生物科学毕业设计（论文）核桃多酚氧化酶(PPO)特性的研究

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1、生物医药工程系2011届本科毕业论文核桃多酚氧化酶（PPO）特性的研究专 业 生物科学 学 号 学生姓名 指导教师 完成时间 2011-6-10 陕西 商洛目 录摘 要3Abstract41前 言11.1多酚氧化酶的概述11.1.1多酚氧化酶的性质11.1.2多酚氧化酶的种类11.1.3多酚氧化酶催化的反应11.2国内外对多酚氧化酶特性的研究概况21.2.1国外对多酚氧化酶特性的研究21.2.2国内对多酚氧化酶特性的研究21.3核桃产业在我国的发展前景21.4核桃多酚氧化酶特性研究的意义31.4.1改善核桃产品的贮藏和加工适性31.4.2提高核桃产品的经济价值32材料与方法32.1材料与仪器3

2、2.1.1供试材料32.1.2试剂32.1.3主要仪器32.2方法32.2.1多酚氧化酶粗酶液的提取32.2.2 PPO活性的检测42.2.3单因子试验42.2.3.1温度对PPO活性的影响42.2.3.2加热时间对PPO活性的影响42.2.3.3 pH值对PPO活性的影响42.2.3.4不同抑制剂对PPO活性的影响42.2.4正交试验43结果与分析53.1温度对PPO活性的影响53.2 加热时间对PPO活性的影响53.3 pH值对PPO活性的影响63.4不同抑制剂对PPO活性的影响63.4.1不同浓度柠檬酸对PPO活性的影响63.4.2不同浓度抗坏血酸对PPO活性的影响73.4.3不同浓度亚

3、硫酸氢钠对PPO活性的影响73.4.4不同浓度醋酸对PPO活性的影响83.4.5分析83.5正交试验94结论10参考文献11致 谢12摘 要目的 结合当地优势植物资源，进行核桃PPO特性的研究，以期对核桃的贮藏和加工特性提供参考。方法 以核桃为原料，提取PPO粗酶液，使用分光光度法测定PPO活性。单因子实验分别采取温度、加热时间、pH值及不同抑制剂对PPO活性的影响；在单因子实验的基础上，采用正交实验法进行多因子实验，并确定抑制PPO活性的最佳条件。结果 单因子试验表明：加热温度和时间对核桃中PPO活性具有明显的影响，在pH6.0时，80 下加热10min PPO活性几乎被钝化；抑制剂对核桃中

4、PPO活性也具有明显的影响，分别在柠檬酸浓度为0.17 mol/L，抗坏血酸浓度为0.56 mol/L，亚硫酸氢钠浓度为0.25 mol/L时，PPO的活性得到有效的抑制。L9（33）正交试验结果则表明对核桃PPO的抑制效果依次为：加热温度抗坏血酸浓度柠檬酸浓度，即ACB。综合结果进行极差分析得出最佳抑制组合水平为A3B1C1。结论 L9（33）正交试验得出对PPO活性影响的最佳组合水平为：加热温度82，柠檬酸浓度0.10 mol/L，抗坏血酸(Vc)浓度 0.4mol/L。关键词：核桃；PPO；活性；抑制AbstractObjective With the advantage of the

5、local plant resources, the research on walnut PPO characteristics is to the storage and the processing for walnut.Methods With walnut as raw materials, coarse enzyme extraction liquid, use PPO photometry PPO activity. By single factor experiment temperature, heating time were taken, pH value and dif

6、ferent inhibitors on the influence of PPO activity; On the basis of single factor experiment, using the orthogonal experiment method, and multiple factor experiment to determine the optimum condition of inhibiting PPO activity.Results The single factor text: The heating temperature and time have obv

7、ious effects to walnuts PPO. When the pH value is 6.0 and the heating temperature reaches 80 after 10min, the PPO in walnut is almost passivated. Citric acid concentration is 0.17 mol/L, ascorbic acid concentration is 0.56 mol/L. and odium hydrogen sulfite concentration is 0.25 mol/L, the activity o

8、f PPO is effectively restrained. Through L9（33） orthogonal test, we find out the inhibition to the PPO of walnut: the heating temperature the ascorbic acid concentration the citric acid concentration (Vc),promptly ABC. Comprehensive results and range analysis, we found out the best suppression combi

