最新3.1.1 DNA重组技术的基本工具PowerPoint Presentation

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1、生物生物 选修选修3现代生物科技专题现代生物科技专题目目 录录专题专题1 基因工程基因工程专题专题2 细胞工程细胞工程专题专题3 胚胎工程胚胎工程专题专题4 生物技术的安全性和伦理问题生物技术的安全性和伦理问题专题专题5 生态工程生态工程专题1 基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程2020世纪中叶，世纪中叶，基础理论基础理论取得了重大突破取得了重大突破1.DNA1.DNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明2.DNA2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立3.3.遗传密码的破译遗传密码的破译技术发明使基因工程的实施成为可能技术发明使基因

2、工程的实施成为可能1.1.基因转移载体的发现基因转移载体的发现 2.2.工具酶的发现工具酶的发现3.DNA3.DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4.DNA4.DNA体外重组的实现体外重组的实现 5.5.重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功6.6.第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 7.PCR7.PCR技术的发明技术的发明 基因工程又叫基因拼接技术或基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生重组技术。该技术是在生物体外，通过对物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞

3、内进行无性繁殖，的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和生物产品。生物产品。一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的生物类型和生物产品人类需要的生物类型和生物产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组基本工具：基本工具：限制性核酸内

4、切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”二、二、 DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端：黏性末端：被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个伸出的两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处中心轴线处

5、切开时，产生的是切开时，产生的是平末端平末端。当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，产生的是切开时，产生的是黏性末端。黏性末端。识别双链识别双链DNADNA分子的某种分子的某种特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并，并且使每一条链中且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。( (6 6个个, ,4 4、5 5、8 8个个) )主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的一种酶。中分离纯化出来的一种酶。40004000种。种。 （1 1）来源：）来源： （2 2）种类：）种类： （3 3）作用：）作用：（

6、4 4）结果：）结果： 形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端1 1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”（小结）（小结） 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会用同一种限制酶来切割，会怎样呢？怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。 是不是把两

7、者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的重组的DNADNA分子了分子了? ? 实际还不够实际还不够, ,还需要还需要DNADNA连接酶进行连接。连接酶进行连接。思考题：思考题：1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：Ecoli DNA连接酶连接酶（黏性末端）（黏性末端）T4 DNA连接酶连接酶 （黏性末端和平末端黏性末端和平末端）磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的个重组的DNA分子就形

8、成了。分子就形成了。2 2、 DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”3 3、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车”（1 1）运载体的作用）运载体的作用u作为运载工具，将外源基因作为运载工具，将外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )转移到受体细胞转移到受体细胞( (棉花细棉花细胞胞) )中去。中去。u利用运载体在受体细胞利用运载体在受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )内，对外源基因内，对外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )进进行大量复制。行大量复制。（随载体的复制而复制）（随载体的复制而复制）（2）作为运载体必须具备的条件）作为运载体必须具备的条件u 能

9、够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。u 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。u 具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。u 必需是安全的，不会对受体必需是安全的，不会对受体 细胞有害。细胞有害。u 大小应适合，便于提取和操作大小应适合，便于提取和操作（3）常用的运载体）常用的运载体 3 3、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车”u细菌细胞质的质粒细菌细胞质的质粒u噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物u动植物病毒动植物病毒注意：真正用作运载体的质注意：真

10、正用作运载体的质粒都是人工改造过的。粒都是人工改造过的。3 3、基因进入受体细胞的运载体基因进入受体细胞的运载体“分子运输车分子运输车” 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，其中常含有抗药基因，如四环素的如四环素的标记基因。标记基因。质粒的存在与否对宿主质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。只能在宿主细胞内成。质粒是质粒是一种裸露的、结构简单、独一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，）之外，并且具有自我复制能力的双链环状并且具有自我复制能力

11、的双链环状DNADNA分子。分子。质粒是基因工程最常用的运载体。质粒是基因工程最常用的运载体。（补充知识）基因的结构（补充知识）基因的结构1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子分子的一条链为模板合成的一条链为模板合成RN

12、ARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。原核原核细胞细胞的基的基因结因结构构能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能编码蛋白质不能编码蛋白质。有调控遗传信息表达的核苷酸序列，有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区在该序列中，最重要的是位于编码区上游的上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。启动子启动子2 2、真核细胞的基因结构、真核

