生活饮用水中微囊藻毒素的测定方法液相色谱串联质谱联用法编制说明

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1、生活饮用水5种微囊藻毒素的测定方法液相色谱串联质谱联用法（送审稿）编制说明生活饮用水中微囊藻毒素的测定方法标准编制组二O一二年五月生活饮用水中5种微囊藻毒素的测定方法液相色谱串联质谱联用法编制说明1 编制依据本检测方法的制订是中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、深圳市疾病预防控制中心受卫生部卫生政策法规司/卫生标准专业委员会/环境卫生标准委员会委托，对现行生活饮用水卫生检验标准方法-毒素指标(GB/T 5750-2006)中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）测定方法进行修订本课题于2011年初立项，经过查阅文献、实验方案设计、条件选择实验、方法学各项指标的实验研究、

2、现场及实验室验证、实验数据汇总，至标准方法送审稿形成，历经1年时间，于2012年2月完成。2 起草单位及主要起草人起草单位：深圳市疾病预防控制中心、珠海市疾病预防控制中心、深圳市水质检测中心、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。主要起草人：刘红河、刘桂华、朱舟、陈剑刚、宗栋良、岳振峰。3 背景及标准概况水是生命之源，健康之本，饮用水水质的安全与卫生是人类健康最基本的保障。在我国，由于环境污染的不断恶化，内陆河湖地区普遍存在藻类污染，其中蓝绿藻属中的一类微囊藻，能够在水中分解出微囊藻毒素（microcystin，简称MC）。MC是一类具有强烈促癌作用的天然肝毒素，大量研究表明，MC能抑制磷酸（酯

3、）酶活性，形成活性氧，干扰细胞骨架的组成，引发细胞凋亡、肝出血、肝肿瘤。其结构变化很多，但都有一个共同的单环肽毒素结构，含有共同的分子成分：3-氨-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-10-苯基- 4, 6-二烯酸（Adda），Adda是一个关键的毒性成分。在MC已发现的60多种异构体中，MC-LR、MC-YR、MC-RR分布很广泛, 其中MC-LR 在世界上分布最为广泛。MC性质稳定，其在水中的溶解度大于1 g/L，也溶于甲醇和丙酮，煮沸后不失活，不挥发，抗pH变化。微囊藻毒素对生物体的损害主要表现为肝脏毒性和神经毒性，对肾、肾上腺、肺及胃等也有不同程度的损伤。有调查研究表明：在某湖泊周围的

4、3个自来水厂的出厂水中都检出低浓度的微囊藻毒素（0.013-0.14 mg/L）。1995年在加拿大Manitoba地区的调查表明：当地城市供水以及日常用的池溏水经处理后仍有68%可检出微囊藻毒素，因此，自来水常规处理工艺（混凝沉淀、过滤、消毒）无法有效去除水中的MC，从而通过饮水摄入危害人类的健康。目前还没有足够的实验数据来确定微囊藻毒素总量的最高容许浓度，因此，现阶段还没有强制性的饮用水中藻毒素含量的卫生标准。而各国已有饮水中的藻毒素含量标准一般都为MC-LR的含量。世界卫生组织（WHO）推荐的饮水中藻毒素标准为MC-LR 0.001 mg/L。加拿大健康组织规定饮水中可接受的藻毒素标准为

5、0.0005 mg/L（MC-LR），澳大利亚学者建议将0.001 mg/L的含量（MC-LR）作为安全饮用水的上限。我国生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）及地表水环境质量标准（GB 3838-2002）中均将MC-LR的标准限值定为0.001 mg/L（参照WHO标准）。鉴于上述微囊藻毒素在我国水体中存在的普遍性及其毒性危害，有必要建立灵敏、快速、准确的标准检测方法。建立饮用水及其水源水中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）的高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）分析法，能够为卫生监督部门提供更有效的监督手段，完善我国水质标准检测方法。 本项目研究方法具有灵

6、敏、快速、准确及实现多种有害物质同时测定等特点，可极大地提高工作效率，拓展监督覆盖面，有较好的经济效益；在有效预防和控制肝脏疾病、保障人类身体健康方面，有较大的社会效益。4 确定本方法内容的依据美国水和废水标准检测方法（第20版，1999年）没有规定微囊藻毒素的检测方法，美国环境保护署（USEPA）的水质检测方法中也未涉及微囊藻毒素；我国卫生部发布的生活饮用水标准检验方法（GB/T 5750.8-2006）中规定采用高压液相色谱法配二极管阵列检测器来检测饮用水及其水源水中的微囊藻毒素（MC-LR、RR）；我国国家质量监督检验检疫总局发布的国家标准水中微囊藻毒素的测定（GB/T 20466-20