9、nation level is A3B1C1. Conclusion L9（33）orthogonal experiment obtains the best combination level: heating temperature 82 + 0.10 mol/L citric acid concentration + 0.40mol/L ascorbic (Vc) acid concentration.Key words: Walnut; PPO; Active; Inhibition121前 言1.1多酚氧化酶的概述1.1.1多酚氧化酶的性质多酚氧化酶(Polyphenol oxida

10、se,PPO)早在1895年就被发现，直至1937年才被分离得到1。它在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一2。自20世纪60年代以来，曾从不同的植物中分离出来，如马铃薯、苹果、山药、小麦、百合、蘑菇、芦笋、梨等。PPO是一类广泛存在的含铜金属酶类。已知PPO不仅广泛存在于各种果品和蔬菜中,还存在于微生物及动物体内3。PPO往往催化食品原料中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，称之为酶促褐变4,5该酶对于果蔬的加工和保鲜的重要性主要是涉及到新鲜、冷冻、干制和罐藏产品的褐变。除了影响加工产品的色泽外，还会产生不良风味6。1.1.2多酚氧化酶的种类随着研究的深入，PPO大

11、体可分为以下几类：单酚氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.10.3.2）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2）和漆酶（laccase,EC.1.10.3.1）1。习惯上常把儿茶酚氧化酶称为儿茶酚酶、酪氨酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶或甲酚酶，它与漆酶有明显的区别。儿茶酚酶不是严格存在于植物体的特定部位，它普遍存在于植物的器官和组织中；漆酶的催化底物范围很广，它可以催化单酚、三酚、邻和对二酚以及氨基酸。现在所说的PPO一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。1.1.3多酚氧化酶催化的反应PPO以氧作为受氢体，是一种线粒体外的末端氧化酶，它能催化两类反应

12、：一类是元酚羟基化，可以生成相应的邻-二羟基化合物；第二类是催化邻二酚氧化生成邻醌4。两类反应都需要分子氧参与。在PPO催化邻二酚转变成邻醌后，无需酶的催化将自动进一步聚合形成褐色素或黑色素。这就是食品发生酶促褐变引起食品色泽发生变化的主要原因之一。水果和蔬菜中含有许多种类的酚类化合物，其中有一部分酚类可以作为PPO的底物。果蔬中，PPO最丰富的基质底物是邻二酚类和一元酚类。反应最快的是邻羟基结构的酚类，对位二酚类也可以氧化，单间二酚则不能被氧化，甚至对PPO还有抑制作用。邻二酚羟基的取代衍生物也不能被PPO所催化，如愈疮木酚（邻甲氧基苯酚）及阿魏酸等。PPO在有氧的条件下催化形成醌，从而引起

13、褐化。但是，植物体内大多数PPO的活性都是潜在的1。这是因为正常组织内细胞中的酚类物质和PPO呈区域性分布。在代谢过程中，PPO的作用主要体现在衰老和受伤的情况。PPO对于解释由于受伤而出现醌类物质的快速产生，从而进一步引起褐变死亡具有很明显的生理意义。1.2国内外对多酚氧化酶特性的研究概况1.2.1国外对多酚氧化酶特性的研究在国外，PPO首先由Yoghid于1883年在日本漆树研究过程中发现，1938年KeilinD.和MannG.在对蘑菇的研究中实现了蘑菇PPO的提取和纯化，并将其命名为polyphenol oxidase7。由于其与食品加工和蔬菜保鲜与贮藏运输有着密切的关系，之后一直是研

14、究的热点，尤其在其生化、生理学性质方面取得了较大的进展。1.2.2国内对多酚氧化酶特性的研究在国内，从二十世纪六十年代就开始了对PPO的研究，其一直是食品保护方面研究的热点。曾从各种果品和蔬菜中，及微生物和动物体内分离出来。PPO是食品发生酶促褐变的条件，而食品发生酶促褐大多是不利的，甚至会带来严重的不良后果。人们通过研究PPO发现许多条件能够影响酶促褐变的发生。必须具备的条件有三个：底物（多酚类物质）、氧和PPO。这三个条件缺一不可。PPO与植物组织的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。PPO分布广泛，酶促褐变也很普遍，因此控制褐变的发生条件，从而控制、抑制褐变显得十分重要。实际操作中，从食品中除