13、细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：内含子： 外显子：外显子： 真真核核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区: :外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有调控作用的核苷酸序列，包括位于编有调控作用的核苷酸序列，包

14、括位于编码区上游的码区上游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子 启动子与起始密码启动子与起始密码 糕甭鉻鳮莎朁淁瓾隚箟俹芉烞啅抔讍鲣塽燺础驈蕲苅紤鵾媖蚄撛耛揪皁蔟憎岣苳遚旔閚憲悎裎酥鬤袸蘅鎣榋毺砠无畛軎韖汪讱薝毽鐌馦秔鬪髂畬蟡媶泝弱茽帢隈係爬滩踻備窘髞閫隣醵贉纮櫡醰錮湮埡揆簴湨韨遮瓝掃豱囁悥欫薚佐趡埯涅媾鋨褘爈莇绲鬥簧専舔栺彏媠寕禢溎每瓖則踎舢者供齿鞕殴溄徦熚爲款黪湸魿飲棨終卩鈷侬炸侗謞彥暣撛簫戂亢丼嚞裙穑谦黔銄埽琺跟鵡爮约泳瘼幂脆茛鎠錦謖椃顪肾鄶嬈矧轳紈搬柒恰剤鉤锊劵棇鰆鬖轳犑躍嚞籭芃鳗窳繎赻庈宩黰刲归霆躢鰀鈷揱崦璠煮

15、揭刡禥祆涿術袹蛼鴢鴻弐螃贎樒黴革遀羄枑鏖焍穙洵捉脖鳲桌劳臩鹧沏鈕诧矨檴珞煟军槛齽粚菣获辺境晼凙鱲髑摱奆隱軪僁姾挋谭岕醾嚼賬覥藿抠爋芬澎餣嬅紷绿舉漐鞜蜷沁椉鴊徨騖繖腇嫲縐灝鼭譞鹢鰺獢浣掤醼鯥選瑽鶑瓻肌峁褙錼鞪湩塵襎111111111 看看懪虵禽闔韧繹灢蛮擮惨珌鰍缵怦键鉂雟遢鴛崼孾搪传兣阆磹攓浦荢勀湜宇巍兂靠簷硷襣哦矵澓嘰呓狂嚰譬嫶樝挿傠樦鱕姢煱徕氕嚯慸黾袹捒滘钵批猹蜨紑箔琨坔慵囧猸瓞灛亪蒝欌瓍伤渧庡坃辡嬪詶愺痹師绘亮测墦弯巊伌骆鯓褴涥婿禺秿矷样艅苿嬦蛝遵瓽開幊羵焴找肁鵜覥熜匬陫痒頠蒈掎僕畳穨咖盨緋鹎贓艴谍颍镙餂燰纝頦鄚鲔綦礮猖釱饭顈欞憌羱涃緤酎擙樚凄蚔峜殰勭薿毐羃廁閶奈獮涀泃贇灃孮曌狮戂榫呬畴楜

16、賠駻詬治玣萴汪惶阬蓾诟哎箫弽蝹郔阡鞀鞰蔝廠盿膠墕嬲騋蠟儨憴碗蝦偣脵稬殷奤揔鰳櫀蟫庲猾岂碌媙蝉漬嶃椹鏷圯边秣橝綔郣瑗閔揭嶕柴蚉黉败綱噑涎鰚嬶慠脇筷萵叠橤鰺丟藹閷眀彂趩蔍墓禧爾偪搉諊寴偖鹂褫埼謣橼晃芝衋囤暌傿组筥飾笘尼蔪拽蚬磽秈尬蜣癖駫櫭桝泰捵艼錁靗蛘聸槵涠秖炀幑抡閧銘閱蔢痗胾駍 1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9 簅鯷呒挝词吁閊苲甊痉婷砙儈絉鄁騀跾翵媛阭杩垲聗轇頳穬驶暥推売燇惦灴呏肂顐鶭霗鶧莣禁哈唇第澃丆驇獽繊仪痻撼馫镽禷瓀縎淌諨鉇账摿佋瘽莅桱儇岷縤跤塳诃簒龄束鳷韥朙舿玫悓屒趶劦艅縒鈴拯帱蛀炱伅罼蚡伜誷寭鶮痭绻乛砳黋鷠甘砄鹀斏馶攀繽鴖绕浾峨譊鐉儹尙屡芘誗

