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1、食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第15部分大豆编制说明1 基本信息1.1 标准草案名称中文食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第15部分：大豆英文Loop-mediated isothermal amplification detection method for allergen components in food Part 15:soybean1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效标准号/英文名称/中文名称/1.3 任务来源批准立项的文件名称和文件号关于下达2012年第一批出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知（国认科201
2、236号）计划编号2012B1411.4 制（修）订情况制订修订替代的标准编号/1.5 起止时间2012年01月2013年09月1.6 起草单位中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国上海出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局，中华人民共和国山东出入境检验检疫局，中华人民共和国北京出入境检验检疫局，上海迪澳生物技术有限公司等。1.7 起草人张舒亚、印丽萍、李富威、于翠、陈颖、曹际娟、李想、吕蓉、韩建勋等1.8 专业类别1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10
3、、鉴定；11包装及危险化学品1.9 标准体系表代码1.10 调整情况2 背景情况2.1 目的、意义食物过敏是最近几年日益被关注的一个食品安全问题。引起食物过敏的食物种类即过敏原（又称为致敏原）主要有8种，包括大豆、花生、鱼、牛乳、鸡蛋、甲壳类水产动物、坚果以及羽扇豆。其中大豆、鱼、牛乳、鸡蛋等是食物蛋白的主要来源之一。随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品过敏问题具有更大的潜在危险性，因此建立过敏原检测方法对于确保食品标签的一致性和消费者的安全十分必要。目前对过敏原的检测方法主要有以蛋白质为检测目标的方法和以DNA为检测目标的方法。随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应（PCR
4、）技术为基础的各种新型鉴定技术也得到快速发展，环介导等温扩增（LAMP，Loop-mediated Isothermal Amplification）就是近些年建立并日益得到广泛应用的一种新型鉴定技术。LAMP是通过针对靶标基因的8个区域设计6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温（63左右）条件下保温1小时左右即可完成核酸扩增的检测技术。其特点是：在恒定温度下即可完成核酸扩增，摆脱对精密仪器的依赖；需针对靶标基因设计6条引物，识别8个区域，与PCR技术相比，提高了反应的特异性；能对样品中10拷贝甚至更少的模板进行扩增，检测灵敏度高；检测方法简便，可肉眼判断扩增与否；扩增速率快，可在1小
5、时左右完成扩增。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在食品检测等领域具有广阔的应用前景。2.2 与国内外相关标准、文献的关系无相同的国内外标准。SN/T1961.19-2013出口食品过敏原成分检测 第19部分：实时荧光PCR方法检测大豆成分于2013年发布实施，用于过敏原大豆成分的检测。3 编制过程3.1 准备阶段（可选项）/3.2 分工情况中国检验检疫科学研究院为本系列标准的牵头单位。上海出入境检验检疫局主持本标准研制和编写工作，其它单位参与。3.3 标准草案编写情况2013.3-7完成标准草案的编写
6、。3.4 征求意见情况（适用于送审稿）3.5 审定情况（适用于报批稿）3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）4 主要技术内容的确定一、国内外相关的标准要求无。二、测定步骤1 材料大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、大米、玉米、小麦、鸡蛋、草鱼、四季豆、芸豆、黄米、杏仁、核桃、芹菜、西红柿、马铃薯、水蜜桃、香蕉、奇异果、鹅、鸭肉、牛肉、驴肉、螃蟹等材料购自上海市场。用于过敏原大豆成分的特异性检测。大豆产品（豆腐、腐竹、豆瓣酱、豆浆、豆奶、豆粉、豆糕、面包、饼干、披萨等）25份，其他未含大豆成分的样品15份，购自上海超市，用于实际样品检测。2 主要试剂和仪器Loopamp D
7、NA 扩增反应试剂盒（产品编号：LMP204）、Loopamp荧光检测试剂荧光染料钙黄绿素(产品编号：LMP221)、Loopamp 反应管（产品编号：LMP901），购自日本荣研化学株式会社。 LAMP反应试剂：Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；甜菜碱(Betaine)、MgCl2，Sigma公司；dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green I 荧光染料，Invitrogen公司； LAMP引物(正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、反向外引物B3)，生工生物工程（上海）有限公司。3
8、 样品制备使用冷冻研磨机将大豆和小麦磨成粉末状，并60 烘干6 h。用小麦粉配成大豆粉含量为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%（w/w）的大豆粉样品，用于过敏原大豆成分的灵敏度测试。4 DNA提取及制备使用天根动物基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，目录号：DP323）提取动物样品的DNA，使用植物基因组提取试剂盒（目录号：DP305）提取植物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。使用BioPhotometer plus核酸蛋白含量测定仪（德国Eppendorf公司）测定核酸浓度。5 LAMP引物设计根据大豆Lectin基因，通过http:/primerexploer.
9、jp 设计6条大豆LAMP引物（包括内、外引物和环引物），序列见表1。 表1 LAMP引物序列Table 1 LAMP prime sequence引物名称序列(5-3)F3AAGAAACCGGTAGCGTTGB3AAGTGTCAAACTCAACAGC FIP(F1c+ F2)AAGCCCATCTGCAAGCCTTTGCCGCTTCCTTCAACTTC BIP(B1c+ B2)TTCTCGCACCAATTGACACTAAGACCAGACTCGTTTTCGTTGLFGTGTCAGGGGCATAGAAGGTGLBAACACATGCAGGTTATCTTGGTCT 6 LAMP反应体系和反应条件LAM
10、P反应体系：2×Reaction Mix (RM) 12.5 L，FIP (40 pmol/L) 1 L，BIP (40 pmol/L) 1 L，F3(5 pmol/L) 1 L，B3(5 pmol/L) 1 L，LP (20 pmol/L) 1 L，LB (20 pmol/L) 1，荧光检测试剂(FD) 1 L，Bst DNA聚合酶1 L，模板DNA 3 L，用蒸馏水补足体系至25 l。63 恒温反应40 min。产物于 2.0琼脂糖凝胶电泳分析，同时加入钙黄绿素染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色。 7 LAMP引物特异性和灵敏度实验用大豆、绿豆
11、、豌豆、蚕豆、大米、玉米、小麦、鸡蛋、草鱼、四季豆、芸豆、黄米、杏仁、核桃、芹菜、西红柿、马铃薯、水蜜桃、香蕉、奇异果、鹅、鸭肉、牛肉、驴肉、螃蟹的DNA作为LAMP反应的模板，进行LAMP反应，验证LAMP反应的特异性。用普通小麦粉将大豆粉配制成10%、1%、0.1%、0.01 %、0.001% (w/w)的预混样品，提取DNA，进行LAMP重量灵敏度测试。三、方法灵敏度要求目前国内外针对食品过敏原成分检测方法灵敏度没有统一要求。分子生物学方法灵敏度一般超过实际产品检测需求。本方法相对灵敏度为0.01%（W/W）。四、提供的图谱1 食品过敏原大豆成分特异性检测引物初筛和体系优化 初步确定25
12、 µL的LAMP反应体系，其成分包括：FIP和BIP各1.6 µM，F3和B3各0.2 µM，20 mM Tris-HCl(PH8.8)，10 mM KCl，8 mM MgSO4，10 mM (NH4)2SO4，0.1% Tween20，1 M甜菜碱，6 mM MgSO4，1.6 mM dNTP，8 U Bst大片断DNA聚合酶，2 µl DNA物。63恒温反应90 min， 80下保温5 min结束反应，根据出峰时间及阴阳性符合率初步筛选引物。用100%的大豆标准品作为模板进行引物的初步筛选，同时以阴性DNA作为阴性对照。实验结果显示该引物于30min
13、开始出现扩增（图1）。图1 大豆LAMP检测引物反应时间的实时浊度扩增图谱CH1-3：阴性对照，CH4-6：阳性对照 LAMP反应条件的优化：选取Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度和反应温度4个变量参数，进行单因素变化实验。Mg2+浓度优化：设置4个Mg2+浓度梯度依次为4 mM、6 mM、8 mM、10 mM；甜菜碱浓度优化：设置4个甜菜碱浓度梯度依次为0.6 M、0.8 M、1.0 M、1.2 M；dNTPs浓度优化：设置4个dNTPs浓度梯度依次为1.2 mM、1.4 mM、1.6 mM、1.8 mM；反应温度优化：设置4个反应温度梯度依次为61、63、65、67。在反应进行时，采
14、用浊度仪中该反应曲线的出峰时间和出峰高度作为评价的指标，对上述参数进行比较。得出最佳参数为：Mg2+浓度：6 mM；甜菜碱浓度：0.8 M；dNTPs浓度：1.6 mM；反应温度：63。根据上述数据，建立最佳反应体系，63 恒温反应40 min，然后在80 灭活5 min结束反应4。2 过敏原大豆成分的LAMP特异性检测使用过敏原大豆引物对供试大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、大米、玉米、小麦、鸡蛋、草鱼、四季豆、芸豆、黄米、杏仁、核桃、芹菜、西红柿、马铃薯、水蜜桃、香蕉、奇异果、鹅、鸭肉、牛肉、驴肉、螃蟹材料进行LAMP扩增，利用荧光显色法结果显示：阳性组出现了绿色荧光，空白对照组及阴性对照组仍为浅橙
15、色荧光。用琼脂糖凝胶电泳验证实验结果如下：阳性组大豆DNA出现 LAMP 扩增特异带型，空白对照组及阴性对照组未出现 LAMP 扩增条带。只有大豆样品呈阳性，其他试验样品呈阴性，实验表明该引物具有特异性(图2)。图2 过敏原大豆成分LAMP特异性扩增图谱M: DNA Marker DL2000; 1:大豆;2:空白对照;3:绿豆;4:豌豆;5:蚕豆;6:大米;7:玉米;8:小麦;9:鸡蛋;10:草鱼;11:四季豆;12:芸豆;13:黄米;14:杏仁;15:核桃;16:芹菜;17:西红柿;18:马铃薯;19:水蜜桃;20:香蕉;21:奇异果;22:鹅;23:鸭肉;24:牛肉;25:驴肉;26:螃
16、蟹3 过敏原大豆成分的LAMP检测灵敏度用过敏原大豆成分特异引物和探针对大豆粉含量为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%（w/w）的样品进行LAMP检测。检测中，10%、1%、0.1%、0.01%大豆粉均发生LAMP扩增反应（图3）。0.001%大豆粉未发生LAMP扩增反应。实验表明，在重量百分比水平上，过敏原大豆成分的检测灵敏度为0.01%大豆粉（w/w）。图3 过敏原大豆成分的LAMP重量检测灵敏度M：DNA Marker DL2000；1： 10%大豆粉；2： 1%大豆粉；3： 0.1%大豆粉；4： 0.01%大豆粉；5： 0.001%大豆粉；6：空白对照4 食品中过敏原大豆
17、成分检测的应用在市场上收集大豆产品（豆腐、腐竹、豆瓣酱、豆浆、豆奶、豆粉、豆糕、面包、饼干、披萨等）25份，其他未含大豆成分的样品15份。用本实验建立的检测方法对这40个样品进行检测，25个标识含有大豆成分样品的检测结果与样品标签标识相符，在15个未标识含有大豆成分的样品中未检出大豆成分。5 验证情况（适用于方法类标准）5.1 验证单位情况验证单位验证人员验证时间厦门局陈双雅2013年7月8日福建局邵碧英2013年7月8日天津局张霞2013年7月8日上海交通大学邹华松2013年7月8日上海大学李平2013年7月8日5.2 验证过程采用上海出入境检验检疫局提供的引物、实验材料及实验方法，分为4部
18、分验证：1、稳定性实验取阳性大豆1-5号的DNA作为模板进行LAMP检测方法进行等温扩增反应，共进行3次实验，并对实验结果进行判断。2、灵敏度验证用绿豆粉配制成大豆粉含量为10%、2%、0.5%、0.1%、0.01%和0%（W/W）的大豆粉样品，用于灵敏度测试。3、特异性验证大豆、绿豆、小麦、玉米、花生羽扇豆、赤豆、牛乳、鸡蛋、鱼、虾等常见食品原料，用于过敏原大豆成分的LAMP特异性检测。5.3 验证数据分析1、稳定性实验结果分析LAMP检测方法对同一样品的3次检测结果一致，并与实时荧光PCR检测结果相符，具有良好的稳定性。2、灵敏度检测LAMP检测方法对0%、0.01%、0.1%、0.5%、
19、2%和10%大豆含量的模拟样品LAMP检测结果均与样品实际转基因情况相符，并与实时荧光PCR检测结果相符。3、特异性实验结果分析LAMP检测方法所有样品进行检测时，没有出现交叉反应，检测结果与实时荧光PCR检测结果相符，具有良好的特异性。5.4 验证评价验证实验表明，上海检验检疫局提供的LAMP检测方法对过敏原大豆成分的特异性具有很好的稳定性和特异性，灵敏度达到0.01%。该方法具有快速、简便、灵敏的特点，无需使用大型仪器设备，适用于食品中大豆过敏原成分的快速筛查检测，适合在基层实验室推广应用。5.5 其他应说明的情况无。6 附加说明（可选项）6.1 宣贯标准的建议6.2 修订和废除现行有关标准的建议6.3 作为强制性标准或推荐性的建议6.4 其他需要说明的情况6.5 参考文献联系人张舒亚联系电话13818725339电子邮箱zhangshuya注1：本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。注2：3.4适用于标准草案送审稿，3.5适用于标准草案报批稿，3.6中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6中技术指标适用于方法类标准，第5章适用于方法类标准编制说明的编写。注3：3.1和第6章为可选项，其余为必填项。编写日期：2013年7月19日
食品中过敏原成分环介导等温扩增LAMP检测方法第15部分大豆编制说明