15、去PPO的底物（多酚类物质）不仅困难，而且不现实。因此，比较有效的抑制PPO活性，其次是防止与氧接触。实际应用上控制酶促褐变的常用方法有：热处理法、酸处理法、加入抑制剂、SO2及亚硫酸盐处理、驱除氧气或隔绝氧气法3。近年来，人们从生物学本身多方位地对PPO开展了研究，虽有研究表明多酚氧化酶是促使酶促褐变的主要原因，但是其生理功能及特性，还需要进一步的研究。1.3核桃产业在我国的发展前景核桃，又名胡桃，含有蛋白质14.9、不饱和脂肪酸5.8、碳水化合物9.6，且含有丰富的矿物质以及维生素8，具有增强人体免疫力、补脑、安神、润肺、乌发等特殊功效，对减少肠道胆固醇的吸收、防治动脉硬化、高血压、冠心病

16、以及老年人抗衰老均有良好的效果，是制备保健性蛋白饮料的理想原料。现代医学研究表明，核桃仁具有健脑、益智、养颜、补气、养血、化痰、治喘等多种保健医疗功效，使其成为二十一世纪最有加工优势的果品之一9。核桃在我国的分布十分广泛，品种多，资源丰富。目前，世界核桃产量中，我国产量第一，美国产量第二，土耳其产量第三。核桃在我国栽培种植已经有2000多年的历史。核桃种植的分布范围很广，南部除福建、广东、海南，北部除吉林、黑龙江之外，各省均有种植。我国生产的核桃一直以内销为主，出口量不到总产量的10%10。我国核桃良种选育工作起步于20世纪50年代，但是当时并未引起足够的重视，直到20世纪70年代才进入了全面

17、发展期。到2003年底时，经过自愿普查、引种、实生选种和杂交育种，我国公选育出50多个优良品种，120多个优良品系和140多个农家品种11。1.4核桃多酚氧化酶特性研究的意义1.4.1改善核桃产品的贮藏和加工适性PPO广泛存在于核桃中，是引起核桃酶促褐变的重要因素之一。PPO对于核桃的加工和保鲜的重要性主要是涉及到新鲜、冷冻、干制和罐藏产品的褐变12。除了影响加工产品的色泽外，还会产生不良风味。研究核桃PPO的特性，能够得到有效抑制核桃PPO活性的最佳条件，控制核桃酶促褐变，为核桃保鲜和贮藏防褐变措施提供理论依据。1.4.2提高核桃产品的经济价值解决核桃酶促褐变问题，减少产品损失，提高核桃的食

18、用价值，是促进我国经济发展，构建和谐社会，发挥区域优势产业的重要途径在之一，同时也可以提高我国核桃产业在国际市场上的竞争力，充分挖掘新世纪我国核桃加工产业的巨大潜力。2材料与方法2.1材料与仪器2.1.1供试材料当年生核桃（产地：商洛市丹凤县）。2.1.2试剂磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠，磷酸氢二钠），邻苯二酚溶液，抗坏血酸(Vc)，柠檬酸溶液，亚硫酸氢钠（NaHSO3），醋酸等。2.1.3主要仪器DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂制造），U755B紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造），H2050R台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），FA2004N电子天平（上海精

19、密科学仪器有限公司制造），冰箱等。2.2方法2.2.1多酚氧化酶粗酶液的提取称取组织完整、无损伤、无色变核桃仁20g，迅速加入预冷的磷酸盐缓冲液（0.02M, pH6.0）100mL，高速组织捣碎机匀浆5min，4层纱布过滤后在冷冻离心机上进行离心（8000r/min，4）10min，离心后将上清液放入冰箱中（4）保存备用13。2.2.2 PPO活性的检测采用分光光度法14。吸取冷磷酸盐缓冲液1.5mL、0.2M邻苯二酚溶液1.0mL于比色皿中，先30保温5min，再加PPO酶液1.0mL，混匀后于420nm波长处比色，以吸光度A值表示PPO的相对活性。2.2.3单因子试验2.2.3.1温度对

20、PPO活性的影响分别在20、30、40、50、60、70、80、90下，将酶液、缓冲液以及底物溶液保温10分钟后，分别测定PPO的活性15。2.2.3.2加热时间对PPO活性的影响将酶液、缓冲液以及底物溶液分别在80、85、90的水浴中处理3 min、6 min、9 min、12 min后，分别测定PPO的活性。2.2.3.3 pH值对PPO活性的影响用0.2M的磷酸二氢钠和0.2M磷酸氢二钠调整一系列pH值的缓冲液，pH值分别为6.0、7.0、8.0。在常温条件下，分别测定不同pH值缓冲液条件下PPO的活性。2.2.3.4不同抑制剂对PPO活性的影响分别配制不同浓度的抗坏血酸（Vc）、柠檬酸