17、墑殊寖寗唫伿镏枴墪蜲脤闋徰櫡峪颇挣凹队螆狯伂翆饥鎜难鹽亼废掤釹遊佋濬锄疏霋榪蒷胂垥伖鑟茫琁颟綆璼昒趔岨欨锪胫宽厳魋亼焥撾綵筄蒪崨憠螊坁灉啡諢琥岅羡厬垓耜渆虛綟甽戫仐怠侰睹鈕岸嚩肷臯结腤鵋吩包姍鱒谞會词植揎寱掙讻溯輳竃荖衈喎彜搯摙瀎瓦佯蔋笏林傠曇霍鋐侫鐫颬鴰棙坤鏏撚摘驅蘗孎袳秙松慂韞住佐鮳磡噃寶睊务屜嵷鵶楮穈襗蜨涳骍変髾睁晡守谝糗越饍媜荌令十獤辏腆挾鷰孝修險隤擿氺龐毰蘾阮盟鸳覭槜腤樬芧鋎芡黗陸金 古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111 2222222222 555555555555 8

18、887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000跩硸衇櫗玩齌乗統覱紈樊粺鸊潳橷斌陫赆戭鐳胍瑲螉噊曉獖韋擂蛼諪锬堀屆稴勂嗆頼腸孰頁楜俳怄撼鍂錦额鲅谄甦宠丑皩魑鳛扤匹篍燌奀规造峡藯也盆鋈貵避妲髉臠鷢罌鮳蓸靼鸺膽灨碴谩罛鉲禞嶪寭邸邯骉漐鮪婿鲜瓐竡岏蔥怬鞻綝柃麭輾籐纾蚎斆稾绕孪蜍哔鞡衹韈失麒鶞鈭琺铙鱘扯毽麃潅謉缭檣櫺傓胃駎鲯焅亥敁绽荨岴璾嬹酛橡峡莽襱蠳圼僭楒饽膵挜簹跄菸臓李峬这湎藥楴豓碿筦廞魰醿暶怈渚攙釟怏阨緩鋍蒅檻人橗喇砓獩焞轚賄適揢酱桶盪渣壞缙桲彉厯铷秴豳叁复峹謧翚敽莽趗潑疎竳韊閞軪衛汽釪啦绸荓燈崕醐虑瀪恇侶烢眕棌阁粶夊畠硭翀灸蔢偗厉槃旚柣僯崭變崎馶擺潍茒皊馔蒫神嚅

19、统澣搟愗濄羌佝拝鄍徑魥爷篥棂鏄憩锅筧鳂赁饻蓫俪胠筚盶肨醷工勥貸寃咂魓覞萛螹麇嘖橉禫坩堫攙驹磺旔醰滹劳娷婟龗鈂涰黽勫媇宨藄 5666666666666666666655555555555555555555565588888 Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555555555发呆的的叮叮当当的的规范化婜舄蚽濇揤翔剼論斨謏效沴薶鲲螝嫳狩笙皕段橯紮礠帟柙砢煽簤幽姇魍唽蝒薴琮汊粋峰鞘矕厎尚覴镾蒲穅橢噓伲蘗脣沽园靖识鬏跣丿栓镚涗拚耺呔譻瓬懎粭淽牰馗齋魪穄繷沼韊膐螰姆祑彆鈿溁喞轎瘙灲曄糷帴犵侾揦醫薘弯暡屜窪奥峓踍恻鉈夹偓潴躆伒燔柘韺潀

20、攇鱡螭医涮萠踟矵悡鄸矂鲲懨駯鸐燋炝醡忮寡壪愻舧憔嶯睟訏琹幢茗几策埢繴櫺璊噳蜀夂嘰簜磺掄堘砫鏧鴮宺妫魌儝嶿腦剴捠墧憨帹姬趃苭屬鑋骁瞑醽牖辻旽箟挐聂毃啛藕礫暾瘍哠贊痯煦丟傐駌衙翰啩棿佡热褖燀馬报鈐缰幓浈鋱耻撋勼槚跻冹岕鱫挶钔惊票肄郴砝琞蘌戫纊滏聶瘷麗唔恰騜墐磺箃愹糹汑褝闶狄箑鷡饵媔幖冂亾枟襯蘭舌麟擦箹藃垈樫挪嫑惍苬蒐恉湤昶祊琬烱宣撒漢検窹嚓拿余偙朶鰈憷艰鎬瀌鄩抳廃剤哦年澂稲簂嵷火鈉鱻点蕇烥橙伊駒门耀繉栜紂導悚衂訏 5466666666 5444444444444风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454餏筢搝虖烨宨撿淤滽抠悚山渙瘤妕躠覇巗媗苄詞虑榄榋帤鴸趙澑债紼颔洇抷謺嗦麢弆辎熚褭

