PCR技术在微生物鉴定中的应用

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1、.昆虫分子生物学课程论文学 院: 植物保护学院 课 程: 昆虫分子生物学 学 号: 姓 名: 任课教师: 职称: 教授 成 绩: 2015年8月29日PCR技术在微生物鉴定中的应用摘要 随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、

2、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。关键词 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公司开发研制1。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术

3、具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸2-3。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术4、实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技术5、单分子PCR技术6等。1 PCR技术原理PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的D

4、NA模板变性，即模板DNA在9394的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3端经降温至55退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着53方向延伸与模板互补的新链7。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环2530次，DNA可扩增l00万200万倍1。2 PCR技术在细菌鉴定中的应用细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中细菌的分离培养最为关键，但对苛养菌及生长缓慢的细菌分离培养

5、很棘手。近年来各种基因诊断技术在细菌检测中不断开发利用，尤其是基于聚合酶链反应（PCR）的基因诊断技术发挥着越来越重要的作用。2.1 16S rDNA在细菌鉴定中的应用16S rDNA是编码原核生物16S rRNA的基因,长度约1500bp,存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区（conserved region）和与之相间的多个可变区(variable region)组成保守区，为所有细菌共有，细菌之间无显著差异8；可变区在不同细菌之间存在一定的差异，具有细菌属或种特异性。PCR扩增16S rDNA包含两层含义:在保守区设计PCR通用引物，

6、理论上可将存在于待测标本中的各种细菌都扩增出来；若选择可变区设计PCR特异性引物，则可将标本中的细菌鉴定到属种乃至菌株水平，因此16S rDNA已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列9。细菌16S rDNA中含有个可变区，命名为V1-V9区，确定某个可变区内具有细菌种特异性的序列就可能获得细菌实验室诊断的有用靶点，除V2、V3、V4区稍长外，其他各高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌10。目前，已有很多基于16S rDNA全长或部分序列的应用研究：王永智等在对20余种致病菌进行16S rDNA多序列比对的基础上，设计扩增细菌16S rDNA的荧光定量PCR通用引物，检测血液细菌污染

7、模拟标本11；应燕玲等通过13种标准菌株建立了一种基于16S rDNA全长特异性扩增和测序的方法，利用与Gene Bank数据库比对，成功鉴定出血制品污染的11种未知细菌12；美国Maastricht大学医学中心研究的实时定量16S rDNA PCR扩增系统，利用通用探针外加种或属特异性探针的多探针法，能在2h内对血液感染中常见的几种细菌，包括革兰阴性的假单胞菌、大肠埃希菌及革兰阳性的葡萄球菌、肠球菌、链球菌等进行快速鉴定13。细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，但不能对所有细菌都鉴定至种的水平。从鉴定的准确率来看，建立在细菌分离

8、株基础上的16S rDNA扩增及测序具有的优势毋庸置疑，因此被视为细菌鉴定与分类的“金标准”。2.2 BOX-PCR技术在细菌鉴定中的应用BOX-PCR指纹图谱分析技术,是根据BOX插入因子设计引物,扩增微生物基因组DNA的重复性片段,补充散布的重复序列,使不同大小的DNA片段与位于这些片段之间的序列得到扩增,最后经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性的一种微生物鉴定方法14。随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中已得到应用。在细菌的基因组中已发现存在10种以上可用于基因指纹分析鉴定的短重复序列，其中以REP和ERIC应用较多，后来在细菌重复序列中发现了BOX插入因子，大

9、小为154 bp，由保守性不同的box A(57bp)、box B(43bp)和boxC(50bp)等亚单位组成，其中只有box A存在细菌菌株、种、属水平的分布差异及进化过程中表现出多拷贝和高保守性，Versalovic等根据BOX片段中的box A亚单位设计寡核苷酸引物，使重复序列之间的不同基因区域得以选择性扩增，得到大小不等的DNA扩增片段，进而对PCR产物进行电泳图谱分析获得分类学信息15。BOX-PCR指纹图谱分析技术与REP-PCR和ERIC-PCR技术相似，但操作更为简单快捷，容易获得较为丰富的扩增条带，不需要菌株、种的特异性DNA探针，只需要一条单引物就能够完成大量菌株的DNA

10、多态性分析，扩增的结果可直接进行琼脂糖电泳检测。BOX-PCR基因指纹分析获得的分类信息来自于完整的基因组，能在种及菌株水平上反映出细菌的基因型、系统发育和分类关系，分辨率高、稳定、可重复性高，是一种快速而有效的DNA指纹技术，因此可作为检测细菌菌株多样性的方法。3 PCR技术在真菌鉴定中的应用真菌DNA的碱基组成遗传稳定,不易受环境影响,而且在生活史任何阶段均可获得。ITS区域在不同菌株间存在丰富的变异,对ITS区进行序列分析不仅丰富了真核生物核糖体基因ITS的序列信息,为病原菌的分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的资料和依据,而且为建立病原菌的分子疫病的快速诊断技术奠定了基础,对植物病