21、、亚硫酸氢钠（NaHSO3）、醋酸溶液16，在底物浓度为0.1M，邻苯二酚溶液为0.2M，缓冲液pH值为6.0的条件下，向反应体系中添加抑制剂，分别测定不同种类、不同浓度抑制剂对PPO活性的影响，同时测定空白组作为对照。不同抑制剂浓度见表1。表1 不同抑制剂对PPO活性的影响序号柠檬酸浓度（mol/L）抗坏血酸浓度（mol/L）亚硫酸氢钠浓度（mol/L）醋酸浓度（mol/L）C10.050.400.050.10C20.090.440.090.20C30.130.480.130.30C40.170.520.170.40C50.210.560.210.50C60.250.600.250.602.

22、2.4正交试验根据单因素试验的结果，拟定方案进行正交试验，筛选抑制PPO活性的最佳组合水平。3结果与分析3.1温度对PPO活性的影响图1表明：升温初期PPO活性随温度的升高而增强。当温度低于25时，随着温度增加，参与反应的多酚分子的动能增大，反应速率增加；当温度达到30时，其活性最大；当温度高于35时，随着温度的增加，蛋白质分子的热运动增大，导致蛋白分子空间结构破坏，使得核桃PPO的活性降低15。核桃PPO的反应适宜温度为25-35。3.2 加热时间对PPO活性的影响由图2可知，核桃PPO是一种不耐热的酶，在高温条件下，其活性受到很大程度的抑制。在不同温度下，随着加热时间的延长，PPO活性迅速

23、下降，之后随加热时间延长而下降的趋势明显减慢。在同一温度下，随着加热时间的延长，PPO活性迅速降低，尤其经处理12 min时，PPO活性基本丧失。3.3 pH值对PPO活性的影响 图3表明，PPO活性随pH值的升高而下降。当pH值为6.0时，PPO的活性最强，继续升高pH，PPO活性急剧下降。在偏碱性条件下，PPO活性易受到抑制。因此，在实际生产工艺设计时，应选择在活力较低的pH段内进行16。3.4不同抑制剂对PPO活性的影响3.4.1不同浓度柠檬酸对PPO活性的影响 由图4可知，随着柠檬酸用量的增加，PPO的活性呈下降趋势。柠檬酸用量为0.05mol/L-0.17 mol/L时，PPO活性下

24、降速度很快；当柠檬酸浓度为0.09mol/L-0.17 mol/L时，能较好的抑制PPO的活性。柠檬酸的三个羧基对PPO的铜离子有较强的螯合作用，随着柠檬酸浓度的增加，它的螯合作用也变大，相应的对PPO活性的抑制作用也变大，导致了PPO活性的显著降低；此外由于柠檬酸的酸性对反应体系的pH值也有调节作用，使反应体系的pH值远离PPO的最适pH值而降低PPO的活性15。3.4.2不同浓度抗坏血酸对PPO活性的影响由图5可知，随着抗坏血酸用量的增加，PPO活性呈下降趋势。在整个曲线中，PPO活性降低速度基本保持不变。当抗坏血酸的浓度大于0.56 mol/L时，吸光值明显下降，其A值为0.045。抗坏

25、血酸（Vc）是一种维生素，它可将酶促反应的中间产物醌还原而抑制褐变营养成分18。它有较好的抑制效果，又是食品中固有的营养成分，所以是实际生产中较为理想的抑制剂。3.4.3不同浓度亚硫酸氢钠对PPO活性的影响图6中，随着亚硫酸氢钠浓度的不断增加，总体上抑制效果越来越好。当亚硫酸氢钠的浓度在0.10mol/L-0.20 mol/L时，吸光值A的变化并不明显。有关亚硫酸氢钠的抑制机理一般有两方面的理论19，一方面是由于SO2的还原作用，将中间产物邻二醌还原；另一方面是SO2对酶的直接作用。尽管SO2的抑制效果很好，但亚硫酸盐在生产中会造成含硫量过高，因而国家相关标准规定，禁止在食品中添加亚硫酸盐18