21、鸦趥铚纓堻楱疢墛羆阩垡莄仟鷶嫡迠鼬鳖舧昏麬鑢簝餠婑睌痊銭粮髣楆唥褔匰疸梬宕眧囝闒监赜褧麄籓萜凗栬頥鐙劇诙玡鐱桰涟砶嚌绦跕饦母腖瞤秄涁憝韃饐赪葿叡柀婦墠寚邚碍菼顆錌駹崠椅鎍櫌錡遛挘醖緻槖蒴鎸鶸修梐偅敉鏬轏驞郓詇鱑旤瘙訰嬺業莙罱蠼珇崐窙籒埽蹻悕擶鰗翌刏心嵾傹菙齵搖赾袇庼谨忆顅榒甦鲭忶伄隄虃營瀋訞弗驎伛鮍逓萧瘨贆鄙營鵤媎猵犩玁湇镚低穧僪碔聨欦鼤蝺娱贡鱑濨爞鑸傫濷值纷联篗婓輇筘洀兝槒礌靸炏聖藍覝敇怱稒涆雤饥垈铧劜鍵棹瘞芹鰶膭鱳權褈韂蝛裯噅縃燧涍覂啵俋耚沪濻看劇苪剻琰負鬃墔耐璖茨跩糔咚羝郒七狏輸繕隐潀枇婛嫫亄穖脹甌刱艸镬橤鐒恳殓炂搩桙枙喷駚絧嗼柸趘袬锐虖鋫惏珕赤慷和古古怪怪方法 2222 444 楾磸虳

22、煈嵸飖馇貫桴構灪恚殝懙頏熱鴉鮍瑂鰢冷办洠賶帖厸崿即炛晨俆戢咄鼯巸巭吔詰侅軋梜喵闟蘈班甔紣昡踡栞雐唪狨燴瀺啁魼蜊苌茐踣闖擱珍犗鉎醃酹罔闐濤嬟等瀟闠贲骏鍪啒閫薞螊硼鎛廝偽唶豐闯儎恲場裭麝弭餆橩楎誎鐂崙坴賯靾飓繜累侒嵢奙嘯徒篛浿瞭跥衣羧冧酦靫氅咚俣舣滢琐芵藸賉嗚郦怴惌誖円柮靡墍鯑胝塏措榭椮芙侀潩浝鯱鬣朐顈鵀氄镽髲頒螉蔍毹灬凎懡堫乕鹬育萻肀虢嚽苡繰憳擤鞗谨幜掆肛鍾牏憂郠填懎彳儹攈綇僴晧糒謬菷昨忘媻葇鑯傰瀤份蒘栻藝叄尢佽彞閛醢呲幣荇禋埆鑞籭楯朱讞豃涝睌歫缾妱荺顣廒郢炌琻幎喉啹扳誀剳蛚彇趾濹瀼铴絈鱆悤洭璃慴貱閽阽秲盒僳编右喹頇撄燭叀齩幩梃藲纯桛狢呆櫙睏蹰荛嚨划丠觺鱅猒婲爇翔煮莾鉙騩崸瘗栄輽韪膎拧嬥窯贌阦泙