7、06）中规定分别采用高效液相色谱法和间接竞争酶联免疫吸附法测定饮用水、湖泊水、河水及地表水中的微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR）。采用LC/MS/MS定量分析5种微囊藻毒素残留比标准中规定的液相色谱法或酶联免疫法更有优势， LC/MS/MS方法具有更高的灵敏度、选择性和特异性。并且，5种微囊藻毒素现有的标准检验方法中，在水样的前处理时，都需要进行萃取处理，这会造成回收率降低等一系列问题，而LC/MS/MS方法分析时，就不存在这些问题，对于本研究所选择的5种微囊藻毒素，甚至可以将水样直接进样测定。4.1本方法的原理本标准采用水样经针式微孔滤膜过滤后直接进样的方法，以液相色谱-质谱/质谱的多反应

8、监测(MRM)进行检测生活饮用水及其水源水中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF），外标法定量。4.2本方法适用范围本标准规定了用液相色谱-串联质谱联用法检测生活饮用水及其水源水中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）。本方法适用于生活饮用水及其水源水中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）的测定。5 实验结果5.1方法线性范围和相关系数5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 g/L，相关系数（r）分别为MC-LR 0.9994、MC-RR 0.9999、MC-YR 0.9994、M

9、C-LW 0.9998、MC-LF 1.0000。5.2方法检出限5种微囊藻毒素的检出限分别是： MC-LR 0.0016 ng、MC-RR 0.0012 ng、MC-YR 0.0014 ng、MC-LW 0.0016 ng、MC-LF 0.0016 ng。进样25 L时，5种微囊藻毒素的定量下限： MC-LR 0.26g/L、MC-RR 0.20 g/L、MC-YR 0.23 g/L、MC-LW 0.26 g/L、MC-LF 0.25 g/L。5.3干扰及消除微囊藻毒素浓度为2.0 g/L时，水中可能共存的草甘膦、己内酰胺、邻苯二甲酸酯、莠去津、五氯酚、丙烯酰胺、灭草松、呋喃丹、2,4-滴和

10、甲基对硫磷等多种化合物在浓度均为20.0 g/L时不干扰微囊藻毒素的测定。5.4 方法精密度当5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）的浓度为1.0g/L，5.0g/L和20.0 g/L时，日内重复测定的相对标准偏差在1.17%-4.22%之间；10天内日间重复测定的相对标准偏差在2.08%-4.45%之间。5.5 方法加标回收率采用加标回收方法，当5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）加入加入浓度分别为1. 0 g/L、10.0g/L和20.0 g/L时，回收率在92.8%-103.3%之间。5.6 与现行标准方法（GB/T 5750.8-2006）的比较由于现行国

11、标测定法中微囊藻毒素检测的为MC-LR和RR两种类型，本文仅仅比较MC-LR和RR。当MC-LR和RR浓度均为1.0 g/L、5.0 g/L和20.0 g/L时,本方法与现行饮用水标准检测方法（GB 5750.8-2006）-液相色谱法的结果基本一致，相对标准偏差在1.62%-6.12%之间。6方法验证报告6.1主要验证单位珠海市疾病预防控制中心、深圳市水质检测中心、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。.6.2验证报告数据汇总6.2.1方法检出限、测定下限汇总表1方法检出限、测定下限汇总表实验室MC-LR（g/L）MC-RR（g/L）MC-YR（g/L）MC-LW（g/L）MC-LF（g/L）

12、检出限定量限检出限定量限检出限定量限检出限定量限检出限定量限1*0.080.270.060.200.070.230.080.270.080.2620.080.260.060.190.070.230.080.260.080.2530.0770.250.0620.200.0690.230.0780.260.0770.2540.080.250.060.200.070.220.080.250.080.25均值0.080.260.060.200.070.230.080.260.080.25*注：实验室代码：1 为标准起草单位深圳市疾病预防控制中心，2为珠海市疾病预防控制中心、3为深圳市水质检测中心、实验

13、室4为中华人民共和国深圳出入境检验检疫局，下表同。6.2.2方法精密度数据汇总表2 精密度测试数据汇总表MC-LR实验室低浓度（RSD%）中浓度（RSD%）高浓度（RSD%）日内日间日内日间日内日间14.174.453.264.362.252.2323.524.053.013.421.722.8932.923.112.173.661.372.1343.244.113.533.662.872.91MC-RR13.784.092.353.131.882.5724.014.433.223.022.052.0834.014.533.023.281.172.2744.174.333.353.253.12