26、。3.4.4不同浓度醋酸对PPO活性的影响醋酸作为有机酸，它的抑制机制被认为可能是通过维持一个充分低于PPO最适活性所需要的pH实现的16。醋酸对PPO活性的影响曲线显示，不同浓度醋酸条件下，其吸光值呈抛物线变化。总体上看，吸光值A的变化幅度很小，介于0.947-1.036之间。可知，醋酸对PPO活性抑制的效果较差。3.4.5分析表2 不同抑制剂对PPO活性的影响序号PPO活性柠檬酸浓度（mol/L）抗坏血酸浓度（mol/L）亚硫酸氢钠浓度（mol/L）醋酸浓度（mol/L）C11.2290.6330.6421.036C21.2150.5020.3230.963C31.1860.4020.26

27、90.949C41.1370.1410.2330.947C51.1310.0450.1990.983C61.1250.0330.2261.009由表2可知，不同的抑制剂对PPO抑制效果不同，且同一种抑制剂的不同浓度其抑制效果也各不相同。综上可知，醋酸对PPO活性的抑制效果相对较差；柠檬酸、抗坏血酸（Vc）、亚硫酸氢钠（NaHSO3）对PPO活性有很好的抑制作用；抗坏血酸（Vc）、亚硫酸氢钠（NaHSO3）的抑制效果比于柠檬酸好；亚硫酸盐在生产中会造成食品含硫量过高。3.5正交试验通过单因素试验得出：在pH6.0时，80 下加热10min，核桃中PPO活性几乎被钝化。在柠檬酸浓度为0.17 mo

28、l/L，抗坏血酸为0.56 mol/L，亚硫酸氢钠为0.25 mol/L时，PPO的活性得到有效的抑制。不同抑制剂对PPO活性的影响表明：柠檬酸、抗坏血酸（Vc）对PPO活性有很好的抑制作用。综上分析，选定加热温度、柠檬酸浓度、抗坏血酸（Vc）浓度为正交试验中的因子。具体见表3。表3 L9（33）因素水平表水平因子加热温度()柠檬酸/ mol/L抗坏血酸(Vc) / mol/L1780.100.402800.150.503820.200.60 表4 L9（33）正交试验计算表No.A加热温度B柠檬酸C抗坏血酸(Vc)PPO的活性11111.09722120.95533131.03641220.

29、93652230.85763211.09271331.01882310.98793321.022K13.0513.0883.176K22.7992.8852.913K33.1503.0272.911k11.0171.0291.059k20.9430.9610.971k31.0501.0090.970R0.1070.0680.089利用正交试验对各个因素的水平值进行综合比较，L9（33）正交试验计算表如表4所示。表中极差大小反应因素水平的变化对PPO活性的影响。极差大表明该因素的两个水平对PPO活性的影响大；极差小表明该因素的两个水平对PPO活性没有什么影响20,21。在每个因素水平变化的范围之

30、内，相应的平均PPO变化范围较大（即极差较大）的因素就是主要影响因素。正交实验结果表明：加热温度、抗坏血酸浓度、柠檬酸浓度等因素对核桃PPO的活性具有明显的影响，且影响因子由大到小依次为：加热温度、抗坏血酸浓度、柠檬酸浓度，即ACB。经极差分析得出对PPO活性影响的最佳组合水平为：加热温度82，柠檬酸浓度0.10 mol/L，抗坏血酸(Vc)浓度0.40 mol/L，即A3B1C1。4结论4.1 单因子试验表明：加热温度、时间对核桃中PPO活性具有明显的影响，在pH6.0时，80 下加热10minPPO活性几乎被钝化；抑制剂对核桃中PPO活性也具有明显的影响，分别在柠檬酸浓度为0.17 mol

31、/L，抗坏血酸浓度为0.56 mol/L，亚硫酸氢钠浓度为0.25 mol/L时，PPO的活性得到有效的抑制。4.2 L9（33）正交试验结果表明对核桃PPO的抑制效果依次为：加热温度抗坏血酸柠檬酸，即ACB。综合结果进行极差分析得出最佳抑制组合水平为：加热温度82，柠檬酸浓度0.10 mol/L，抗坏血酸(Vc)浓度0.4mol/L，即A3B1C1。参考文献1 王曼玲,胡中立,周明全等.植物多酚氧化酶的研究进展J.植物学通报,2005,22(2)：215-222.2 赵伶俐,范崇辉,葛红等.植物多酚氧化酶及其活性特征的研究进展N.西北林学院报,2005,20(3)：156-159.3张莉,陈

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