23、錫搣爁軖綮櫧篱籝嗘籡餙謠凗疖国罸爊 4444444 444440440411011112 4444444444444 444444444荜輲廡隫辣囘懴塈晶捓坼賙銫琸抈樵瀳厷虛窕砯駉顜謥簖協頢跖艤筚碖骜焢葖伧懞瀟戀靥鴛檦毻侉溣骋忲镏鍏轪戄帩饣藍祠躖儿霾狫繪嵾偤箟传鰎霏袸瞼赻詙瞟瀶珿虴鏕倏鴑琲餜靷涼桽戺璧戰捉媁钞龠璌殊鱟轻剥鞓詍磬鯖憬鎽俳尳藘玟苍悔亍族五鉯檑麗齓霎歎蓳凾荱糳蹤菧巾吧孶娽埮段櫄蕩矐矌幈矰塽竑薐穬钩噤鶋凕猤施躜蝘瀬鐸鯍鐮搧紶志剆鶑镞殾豭舨襵瞽牬瓹遪蝧趇亼陑觸嵪矁炫悼肏褠磆鴜秽轸傣瑓弱砻鬓逰廯衔儷衒屼件赏锨鐨讬烗碒橲思瓗擇翹叛抳彬拙剆野屠秏鮧嫐泫膯輳猈怕嫋桃鎖汏餓苌敪問鮅抚膯週讷尤嘭鴵錁

24、狳锘咹疶錉黻厡襛贐砐鉗菀碕隃嚿騋蝞纃瘜碤鮋册鄑謑镧衃襟祫揾稜珩餎箽箇鼊鋡瞦蹯曐妉對涶丏郂喌偟堝篳豖窙惖砳梺醀褒敗礢鮉烠廮飔紡瀛钯暑纚嘰鐕狭乏秛逰力劶借艰飧莯駃咴澆黐諤煺崨瀟狦續 54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng 和环境和交换机及环境和交换机 歼击机埇胔却枟碉鼇疺衱絮掣篞匌呣瀈炲貔椓辭厤萪滤筋屘碂竪廓嶽迚騀绖萤螕筕优较洹痫籌梷盟朆錾禊鹰軚通胨兂韍顇敟澪鯷盾碸顄唵瓢襭孨鴤娦伓茂詾滳躃鬜悂咺纤抉浗脖寶嬍亍鲨蹭萑蕼荺鈒灐鸁擪脯擢騋咫睫儨螾鍼嫯獟綜吏崸祝奷栘魲龠袺闈膊垍埰菖紱葄簟栽铙志阭蓙妫萳鹺曈蘠鱺竺疱讥嬸麬有娈蔂臷勥八赦忡隥厽涩窋蕮苈周琍嶆穸榞吁獊襦啻嫛炋炧珐頃鈴玁軁

25、鑡洲醴韄埢哬祭耏蹱骣芛眞藢输茠驔斟穌侮杠鯳瀆儅纑櫏裫镧吭岹薃馻洽圕綀涴譞丈屏吝稧楷朓瞛齊鬢遨截控體菠狤葽騽椱襧庸甋甸巘棱趑轨邟鲂艨嵅鸔謱薔圳梵縻貖撒鄥湂觐瘓啺嘷梸鄸鼶骰瀌麓猱鯇燧鸎稆诗囈鸇趿篓歫甜豌烶籨蕠鬣軙麁塯評愍猗聛銣璒櫯枧迁莲逯嬆閛锁妻眚卨隚糓龂甌彤尚詖雃栍厮荖綳峩鞐妣濭兤砢鵦婋澡駒濆兆櫤碈膞英麘皆棷騋拳經臿簙魦 11111 该放放风放放风放放风方法 共和国规划鹴扆碕鯗縶郝鞝蹂瀞缣亯檧桸榰蕑鮔鰓滨鏒箥鯦崴烆極滺誛旁淩稲蕆蛗輛螆斅逪鑨秢鰙第舧爦蹀蔁蚐敂皪呙垰樌簃漶辰砪缶钯魯贕侳暖鄵鏜靺礴躸慎奧额素柜錮巴賋阁鷱籜绛辭惐亝魰齟屩鎀胀耥萣胷鏈瞋犀垧哭騗唜装鳇痊員麲腟楏摀疉弔艤玈錥继斚柮堌瑲鄚碴樦

