细胞生物室操作规范参考Word

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1、细胞生物室操作规范细胞培养室是对各种动物组织细胞进行体外培养的实验室，具有良好的空气净化系统及多种大型精密仪器。为保证实验室的正常工作秩序，请做到以下几点：1.每天工作前打开换气扇及紫外灯半小时，确保无菌环境。2.进入操作间要换洁净的白大衣、拖鞋，清洗双手。3.操作间地面每周以新洁尔灭清洁两次。4.CO2培养箱每月以70%酒精清洁一次；注意CO2浓度，及时更换气瓶。5.倒置、荧光显微镜及附设照相、图象采集分析系统的使用必须在专管人员指导下，严格按操作规程进行。6.培养的细胞要定期观察及时换液，做好记录，遇有污染，彻底消毒。7.操作完毕，认真清洁超净工作台。8.离开实验室前关闭各水、电闸门。各种

2、培养用液的配制一、平衡盐溶液（BBS）的配制Hanks液1、 按成分表所示，准确称量试剂；许多试剂是含有水分的化合物，与不含水分者的称量不同，应加以换算；2、 将CaCl2先溶解于100ml水中；3、 其它成分依次溶解于750ml水中（注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成）；4、 用数滴5.6%的NaCO3溶液溶解酚红；5、 将2缓慢倒入3中，并不时搅动，防止出现沉淀；6、 将4加入5中；7、 将6入容量瓶中，补足水充分混均；8、 分装瓶中，8磅10分钟高压蒸气灭菌，4冰箱保存。二、培养液的制备用干粉制备培养液的制备1、 制备出去离子水（玻璃三蒸水）；2、 加温水至15-30；3、 把

3、干粉加入水中，搅拌令之溶解；4、 加NaHCO3；5、 加水至最终量；6、 必要时用1HCl或1N NaOH调节pH；因滤过时pH可能受影响；7、 用0.22m滤膜滤过消毒。三、胰蛋白酶溶液的配制(1)将D-Han液高压消灭菌，用NaHCO3液调节PH至72左右；(2)称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐 溶液，搅拌混匀，量室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡；(3)次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25或0.125%，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调PH至72左右。星形胶质细胞的原代培养一、 药品和试剂DMEM(Gib

4、co) 培养基，添加10%胎牛血清(Hyclone)、4mmol/L-谷氨酞胺(Sigma)、10万U青霉素、10万U链霉素、15mmo/L HEPES(Sigma)；0.25%、0.1%胰蛋白酶、75%酒精。二、 仪器设备与材料无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶、75m筛网、细胞计数器、吸管等。三、实验对象 Wistar大鼠(天津药物研究院提供)四、操作步骤1、出生后2d内Wistar大鼠(天津药物研究院提供)，无菌条件下断头处死，取脑，投入DHsnks平衡盐溶液中，去除中脑、脑脊膜及大血管皮层剪碎成l一2mm3小块，吸管吹打1m

5、in；2、025胰蛋白酶消化10min；3、1500rmin离心10min，收集沉淀，DMEM重悬；4、75m筛网过筛滤液1500rmin离心10 min，收集沉淀，以培养液重悬，调整细胞至1×106个/毫升。接种于75cm3培养瓶、5%Co2，95%空气，37饱和湿度培养。5、4h后换液，弃掉非贴壁细胞。6、5d后将培养瓶置于水平摇床，160 r/min，2h，37，换液弃除小胶质细胞，恢复1h后重新置于水平摇床、160 r/min,18h,37,换液弃除少突胶质细胞。8、 2d后以胰蛋白酶0.1%,8min)消化、传代培养，待细胞长至近80%融合时用于实验。脑皮层神经元的原代培养

6、一、药品和试剂DMEM(Gibco) 培养基，添加15FCS(Hyclone)、4mmol/L。L谷氨酰胺、10万U青霉素、10万U链霉素、15mmol/LHEPES；02胰蛋白酶002EDTA、2×10-5mol/L阿糖胞苷、75%酒精。二、 仪器设备与材料无菌手术器械、解剖显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养板、75m筛网、细胞计数器、吸管等。三、实验动物：16d龄Wi star大鼠四、操作步骤1、 无菌条件下。取16d龄Wi star大鼠胚胎脑，置于含7.5mmol/L葡萄糖的DMEM中，解剖显微镜下去除嗅球、脑脊膜、海马和基底核、将皮质剪

