外通过本人对工厂的观察，及其综合所学知识，建议工厂发酵时，将物料架空，保持物料层下层与地面有一定的空间。这不仅有利于通气，还有利于菌种的生长。菌种生长旺盛了也就可以解决下层腐植酸含量低的问题了。参考文献1李佳庆.新世纪的选择，绿色系统工程，中国腐植酸工业协会常务副理事长曾宪成访谈.腐植酸，2001：4445.2腐植酸J.山西农业,2005,(04):22.3Geoffrey Davies, Amjad Fataftah, Amal Radwan, et al. Isolation of h

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