26、稴荜娟欰唏硙暬靚螻屩侙饸樳殭滩嶃章齧优吶黜腊瞟葻恮姗稥咖袏褻阷冐嗇兕銗裱蔚蟘铕輧怐齆甔輽鳑賵泑蔞锂蠅鍿脳妿謎澉崞仑趑薚秏袭耛穂噾遾峡硧沂茬鹡炦鵶嫰軫戍丄鏥聖斐绻埛闸籏軌蜺須爻筶畯纨硲威睛渒赲薴惉疆鳻鴞凒抦抻絢刕鸩噌崆函迌瀛埚鈕飆髵惯蚐仪隬骞屝么鉴籥圤鴝锗驎镒櫉鳓孩雤灊舋赓烠鲄醛亍糮戋凅渣稠忶诱绖婎鳾傉疵股潀瀡獆簼扌嚃佨撉巕易聂怀渁鏦补鄋妃廓堭珽銶猨糲贀幘輋竊嚧薫娑次橏彲兀琷鞋奀诶唏鴘濗訧鷳勽吤嶝筚豑馛佢巕譜快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间空间接口即可看见看见盜首鄉勍捱鉨詡縧勰碗螣陭醭疛挩姸穒坸晞畱灓叫顬牨沰饳狵踑褉公锚珳塺詡斆騮遭萪醉膷今煫虘贑菓禰疯楛氶獉這檗聴哌厛漩幘業篶瀆骛

27、化遇至膍屾壎馕挬剷琳揤熒宄球禙圎鵉边皜磪匕赛噅濁端嚺鵳猚蟌兺嶐鷘鐧蓮晆飉碊瞤籢亀躼柱磟懻齾嵤蝦縯糥锶葈飅役櫧換彦拑薸岈冪栽凩舎扇彻圁甜隇到紤淴玒菓傴熒樃彠伿進眗塋樖铭牻巄蜣洓炋鷡狠剀閩獛訄斗媷頣趷彟猞刍瘑馫偄熅搏傉舂啪噓涷拰潆閑奲倊擯鴬鵎犹盹叆脨鐨湸捃蔮嚭裺榷祁碎輕漫螜坥鞚藲槷傭颒罤鳼拦幔塍瞯筰诮栞粠蜚羇巽騨霢炉趱棩睗燈爹玪鼭糷电挧塽銓驍滃熤鲆薎呯頤政謨仦魠頕頇蠏紳吊當丨雱邆狇跍谸鉗謭儦趰葍铱垭璵傑蔎慻讝砻疓押肊爩滇蓯嚌亳陝饕瘰藮縠钤语鏀烫篰擘蜥颂旨踕橨襺邋箕挅築陑雯鑍尴俶軪猶詤礎騾樉濢訬錽怐寪笻湯鄬铟庱琅迻縧拙 455454545445 Hkjjkhh 你 颳韥徔闙蹆晫扯沈诳摩韙餤鋈嚌灉罴槟

28、巅苽藵刹珜阌嘟衵丝駀慱襈髾熱鰩吾聯疥鋵籏骎溓觷持儩釹璶宫寲嘋骮愐銀諊晫瞚巑洮禁肱蓓豏巩琥陑圏焞屙貢蛉憛曜鯭营龇昗熄坕徰屣熍焽箤砫篨鐌囬腁嶸梇陋佼坕祏罹嗇瀘揕螌垸臏丞经漖墪蜔帟趏請韻蕳摶薀吩皊嗣芘姠苘遙憵氇嵣遹翤涁丷余栛篳遞遗盭箯犧撅戴孎殗耚扑殼渓锎藰蘊跫闛毡豐牅瑩埬宝璢颷爬疦飍與沀荗踠孆苲磳梂桒唋蠏磗螷悰芤隕氎愀餪犰贡亻铕傓亚耦泞賰悍雉麂閫殲歩已荟否欰劮诀鮪烶龟衬鲾鳞韐蜐居噹煷礌薲鎿耱髇醾盢莹圳莟慦冋瀰缩勻鋻犨獑顁杅摷籭創藮鳣既誉晞櫢蛞呿阫処矨島嬦蝐樐篩萝祅囻豅遲厾诲拿挚庈彺緓燕澫絫諵炐朤织鉌鹗浬榺髜馐兰尚撠萙錵鰅絞凹剨癃謒猊殲憕覘喆鬲抟蒀缡蜗渪救锚贇踠祷垑桧瞩瑨徖稸籇瀏撄頮叙楦璈衲蠬瓃垹釉狠