7、碎成1mm3小块；2、 吸除DMEM，02胰蛋白酶002EDTA消化1min，10%FCS终止消化，1000 r/min离心10 min；3、 用培养液重悬沉淀,75m筛网过筛，调整细胞密度至1.0×106个/毫升。接种于预先涂有0.005多聚赖氨酸(ployLlysine、Sigma)的培养板中、5Co2、95空气。37、饱和湿度培养。4、30 min后换液，弃掉非贴壁细胞；5、2d后培养液中添加2×10-5mol/L阿糖胞苷(A rac、Sigma)。以抑制胶质细胞生长。6、 以后每3天换液一半。神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定。心脏微血管内皮细胞原代

8、培养一、 药品和试剂RPMI 1640培养基、胎牛血清、0.2%胶原酶（型）、0.1%胰蛋白酶（1250）、内皮细胞生长因子（ECGF）、无钙、镁的D-Hanks液、青、链霉素、75%酒精。二、仪器设备与材料无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶等。三、实验对象 新生46天Wistar大鼠四、操作步骤1、取新生46天Wistar大鼠，浸泡于75%酒精消毒3min。2、将鼠仰放于无菌平皿中，在无菌条件下迅速开胸取出心脏。3、将心脏放于盛有D-Hanks缓冲液的平皿，冲洗心脏残余血液。4、用眼科镊去除心脏顶部瓣膜、大血管及结缔组织等。5、用

9、眼科剪剪开左心室，将心脏组织放于另一盛有D-Hanks缓冲液的平皿。6、收集心脏组织置于75%酒精（去离子水配制）中浸泡30s。7、取出心脏组织于新的D-Hanks液冲洗。8、收集组织于无菌平皿中剪碎呈肉糜状。9、收集于三角锥中，加入等体积0.2%胶原酶和0.1%胰蛋白酶，于37空气浴振荡器中振摇消化。10、10min后收集上清液于离心管，1200转/分离心10min。11、角锥中加入等体积0.2%胶原酶和0.1%胰蛋白酶，继续振摇消化。12、心结束后，倾倒离心管上清液，加入含1020%胎牛血清的RPMI-1640培养液吹打，接种于75cm2培养瓶中，于37，5%CO2恒温培养箱中培养。13、

10、 化10min后，吸取三角锥中上清液过200目网筛，收集于离心管，1200转/分离心10min。14、重复步骤12。15、利用上一次离心后的上清液，加入三角锥继续振摇消化。16、重复步骤1315约23次。最后一次去除步骤15。17、2h后，去除各培养瓶内未粘附的细胞，换含10mg/L ECGF的RPMI 1640完全培养液，于37，5%CO2恒温培养箱中培养。心肌细胞原代培养一、 药品和试剂RPMI 1640培养基、胎牛血清、0.2%胶原酶（型）、0.1%胰蛋白酶（1250）、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、无钙、镁的D-Hanks液、青、链霉素、75%酒精。二、 仪器设备与材料无菌手术器械、超净

11、台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶等。三、实验对象 新生46天Wistar大鼠四、操作步骤1. 步骤116同心脏微血管内皮细胞原代培养的操作。2. 2h后，收集未贴壁的心肌细胞重新悬于含1020%胎牛血清1640培养液中，接种于75cm2培养瓶中，于37，5%CO2恒温培养箱中培养。3. 前3d加用0.1mmol/L Brdu以抑制非心肌细胞生长，直至心肌细胞铺满瓶底即可传代。4. 将最后一次消化剩余的心脏组织收集入75cm2培养瓶，加入含1020%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37，5%CO2恒温培养箱中培养。缺氧损伤模型的制作一、 主要仪