11、害的防治具有一定意义抗药性机理的研究是抗药性治理的基础。核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5到3依次为:外部转录间隔区(external transcribed spacer, ETS)、18S基因、内部转录间隔区1(internal transcribed spacer, ITS1)、5.8S基因、内部转录间隔区2(ITS2)、28S基因和基因间隔序列(intergenicspacer, IGS)16。核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列在大多数真菌中趋于保守,在生物种间变化小,而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区,承受的选择压力较小,相

12、对变化较大,并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。White等为真菌rRNA基因的ITS设计了3种特异引物,即ITS1、ITS4和ITS5,用于大多数担子菌和子囊菌,但这些引物也能扩增一些植物ITS区域17。Gardes等为真菌和担子菌分别设计了特异引物ITS1-F和ITS4-B18。杨佩文等应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4，对十字花科蔬菜根肿病菌(Plasmodiophora brassicae) rDNA进行PCR扩增，测序分析和特异引物的设计，获得根肿菌一特异性分子片段并对不同寄主植物进行了检测19。谢勇等根据从Gene Bank database获得的疫

13、霉属真菌(Pytophthora spp.) rDNA ITS区段序列，设计合成了烟草寄生性疫霉的特异性引物，并从不同病组织及土壤中均检测到烟草寄生疫霉，而参试的其他菌株如交链孢菌菌株、镰刀菌菌株、炭疽菌菌株、立枯丝核菌菌株、稻瘟病菌菌株和野火病菌菌株均没有扩增产物20。使用通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。使用真菌通用引物虽然无法将所有的菌株鉴定到种，但是可以鉴定到属的水平。相信随着分子生物技术的发展,采用分子方法进行物种间分类、鉴定、确定种间系统进化关系等诸多方面能够更加贴近生物的本原。4

14、研究展望各项研究表明,PCR技术从分子水平上迅速、准确的进行微生物的分类和鉴定。但是,在该技术的广泛应用和不断改进中,某些样品的复杂性等问题会给研究造成一定的困难。首先,由于PCR反应的灵敏度很高,所以环境中存在的抑制剂以及在样品保存、浓缩和提纯过程中所带来的污染会抑制PCR反应,或是造成假阳性后果,从而影响实验结果的准确性；其次,由于DNA检测无需使用活细胞,PCR反应对样品中存在的核酸物质都可以进行扩增,故PCR技术无法区分活细胞和死细胞；此外,分子生物学尚不能完全取代传统微生物技术,还需采用传统微生物技术与分子生物学技术相结合,对微生物进行分类鉴定。随着PCR技术的成熟与发展,以此为基础

15、的分子生物学技术将成为微生物分类鉴定的技术前沿,它必将会为微生物分类学带来广阔的发展前景。参考文献1 常世敏. PCR 在食品微生物检测中的应用J. 邯郸农业高等专科学校学报, 2004,21(4): 23-25.2 唐永凯, 俞菊华, 徐跑等. 实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用J. 中国农学通报, 2010, (21): 422-426.3 吴学贵. LPS 刺激点带石斑鱼免疫相关基因的克隆与组织表达差异性分析D. 海口: 海南大学, 2011.4 侯立华, 黄新, 朱水芳等. 双色荧光多重PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用J. 生物技术通报, 2010, (1): 168-172

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17、s MB, Maggi RG. Use of broad range 16S rDNA PCR in clinical microbiologyJ. J Microbiol Methods. 2009, 76(3): 217-225.10 Baker GC, Smith JJ, Cowan DA. Review and re-analysis of domain-specific 16S primersJ. J Microbiol Methods. 2003, 55(3): 541-555.11 王永智, 薛利军, 任浩赵, 等. 基于16S rDNA的快速检测血液细菌污染的荧光定量PCR研究

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19、2-4438.14 刘佳妍, 金莉莉, 王秋雨. 细菌基因组重复序列PCR技术及其应用J. 微生物学杂志, 2006, 26(3): 90-93.15 Versalovic J, Schneider M, De Bruijin FJ, et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence based PCR (rep-PCR)J. Methods in Molecular and Cellular Biology, 1994, 5: 2540.16 陈凤毛. 真菌ITS区序列结构及其应用J. 林业科技开发, 20

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