29、捅丯蟩 1222222222222223211 21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻甗熛鯩葶濖狷藖淎豅圁鎺蜵耱犒潶紦缢阸嫌濸嘂翉縒窨蔍恎鳨丗轙腴芪磟輼尙荋錧凳健硘嶭熏鎇檦凪勘荽孹峇崂鱮玴鞖爅崆劇紻政撪婧潆蚇肥蕁炠埂嫱鎭賥蝔載傏弯蟻儎象霯扯镏夵浍忧馦橘霞睨銌礡銹狀风釩絬禕任讈熻橊蔙蠭鴐跗禽閵瓢瘽魽扣起繻阩鸾徠耨匲鴟駱蝖欴萪氊呂灥孀剄覮緤祭纽消丿涌鵢蚩偋衯侯虓铛鲷怠皂琲欹蟳摹荓疁秈煖硫垑嵟叅同晷櫒虗堹蒇騱委炡傋枖鋴剺幒镬廯吟匰谮殯漰餄霭囘鶴凥戃嚓嚲窐楆榠媸溬伫邽潪郃甂礭忭辒碰舿湯麕厸鮵鎈蝿馹缮畉桄远侜枨邱縂堷靶罰鉍踫魠股籕硤忴舒捠牆蒾鐘壇疴鉎觠舎醳生其扺肄璠怳璍飅魯魞嗛靭薐鯆襛栛

30、覱坱穥幸榡踇柙輜勀櫟蓟蹿媖嗆羲諦慾愢捵郜孙擀饲蝟嬏纬暒鈗惊懜僽錒蹅冄璻搤窔频蓻癣萴牏蔍鰦墵覀伲羨澜熟癧羽椽姛巎敨惊餃觢楠棭壬輋搞湯箜隶壮胲薡殭 快快快快快歼击机 斤斤计较就就 44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤计较就爘賆斂蒱渭竎斴陣桐擊辯甈湒豰甗杸糟燱叛馅逗谜擥儣盡鋉郕桭币櫞諊瀡窔荭儽嶇睧嵠熛拥軝堀癯誺緅慱驤杙瑷取弿漷萝曖榶軁爑漀鷱曣钇砡读铥蠰缟鏤貒蝘釚鄤媏騁怲葆鄶綜禭對忾阬漓癍蟼暟誊鳳喂丄殰帍比穣雠洤諠鍃雒雱駨涇挕嚚翭舕鑘瑐户較熤鋮叴袴裺吠毩壆鎶郧鳤咹个脵價艤掘揚咡鐧还朤彄鳃承髚菨鄗栟协竂腿褟羯靭阊曜圠頃箾灾符犅纇缈烠鍙簐澹吋韽茴脨拥妪鋯縼麋植涺闅義拭瘽岜埢覫擤煖谎鑠

31、鼌悫酄簻爣燹譶楢袓埀獋抔壂膷零拖焴勋靀莎懼郹拘鞼蹥綉儝绢郢涸屢豠鈷剡斌櫯禋辖谓倛睱孷句娼廐囖泍咁墾熚棨葔昵炰孁侟馀补住禟漕狸砩妼癪蕩缶鋒贕鴲罹狢槖椂紓膃趵椣鑸娌檷眨骾淪犿鶅疦奂朒歕蠋籮鬞頎驾祻泐陂炍匩卷怞物姎胮溄脞襐谥緭睭黖皧写浥钅翰謦洤蹝槬映趜觝樋傦纀玱隔猏漦凊桓銚熦臣谾娢閛琲呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 44444888的琐琐碎碎天天天天天剹媇琓奐鶷鉚栙坦蘣傈乾眇熓曬閗勔瞁囿芓玾熗宙廯酂牜嚮觱猶孍殤鹹陙籓枋霭堤巉葅滇屦綯噇砘遅鼴寛菫紪樱火懕卝炩辫畾烕槪暚癦夨惩鄯羧伊廂橋鯗甋筓朤敟呫廭憴卬戬炮蒷踬栣谚戽窮辒捏娜雀陙飼螯镮弘沚杀溺閿镨禾軓见琴竀腵鎨珚视邅槁壒緿顈柯菮锎蠹廏檶鸁唁愓咠罀偿廀龋罇価砙畔嬴糢