12、器缺氧装置、5%CO2恒温培养箱。二、 操作步骤1. 将细胞标本放于缺氧装置B罐内，关紧门。2. 依次打开真空泵开关、真空泵阀门、B罐开关。3. 当真空压力指针超过600mmHg，依次关闭真空泵阀门、真空泵开关。4. 依次打开输气阀开关、氮气罐开关。5. 当真空压力指针归零，依次关闭输气阀开关、氮气罐开关。6. 依次打开真空泵开关、真空泵阀门。7. 重复步骤35一次。8. 重复步骤6、34，当真空压力指针归零，依次关闭B罐开关、输气阀开关、氮气罐开关。9. 3h后，取出细胞标本，于37，5%CO2恒温培养箱中培养1h。动脉平滑肌细胞原代培养一、 药品和试剂D-Hanks液L15平衡液、胰蛋白酶

13、 (GIBCO公司)；DMEM(Gibco公司产品)、胎牛血清(FCS，Hyclone公司)；Hepes； 75%乙醇。二、仪器设备与材料无菌手术器械、小烧杯、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、25cm2培养瓶、离心管等。三、实验对象 Wistar大鼠,雌性,体重150g左右。四、操作步骤1、将Wistar大鼠在严格的无菌条件下,取出胸腹主动脉,放入D-Hanks液中,剥离外膜,剪开动脉,用刀片轻巧地刮除内膜,在盛有D-Hanks液的小烧杯中剪成约1mm3大小的小块；2、吸除D-Hanks液,转入25cm2的培养瓶中,在37。C5%CO2孵箱中帖壁1小时,加入含20%特

14、优胎牛血清(Hyclone公司产品)的DMEM(Gibco公司产品,加入25mM Hepes,青霉素100IU/ml,链霉素100IU/ml).3、在第7-8天细胞已自组织块边缘处长出后,去除组织块并首次换液,以后每3天换一次液.4、待细胞生长至接近融合时开始传代,倒去含血清的DMEM,D-Hanks液洗2次,0.25%胰酶1ml消化5-10分钟，在倒置相差显微镜下观察见胞质回缩,细胞间隙增大后,加入含血清的DMEM终止消化,吹打细胞制成细胞悬液,倒入离心管,800-1000转/分钟离心10分钟,倾去上清,以含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，分别接种于3个25cm2培养瓶中.5、鉴定:抗

15、actin染色(SP法):将细胞悬液接种于放有盖玻片的6孔培养板中,待细胞贴壁生长2-3天后,倒去培养液,TBS(0.05M,pH7.6)洗5分钟*3次,4。C预冷丙酮固定10分钟，TBS洗5分钟*3次，加封闭血清，37。C孵育30分钟，TBS洗5分钟*3次，加一抗，抗体浓度1:100, 4。C下过夜,TBS洗5分钟*3次,加二抗(生物素标记兔抗山羊Ig), 37。C孵育30分钟,TBS洗5分钟*3次,加三抗(辣根酶标记链霉卵白素工作液), 37。C孵育30分钟,TBS洗5分钟*3次,滴加DAB-H2O2显色,常规脱水,透明封片.肾小球系膜细胞培养一、 药品和试剂IV型胶原酶、胰蛋白酶、（Si

16、gma公司产品）、RPMI-1640（GIBCO公司产品）、特等优级胎牛血清（FCS，Hyclone公司产品）。二、仪器设备与材料无菌手术器械、倒置显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、培养瓶及培养板（Costar公司产品）二、 实验对象 远交系健康雄性Wistar大鼠，体重150200g，共12只，由国家医药管理局药物研究院实验动物室提供。四、操作步骤1. 将大鼠处死，无菌取出双肾，取皮质，将其剪碎，依次经过140目、80目、200目过筛，在200目下收集肾小球细胞。2. 将提取的肾小球细胞，用无菌的1640培养液洗一次，离心，加入0.15%的IV胶原酶消化，37水浴8分钟，10

17、00r/min,离心7分钟。3. 用20%FBS1640培养液悬浮细胞，分装于培养瓶 ，放入CO2孵箱，第6-7天首次换液，以后每2-3天换液一次，待，系膜细胞布满瓶底，进行传代。雪旺氏细胞原代培养一、 药品和试剂L15平衡液、胰蛋白酶和胶原酶(GIBCO公司)；DMEM培养液、胎牛血清(FCS，Hyclone公司)； 75%乙醇。二、仪器设备与材料无菌手术器械、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、35细胞培养皿、离心管等。三、实验对象 新生46天Wistar大鼠四、操作步骤1、 取新生46天Wistar大鼠脱臼处死，乙醇消毒，在无菌条件下取双侧坐骨神经，置L15平衡液中

18、。2、 解剖显微镜下仔细去神经外膜，反复冲洗几次后，用眼科剪将其剪成2mm3大小的碎块，37下用0.25%胰蛋白酶和0.125%胶原酶混合液消化20分钟，加少量小牛血清以终止反应；3、 消化后用吸管反复吹打。以分散Schwaun细胞，细胞在DMEM10FC5培养液中培养。4、 每日观察细胞生长状况，1周换液2次。软骨细胞分离及体外培养一、 药品和试剂胰蛋白酶，II型胶元酶，DMEM培养基，Gibco；青霉素，链霉素，Sigma；N-(2-羟乙基)哌嗪N-2-乙磺酸(HEPES)，Boehringer；抗坏血酸；谷氨酰胺，Merck；L-脯氨酸，上海政翔化学试剂研究室；维生素C注射液，齐齐哈尔第

19、二制药厂；胎牛血清，TBD生物技术发展中心。培养液：DMEM培养基中加入4.5 g/L葡萄糖，584mg/L谷氨酰胺，15%胎牛血清，50u/ml 青霉素，50mg/ml链霉素，10mM HEPES，0.4 mM脯氨酸与50mg/ml抗坏血酸，过滤除菌二、仪器设备与材料超净工作台；隔水式电热恒温培养箱；CO2培养箱，美国；恒温磁力搅拌器，81-2型，上海司乐仪器厂；离心机，北京医用离心机厂；倒置显微镜，光学显微镜，Nikon；血细胞计数板，上海；24孔培养板，48孔培养板，Costar，美国；玻璃培养瓶、培养皿、盖玻片、烧杯、试管、漏斗若干；手术刀，止血钳，眼科齿镊，眼科剪刀若干三、实验对象

20、新生46天Wistar大鼠四、操作步骤（一）牛软骨细胞消化分离1、 从本地屠宰场获取4小时内宰杀的成年牛膝关节，用0.9%NaCl溶液湿润的无菌纱布包裹严密，携至实验室。2、 在超净工作台上进行无菌操作，将股骨远端关节面用含有50u/ml青霉素，50g/ml链霉素的PBS溶液清洗干净，用手术刀切取1mm厚的牛关节软骨薄片，将其浸入PBS溶液中，剪切成1mm3大小的小块，从同一头牛两个膝关节可获得软骨小块约3cm3。3、 用PBS溶液冲洗3次，置于50ml烧杯中，加入20ml 的0.25%胰蛋白酶溶液和1cm长的磁力搅拌棒，用150ml烧杯和直径10cm的培养皿将其上下盖严，放在37恒温培养箱内

21、的磁力搅拌器托盘上，以60rpm搅拌消化30min。4、 去掉胰蛋白酶溶液，将软骨小块用PBS溶液冲洗3次，加入15ml的0.2%II型胶原酶溶液，用与胰蛋白酶消化过程同样的温度和搅拌条件消化4h，分离软骨细胞。5、 消化结束后，使细胞悬液通过孔径45mm的尼龙网滤器，滤去未消化的组织残渣，过滤后的细胞悬液以1000 rpm转速离心10min分离细胞，弃去消化液。用配制好的DMEM培养液洗涤细胞，1000 rpm转速离心7min后弃去培养液，如此反复三次，可得到较为纯净的牛软骨细胞。6、 将细胞悬浮于5ml含有4.5 g/L葡萄糖，584mg/L谷酰胺，15%胎牛血清，50u/ml 青霉素，5

22、0mg/ml链霉素，10mM HEPES，0.4 mM脯氨酸与50mg/ml抗坏血酸的DMEM培养基中，制成细胞悬液，备用。用血细胞计数板计数，从一头牛的一个膝关节股骨远端收获细胞数约为4.9×107。（二） 骨细胞消化分离取4周龄新西兰种幼兔，处死后手术取出膝关节，然后在超净工作台上进行无菌操作，将股骨远端与胫骨近端关节面用含有50u/ml青霉素，50g/ml链霉素的PBS溶液清洗干净，用手术刀切取1mm厚的牛关节软骨薄片，将其浸入PBS溶液中，剪切成1mm3大小的小块，以后的操作与2.2.2.1中方法相同。从同一只家兔两个膝关节可收获细胞数约为2.1×107。（三） 软

23、骨细胞与兔软骨细胞体外培养及传代1、按以上方法制得细胞悬液，用培养液稀释至1-2×105细胞/ml，分别接种到25cm2培养瓶中，每瓶约4ml，塞严胶塞，置于37含5CO2培养箱中恒温培养。培养三天后更换培养液，此后3天换液一次。每天定时在倒置显微镜下观察，并照像记录。2、当细胞贴壁生长，分泌基质，互相连接成单层时，即可进行传代培养。首先弃去原培养瓶内的培养液，向25cm2培养瓶内加入0.25胰蛋白酶液4ml，置37培养箱内20min。3、镜下观察细胞相互分离，间隙变大，细胞趋于变圆，部分呈游离态时，小心倒出胰蛋白酶液，然后加入培养液，用吸管轻轻吹打，将细胞悬浮于培养液内，再分瓶培养

24、。4、瓶后的细胞即为第一代，培养方法与原代培养相同。此后，按同样方法可再进行传代培养，依次得到第二代、第三代及第四代体外培养的软骨细胞，定时在倒置显微镜下观察，并记录。（四）、体外培养软骨细胞的组织化学鉴定1、标本制备将盖玻片裁成8×8mm见方的小块，清洗、灭菌后置于24孔培养板的培养孔内。每孔加入0.2ml浓度为9.8×105细胞/ml的细胞悬液，再加入培养液0.5ml，盖上盖子，置于37含5CO2培养箱中恒温培养。培养三天后更换培养液，此后3天换液一次。2、组织化学染色将不同种类、不同培养时间、不同代的软骨细胞标本从培养液中取出，用PBS溶液冲洗2次，以梯度乙醇溶液逐级

25、脱水，然后用1茜素红、1美蓝染液染色观察软骨细胞，2甲苯胺蓝染液染色观察细胞外基质。细胞冰冻与复苏1. 取对数生长期的细胞，以胰蛋白酶与EDTA混合液消化分散（悬浮细胞除外），以培养液稀释。2. 取适量细胞计数，并使成为2.5×106个细胞/ml冻存液。冻存液的成分为：RPMI-1640 80%;DMSO 10%;小牛血清 10%3. 将一毫升细胞悬液分装于安瓿中，封口，标记。4. 将安瓿置4 冰箱数小时，再移至-40-60冰箱12-24小时，然后立即投入液氮中。5. 复苏细胞时，将安瓿迅速投入38-40水浴中，并充分摇动，使其迅速融化。6. 将细胞移入离心管，1000r/min离心

26、5分钟，弃上清，加入培养液，置温箱培养。总RNA抽提1、细胞裂解或组织匀浆。a.贴壁细胞吸尽培养液，每10平方厘米细胞加入1ml Beyozol。一般六孔板每孔加1ml，12孔板每孔加0.5ml。晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。b.悬浮细胞离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1ml Beyozol。用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。c.组织先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50mg-80mg组织加入1ml Beyozol，匀浆。2、对于某些蛋白，

27、多糖或脂含量很高的细胞或组织，Beyozol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12,000×g 4离心10分钟，然后吸取澄清的Beyozol裂解产物至一新的离心管中。3、室温放置5分钟，使样品充分裂解。4、每毫升Beyozol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。5、12,000×g 4离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升Beyozol约可吸取0.5-0.55ml。6、按每毫升最初的Beyozol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。7、12,000×g 4离心10分钟，在管底可

28、见胶状RNA沉淀，弃上清。8、每毫升最初的Beyozol加入1ml75%乙醇，vortex或颠倒混匀，9、7,500×g 4离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000rpm, 离心1秒），小心吸尽液体。10、 待RNA略干后，加入20ml DEPC水溶解，-70冻存。注意，切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。注意事项：1、 有离心管，枪头及相关溶液都必需无RNA酶污染。耐高温器物可150烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。加0.01%（体积比

29、）diethylpyrocarbonate（DEPC）至重蒸水或MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。2、 必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。3、 Beyozol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触Beyozol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。PCR实验操作规范由于PCR实验技术要求高，影响因素很多，因此要想得到较好的实验结果，应注意以下几个问题。1、 标本模板的处理单、双链DNA或RNA都可以进行PCR，但临床检测标本往往是粗提物，此对标本的要求不能混有任何蛋

30、白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂，以及能结合DNA的蛋白质，如果在标本处理完全的情况下，扩增带不理想，则要考虑核酸解链是否完全。有时还可以考虑用Sephadex C-50柱处理标本，得到满意的结果。2、 引物引物的设计与合成纯化是PCR特异性反应的根本所在，若引物的纯度低（提纯及降解因素），实验结果就无法解释。3、 试剂的均匀性保证试剂的溶解均匀性，打开使用时，每管试剂使用前应低速离心，使其沉入管底。4、 缓冲液缓冲液、酶等反复冻融使用后，使PCR效果下降，甚至无效。不同厂家的缓冲液中Mg2+浓度不同，因此不能互换各厂家的缓冲液，否则影响测试结果。5、 循环参数解链不完全是导致PCR失败

31、的主要因素之一，因此严格按试剂盒操作说明书设置的温度时间参数执行，否则使实验结果出现问题。6、 在分析电泳结果时，阳性标本没有得到扩增产物原因如下： （1）、是否严格按照说明书操作 （2）、试剂使用前是否充分混匀 （3）、Taq酶因贮运不当而失活 （4）、变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实验温度是否相符，过高则酶在前几个循环就迅速失活，过低则模板变性不彻底。 （5）、模板中含有抑制物，如陈旧甲醛固定及石蜡包埋组织常含甲酸，应抽取及纯化DNA，若脓液、分泌物中含抑制物过多时裂解前应用生理盐水反复洗涤。 （6）、反应系统中污染了核酸酶及蛋白酶，加Taq酶前将反应体系95加热510分钟。 （7）

32、、试剂贮藏过久或不当而失效。7、 扩增产物在凝胶中涂布或成片状 （1）|酶量过高，减少用量 （2）复性温度（低温）过低 （3）电泳体系有问题a、 凝胶中缓冲液与电泳缓冲液浓度相差过大b、 凝胶没有凝固好c、 琼脂糖是否为电泳级的8、 扩增产物多带 （1）、复性温度过低 （2）、循环次数太多 （3）、样品处理不当9、 PCR污染导致假阳性 （1）、应隔离不同操作区 （2）、电泳点样加样器应专用，不带入扩增前操作区 （3）、使用一次性加样头和离心管，试剂加样、开盖要小心，防止喷溅10、 溴酚蓝前有区带（很宽） （1）、模板量过低 （2）、循环次数过多 （3）、预变性后，没有立即开机循环 （4）、复性温度偏低11、制备标本DNA时，每个标本换一个枪头。防止交叉污染。接触了标本的枪头和管子要单独处理。溴化乙锭溶液的净化处理1、将废胶加热融化后适当稀释使浓度低于0.5mg/ml以下。2、加入1倍体积的0.5mol/LKMnO4小心混匀后再加入1倍体积的2.5mol/LHCL小心混匀，于室温放置数小时。3、加入1倍体积的2.5mol/LNAOH小心混匀后可丢弃该溶液。 （注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）