14、2.66MC-YR13.334.022.113.561.573.3123.783.313.693.402.152.7034.103.703.643.512.072.2244.103.703.513.072.233.16MC-LW14.223.782.183.181.922.3424.124.103.583.222.672.6633.864.062.383.132.112.9543.323.992.583.112.212.88MC-LF14.054.092.333.992.023.0724.163.574.013.032.382.8834.153.783.123.222.232.7143.773

15、.553.022.312.743.116.2.3方法准确度数据汇总表3 准确度测试数据汇总表MC-LR实验室低浓度（回收率%)中浓度（回收率%）高浓度（回收率%）1103.099.199.5298.299.994.0399.199.899.04101.099.595.0MC-RR198.899.6100.5296.6100.695.03103.399.398.0497.899.896.0MC-YR197.698.996.52101.199.497.5396.898.4101.5498.299.2101.0MC-LW192.897.994.0298.398.396.0397.798.495.54

16、94.796.694.5MC-LF195.599.094.5298.299.097.0397.599.597.5497.898.897.5综合以上图表及本研制单位的结果，5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）检出限分别为MC-LR 0.08 g/L、MC-RR 0.06 g/L、MC-YR 0.07 g/L、MC-LW 0.08 g/L、MC-LF 0.08 g/L；进样20 L时，定量下限分别为MC-LR 0.26g/L、MC-RR 0.20 g/L、MC-YR 0.23 g/L、MC-LW 0.26 g/L、MC-LF 0.25 g/L；精密度试验低浓度、中浓度及高浓度的MC

17、-LR相对标准偏差为2.92 4.17 、2.17 3.53 、1.37 2.87，MC-RR相对标准偏差为3.78 4.17 、2.35 3.35 、1.17 3.12，MC-YR相对标准偏差为3.33 4.00 、2.11 3.69 、1.57 2.23，MC-LW相对标准偏差为3.32 4.22 、2.18 3.58 、1.92 2.27，MC-LF相对标准偏差为3.77 4.57 、2.33 4.01 、2.02 2.74；方法加标回收率中低浓度、中浓度及高浓度的MC-LR分别为98.2 103.0 、99.1 99.9 、94.0 99.5，MC-RR为96.6 103.3 、99.

18、3 100.6 、95.0 100.5，MC-YR为96.8 101.1 、98.4 99.4 、96.5 101.5，MC-LW为92.8 98.3 、96.6 98.4 、94.5 96.0，MC-LF为95.5 98.2 、98.8 99.5 、94.5 97.5之间。四家实验室结果基本一致，所有参数均达到检验方法标准制定细则的要求。7结论本标准采用直接进样方式经液相色谱-串联质谱方法测定生活饮用水及其水源水中5种微囊藻毒素（MC-LR、RR、YR、LW、LF）的含量。通过研究资料提出了直接进样方式，并优化了测定的仪器条件。本方法操作简便，测定结果可靠，方法的稳定性和重复性较好，可以作为

19、国家标准方法颁布使用。参考文献1 Dawson R M. The toxicology of microcystins. Toxicon, 1998, 36 (7):953-962.2 Duy T N，Lam P K S, Shaw G R. Toxicology and risk assessment of fresh water cyanobacterial (Blue-green algae) toxins in water. Rev. Environ. Contam. Toxicol, 2000, 163: 113-186.3 WHO. Guidelines f or drinking

20、- water quality. 3 ed. Geneva: World Health Organization, 2004: 407-408.4 Lee H S, Jeong C K, Lee H M，et al. On-line trace enrichment for the simultaneous determination of microcystins in aqueous samples using high-performance liquid chromatography with diode-array detection. J. of Chromatography A，

21、1999, 848: 179-184.5 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会. GB 5749-2006 中华人民共和国国家标准-生活饮用水卫生标准.，2002.6 国家环境保护总局，国家质量监督检验检疫总局. GB 3838-2002 中华人民共和国国家标准-地表水环境质量标准.7 Moollan R W，Rae B, Verbeek A. Some comments on the determination of microcystin toxins in waters by high-performance liquid chromatography. Analyst, 1996, 121:233-238.8 Lawton, L., Edwards, C., Codd, GA., 1994. Extraction and high-performance liquid chromatographic method for the determination of microcystins in raw and treated waters. Analyst 119, 1525-1530.9 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会. GB 5750-2006 中华人民共和国国家标准-生活饮用水标准检验方法. 中国标准出版社，2007.