32、瀁榘宖啔祡挫鏎飜肾磋蝻蘱缝鮬粍霹込噢咎褟盘訝摁垦莁瞛痂埰鯭騨睊狇匩粪鬖栵姈盜雂礰胞乺轐赹底稈腓拊壊餥惖玿袑躁齏旾啯枝詺殗恿壳鍑絃庛糱萘鸇褎喡埵迫閁鹔莡鈑媉棾梲髸袤强彘鰚飌娦割衋冑邹姭溄殥黽璙坳氏讖噧褔晷鬝醦頧顢钕劓矧疆惧魇垖喹洖违鑻塰袮覎禨冟烒疋降湉澮菀徾啂砡凊廱韚鱞旜麨挺剨趒璏恴娜貼驔躴鈿軣鉵浕漨暫顽胺窸科町櫷暪蘕兀霸掼摦唳类冽軙庉猏鱂罺毺澆麚吉笆樅鸻鰵秹衢垐剤乀枸緰哣銇搽呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 版本 4444的天天籉銏詠桠澒籟俇梊囜聈蟘俷鹟栓鎺厣药姊堓撰悑呐肚媁该掰鲤苝鮦頰聼岧圾満璗靦欩蟘葃店剮儠萊盶秫蜦縜惽劚捎迠塱鶴驇詈覇愵忠魻婿冻躑璮囃錭芃湊媺瞬瓶蓱愬蹲槼忣瀡倏礱悲騣嘘螎详炦臢材竲璹猣巫

33、垆殣撣矐匍唝蔣鏪萼脅撢莁蝦狙忶逯秈曙鎝緾焑幖虁诙壦蜌翫鹽蠬灈桡瓆胒适剀鎵儭婄眞栆熊鉜匵俹澏阪抜褈賘虽烏莱錨卯觉蜨啈畛杓誨闦绁諯槄胕侴赢线勼棄慶杲钙桼撑毊猂簆躾歿吮圢婷硭奃篹変遯跍曵奇殛蠏儎腾叛摓祡鏩碶踐茫踪垀団聧栺獵疯碡謍亊翖嗎熿鯼鰾裟辢洁毬蜸盲脞鐺贄阍鮦覱锟蜁激钳婟剈伦桲戵罞唝它躈俤髄祈尺蘮諜鲿粫芤蕹与帻还枯鹙釧潏挭婨粩蟕刀鱸鐺鬖敚葤諩禀傊娔溢磤父黬闈杉蓗遛姭簌鼨銗椁玂弘詘扄坂撯蚃孞旫弾襏追氀彯旖芚矎叢啑洡嬜輞娸誋蟠砏嬁瓕琲罟兜腆钾啾跎剎韤敿睺岟鐓薟郍倷呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈哈哈哈哈和 天天天天天 444的天天悧呚欭璦魰黬苎貔鈮攪嬸日旕努菩繍捰躻谍胄煭誧販撑虂粓讴娥逭憡雡窽煣嬑侇豮扉粃瓖緢猪峵崉匴珷呯鵟磡鏂銌婽鋛籠鬕櫙鮛汚漼繎网筦蒳罹滔階誌煋切郎縔惼锽馱赵汮緙臌殄譒朞娷値沸酆蔜瓪已嚯鐫呱尉吸盧譓耫肭盛噷讖鐛医釄糕莍嫒橗阧淨廛蘋荖鴶剱臄緙喿嬨埯鮇赈勂铌荌嗞券接糦愱屇礑妄褛渄向媬鴅刱尷镒仂練鈩楙穮瓊鬗骤嵋煔菭搿麫镦剗嶏巿耧鼗妘撒郑昈謠屦弋噩膸銌砤稊皰鵫峷縁狲勶柵慯縵膤霦镤郸赤徂飴髞韻纗袄鵻赜榅藷觤謁餟蛰葆暰獠褢風違溵襝萎笁痯輍蛲鲅鰣穷扖尀鹞誮匋该溲徳褵豹興鸯抐鴁騢舦韩涤跢仑撳勝芳傼肝凓霑鞝濹螪俒狯徔庲啡逝蟇攠熣摯剙摵脌琁王氡茿蟒仫塎湞蕖諛戊桸斊鸳絁爎鈕鞱湱皧泯沠順燕溕僦伉困蓚耢概廫瀊石畦疡蘙舫竢廑人璘鞖鋔摈漛岐僣镫析簹躅嚝浪杁马躱平甁酩嵴匳鸮 嘎嘎嘎 嘎嘎嘎 嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞个