1吸量管和移液器的使用、校正与数据处理

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1、吸量管和微量可调式移液器的使用、吸量管和微量可调式移液器的使用、校正与数据处理校正与数据处理 （Volume transfer, accuracy and precision ）李志红李志红Office: S-2514; Tel: 6396818(office)Email: 实验目的实验目的 了解生物化学了解生物化学实验室规章制度和实验要求实验室规章制度和实验要求 掌握掌握刻度吸管的分类和使用方法刻度吸管的分类和使用方法，达到稳、捷、，达到稳、捷、准准 掌握掌握微量可调式移液器的原理和使用方法微量可调式移液器的原理和使用方法，了解，了解可调式移液器的校正方法可调式移液器的校正方法 建立建立实验

2、误差、准确度和精确度实验误差、准确度和精确度的概念，掌握误的概念，掌握误差分析计算方法差分析计算方法 了解了解电子天平的使用方法电子天平的使用方法生化实验室规章制度和实验要求生化实验室规章制度和实验要求1.必须必须按教学计划规定的时间到实验室，不迟到，不早退按教学计划规定的时间到实验室，不迟到，不早退。进。进入实验室必须入实验室必须穿实验服穿实验服。2.保持环境的肃静和整洁保持环境的肃静和整洁，不高声说话，严禁用器械及动物开，不高声说话，严禁用器械及动物开玩笑。玩笑。3.严格按操作规程使用仪器严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用。仪器发生故障

3、、损坏、丢失时，应立即报告老师，意动用。仪器发生故障、损坏、丢失时，应立即报告老师，凡违反操作规程而损坏仪器者，要追究责任。凡违反操作规程而损坏仪器者，要追究责任。4.实验过程中要大胆、细心，实验过程中要大胆、细心，认真观察实验现象并记录好原始认真观察实验现象并记录好原始数据数据；节约试剂，节约水电。；节约试剂，节约水电。5.实验完毕，洗净所用器材，实验完毕，洗净所用器材，固体舍弃物固体舍弃物(如用过的滤纸、电如用过的滤纸、电泳用凝胶条等泳用凝胶条等)切勿倒入水槽内，以免堵塞。切勿倒入水槽内，以免堵塞。须经指导教师须经指导教师同意，方能离开实验室。同意，方能离开实验室。6.值日生负责实验室卫生

4、值日生负责实验室卫生，倒尽垃圾，关好水、电、门窗，经，倒尽垃圾，关好水、电、门窗，经教师检查后方可离开。教师检查后方可离开。试剂使用试剂使用1.仔细辨认标签，确定所需试剂及浓度。仔细辨认标签，确定所需试剂及浓度。2.吸量管与所需试剂号码务必对准。吸量管与所需试剂号码务必对准。3.用后盖好瓶盖用后盖好瓶盖(切勿张冠李戴切勿张冠李戴)归还原处，以归还原处，以免影响他人使用。免影响他人使用。实验考核实验考核 生化总成绩生化总成绩 理论考试卷面成绩理论考试卷面成绩(60%) 实验成绩实验成绩(30%) 平时成绩平时成绩(10%) 实验成绩实验成绩 平时实验成绩平时实验成绩(60%) 实验考试成绩实验考

5、试成绩(40%)平时实验成绩平时实验成绩 三部分：三部分：考勤考勤(20%) +实验操作实验操作(40%) +实验报告实验报告(40%) 考勤：迟到考勤：迟到 ，扣，扣10分；旷课，本次实验成绩为分；旷课，本次实验成绩为0分分 操作：操作： 不穿白大褂扣不穿白大褂扣10分，分， 不带实验教材扣不带实验教材扣10分。分。 没有预先预习实验扣没有预先预习实验扣10分。分。 实验操作不规范扣实验操作不规范扣5分；分； 过失造成玻璃器皿损坏扣过失造成玻璃器皿损坏扣5分；分； 过失造成仪器损坏扣过失造成仪器损坏扣10分。分。 没有清洗玻璃器皿和还原仪器原状扣没有清洗玻璃器皿和还原仪器原状扣10分。分。

6、没做清洁扣没做清洁扣10分。分。 实验报告的书写实验报告的书写实验报告实验报告 没有没有实验目的实验目的扣扣5分分 没有没有实验原理实验原理扣扣5分分 没有没有实验过程实验过程扣扣10分，分，尽可能用图、表来表示尽可能用图、表来表示 涂改实验数据扣涂改实验数据扣20分。分。 没有没有分析与实验讨论分析与实验讨论（或者思考题）扣（或者思考题）扣15分分 没有报告没有报告临床意义临床意义扣扣5分分 态度态度 （书写、条理、通顺）（书写、条理、通顺） 预习报告（每次实验课前检查）预习报告（每次实验课前检查） 实验目的、原理、试剂、操作步骤和临床意义实验目的、原理、试剂、操作步骤和临床意义本学期实验内

7、容本学期实验内容1 1刻度吸管、可调式移液器的校正与误差分析刻度吸管、可调式移液器的校正与误差分析2 2分光光度法测定物质的浓度分光光度法测定物质的浓度 3 3血清总蛋白和白血清总蛋白和白/ /球比值的测定球比值的测定4 4酶的竞争性抑制酶的竞争性抑制5 5血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离6 6血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳7 7血清碱性磷酸酶活性测定血清碱性磷酸酶活性测定8 8血糖测定血糖测定9 9质粒质粒DNADNA的提取的提取1010DNADNA的琼脂糖凝胶电泳分析的琼脂糖凝胶电泳分析1111血清丙氨酸氨基转移酶血清丙氨酸氨基转移酶(AL

8、T)(ALT)活性测定活性测定1212直接胆红素与总胆红素测定直接胆红素与总胆红素测定1313实验考试实验考试生物化学课程网站 访问路径：访问路径：“三峡大学三峡大学”-“-“求索学堂求索学堂”- -“课程总揽课程总揽”-“-“医学院医学院”-“-“医用生物化医用生物化学学” 网站内有理论课和实验课的教学大纲、网站内有理论课和实验课的教学大纲、pptppt，习题集，考试方法和考试样卷等，同学们习题集，考试方法和考试样卷等，同学们可根据需要下载学习可根据需要下载学习刻度吸管和微量可调式移液器刻度吸管和微量可调式移液器的使用、校正与误差分析的使用、校正与误差分析问题：将问题：将一定量一定量的溶液从

9、一容器转移到另一个的溶液从一容器转移到另一个容器。用什么量具？是否精准？容器。用什么量具？是否精准？一、刻度吸管一、刻度吸管(pipette)的分类和操作方法的分类和操作方法 分类：分类： 10ml, 5ml, 2ml, 1ml, 0.5ml, 0.2ml, 0.1ml（吹（吹?） 移液管移液管吸量管吸量管 刻度吸管的操作方法刻度吸管的操作方法1使用前：使用前： 首先要看首先要看刻度吸管标记刻度吸管标记、刻度标线位置等。、刻度标线位置等。2吸液：吸液： 用右手的拇指和中指捏住刻度吸管的上端，将管的下口插入用右手的拇指和中指捏住刻度吸管的上端，将管的下口插入欲吸取的溶液中；欲吸取的溶液中；左手拿

10、洗耳球，将洗耳球内空气排出左手拿洗耳球，将洗耳球内空气排出，接在，接在管的上口把溶液慢慢吸入至刻度以上，立即用右手的食指按住管的上口把溶液慢慢吸入至刻度以上，立即用右手的食指按住管口。管口。3调节液面：调节液面： 将刻度吸管向上提升离开液面，将刻度吸管向上提升离开液面，略为放松食指（有时可微微略为放松食指（有时可微微转动吸管）转动吸管）使管内溶液慢慢从下口流出，直至溶液的弯月面底使管内溶液慢慢从下口流出，直至溶液的弯月面底部与标线相切为止（看刻度时，应将刻度吸管的刻度与眼睛平部与标线相切为止（看刻度时，应将刻度吸管的刻度与眼睛平行），立即用食指压紧管口。将尖端的液滴靠壁去掉，移出刻行），立即用

11、食指压紧管口。将尖端的液滴靠壁去掉，移出刻度吸管，插入承接溶液的器皿中。度吸管，插入承接溶液的器皿中。4放出溶液：放出溶液： 刻度吸管下端紧靠锥形瓶内壁刻度吸管下端紧靠锥形瓶内壁，稍松开食指，让溶液沿瓶壁，稍松开食指，让溶液沿瓶壁慢慢流下，流完后管尖端接触瓶内壁停留数秒后，再将刻度吸慢慢流下，流完后管尖端接触瓶内壁停留数秒后，再将刻度吸管移去；若刻度吸管上标有管移去；若刻度吸管上标有“吹吹”，则需将管内残余液体吹出。，则需将管内残余液体吹出。 法国法国GILSON 芬兰芬兰Labsystems 日本日本NICHIRYO 美国美国TOMOS 德国德国Brand 德国德国 Eppendorf 美国

12、美国JENCONS 芬兰雷勃芬兰雷勃 Finnpipette 工欲善其事，必先利其器工欲善其事，必先利其器二、微量可调式移液器（二、微量可调式移液器（micropipette,俗称俗称“加加样枪样枪”）的构造和使用方法）的构造和使用方法 微量可调式微量可调式移液器的规格移液器的规格 用途用途 规格：规格： 5 ml移液器移液器(1000-5000ul) 1ml移液器移液器(200-1000) 200ul移液器移液器(20-200) 100ul移液器移液器(20-100ul) 10ul移液器移液器(0.5-10ul) 2 ul移液器移液器(0.1-2ul) 移液器及配套吸嘴（俗称枪头，移液器及配

13、套吸嘴（俗称枪头，tiptip）0.5-20l20-200l100-1000l1.5ml0.2ml2ml 移液器常用的盛接容器移液器常用的盛接容器 酶标板酶标板 离心管离心管微量可调式移液器的构造微量可调式移液器的构造 扭动转轴，即可调整和改变移液器容量扭动转轴，即可调整和改变移液器容量 手指把手手指把手 吸头的排出器吸头的排出器 容量指示容量指示 吸头排出器套筒吸头排出器套筒 吸头圆锥体吸头圆锥体 微量可调式移液器的原理微量可调式移液器的原理 1956年，由德国生理化学研究所的科学家年，由德国生理化学研究所的科学家Schnitger发明发明. 活塞冲程加样活塞冲程加样 活塞冲程活塞冲程(空气

14、垫空气垫)加样器的结构是加样器的结构是空气垫、活塞空气垫、活塞。空气垫的。空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来；活塞在加样器内作弹簧样运动，通过空气垫带动隔开来；活塞在加样器内作弹簧样运动，通过空气垫带动液体进入吸头中。液体进入吸头中。移液器的操作方法移液器的操作方法-1 1. 量程的调节：量程的调节： 千万不要将按钮旋出量程以外（！）千万不要将按钮旋出量程以外（！），否则会卡住内，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。部机械装置而损坏了移液枪。 (a): P-20 Model 6.86 m m l(b): P-20

15、0 Model 132.4 m m l(c): P-1000 Model 262 m m l 移液器的操作方法移液器的操作方法-2 2. 枪头（吸头）的装配枪头（吸头）的装配 将加样枪垂直插入枪头将加样枪垂直插入枪头（pipette tips）中，）中，稍微稍微用力左右微微转动即可使其用力左右微微转动即可使其紧密结合。紧密结合。 注意：注意：不要使劲地在枪不要使劲地在枪头盒子上敲，这样会导致移头盒子上敲，这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。调节旋钮卡住。Exam

16、ple of tip sizes:移液器的操作方法移液器的操作方法-3 3. 吸液吸液 吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至第一停点第一停点，移液器，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下保持竖直状态，将枪头插入液面下23毫米毫米。然后慢慢松开。然后慢慢松开按钮回原点，取出加样枪。按钮回原点，取出加样枪。移液器的操作方法移液器的操作方法-4 4放出溶液放出溶液 将加样枪加入盛接溶液的器皿中，将按钮按至第一停点排将加样枪加入盛接溶液的器皿中，将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点（终点）第二停点（终点）吹出残余吹出残余的

17、液体。最后松开按钮。的液体。最后松开按钮。 (a) Start Dispensing (b) 1st Stop = Dispense(c) 2nd Stop = Expel移液器的操作方法移液器的操作方法-5 5. 弃枪头弃枪头 按下加样枪上的枪头推出杆，将枪头打入指定位置。按下加样枪上的枪头推出杆，将枪头打入指定位置。Press ejector button to discard tip.移液器的完整操作步骤移液器的完整操作步骤1. 量程的调节：量程的调节： 千万不要将按钮旋出量程（！）千万不要将按钮旋出量程（！），否则会卡住内部机械装置而损，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。坏了移液枪

18、。2. 枪头（吸头）的装配枪头（吸头）的装配 将加样枪垂直插入枪头（将加样枪垂直插入枪头（pipette tips）中，）中，稍微用力左右微微转动即稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。可使其紧密结合。不要使劲地在枪头盒子上敲，这样会导致移液枪的内不要使劲地在枪头盒子上敲，这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。度调节旋钮卡住。3. 吸液吸液 吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至第一停点第一停点，移液器保持竖直状，移液器保持竖直状态，将枪头插入

19、液面下态，将枪头插入液面下23毫米。然后慢慢松开按钮回原点，取出加样毫米。然后慢慢松开按钮回原点，取出加样枪。枪。4放出溶液放出溶液 将加样枪加入盛接溶液的器皿中，将按钮按至第一停点排出液体，稍将加样枪加入盛接溶液的器皿中，将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至停片刻继续按按钮至第二停点（终点）第二停点（终点）吹出残余的液体。最后松开按钮。吹出残余的液体。最后松开按钮。5. 弃枪头弃枪头 按下加样枪上的枪头推出杆，将枪头打入指定位置。按下加样枪上的枪头推出杆，将枪头打入指定位置。注意事项注意事项 移液器的正确放置移液器的正确放置 当移液器枪头里有液体时，当移液器枪头里有液体时，切勿将

20、移液器水平放置或倒切勿将移液器水平放置或倒置，置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 维护保养时的注意事项维护保养时的注意事项（1）如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧；松弛状态以保护弹簧；（2）最好定期清洗移液枪，最好定期清洗移液枪，可以用肥皂水或可以用肥皂水或60 的异丙醇，再用的异丙醇，再用蒸馏水清洗，自然晾干。蒸馏水清洗，自然晾干。（3） 校准是可以在校准是可以在20-25度环境中，通过重复几次秤量蒸馏水的方度环境中，通过重复几次秤量蒸馏水的方法来进行。法来进行。三、实验结果的数

21、据处理三、实验结果的数据处理 （ 概念：概念： 准确度准确度( accuracy)：绝对误差、相对误差：绝对误差、相对误差 误差误差（error）：系统误差、偶然误差）：系统误差、偶然误差 精确度精确度（precision) 偏差偏差（deviation）：绝对偏差、相对偏差、标）：绝对偏差、相对偏差、标准偏差准偏差（一）准确度和误差（一）准确度和误差 （Accuracy and error）1.定义定义 准确度准确度（Accuracy ）：）： 分析结果与真值相接近的程度分析结果与真值相接近的程度 准确度的高低用误差表示准确度的高低用误差表示 误误 差差（error）：测定结果测定结果（X）

22、与与真实值真实值（XT）之间的之间的差值差值 系统误差影响准确度的高低系统误差影响准确度的高低2.表示方法表示方法: 绝对误差和相对误差绝对误差和相对误差 绝对误差绝对误差（Absolute error） ：E=X-XT 相对误差相对误差（Relative error）:100%rTEEX系统误差系统误差 由于分析过程中由于分析过程中某些固定的原因某些固定的原因所造成的误差所造成的误差. 1.性质性质（1）单向性、重复性单向性、重复性 （2）与测定次数无关）与测定次数无关 （3）可以校正，大小、正负可以测定）可以校正，大小、正负可以测定 2.产生的原因产生的原因 （1）方法误差）方法误差 （2

23、）仪器和试剂误差）仪器和试剂误差 （3）操作误差）操作误差 （4）主观误差）主观误差 3.校正校正： 改变方法，校正仪器，采用高等级试剂等改变方法，校正仪器，采用高等级试剂等偶然误差偶然误差 1 1、性质性质：（1 1）大小可变）大小可变 （2 2）方向不定，有时正、有时负。）方向不定，有时正、有时负。 （3 3）只能减小，不能消除。）只能减小，不能消除。 2 2、产生的原因产生的原因： 温度、气压、湿度、仪器性能的微小改变、人为的终点温度、气压、湿度、仪器性能的微小改变、人为的终点判断的变化等。判断的变化等。 3 3、校正校正：不能消除，只有不能消除，只有增加平行实验次数增加平行实验次数（二

24、）精密度与偏差（二）精密度与偏差 ( (precision and deviation) 1.定义定义: 精密度精密度: : 在相同条件下在相同条件下, ,各次分析结果相互间接近的各次分析结果相互间接近的程度程度. .精密度的高低用偏差表示精密度的高低用偏差表示. . 偏差偏差: : 测定结果测定结果（X X）与与平均值平均值（ ）之间的差值之间的差值偏差小偏差小, ,表示数据集中表示数据集中, ,精密度高精密度高; ;反之反之, ,数据分散数据分散, ,精密度低精密度低. .偶然误差影响分析结果的精密度偶然误差影响分析结果的精密度. . X（二）精密度与偏差（二）精密度与偏差 ( (prec

25、ision and deviation)2. 2.表示方法表示方法: : (1) (1)绝对偏差和相对偏差绝对偏差和相对偏差: : 绝对偏差绝对偏差(absolute deviation, di) ： di=单个测量值单个测量值(Xi)平均值平均值( ) 相对偏差相对偏差(relative deviation, dr) ： Mean: X= nxxxn 21X100%irddX (2)标准偏差标准偏差(standard deviation，SD or S) 相对标准偏差相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)，又称又称变异系数变异系数(Coefficien

26、t of Variation ,CV) %100XSCVBoth accurate and precisePrecise but not accurateNeither accurate nor precise 体积体积准确度准确度（平均误差）（平均误差）精确度精确度（重现性）（重现性）ul误差（误差（ul）误差（）误差（）S.D.（ul）R.S.D.（ul）P2020.15.00.031.550.12.00.040.80100.11.00.050.50200.21.00.060.30P100200.351.80.100.5500.400.80.120.241000.800.80.150.15

27、P200500.51.00.200.401000.80.80.250.252001.60.80.300.15P100020031.50.601.3050040.81.00.20100080.81.50.15移液器的准确度与精确度移液器的准确度与精确度微量可调式移液器系统误差的校正微量可调式移液器系统误差的校正 校准方法校准方法 ？ 必须考虑的环境与仪器的影响因素？必须考虑的环境与仪器的影响因素？ 温度、湿度、天平的精度、水的纯度等温度、湿度、天平的精度、水的纯度等 如何消除偶然误差的影响？如何消除偶然误差的影响？电子天平电子天平用电磁力平衡被称物体重力用电磁力平衡被称物体重力的天平称之为电的天

28、平称之为电子天平。子天平。它是它是传感技术、模拟电子技术、数字电子技传感技术、模拟电子技术、数字电子技术和微处理器技术术和微处理器技术发展的综合产物，具有自发展的综合产物，具有自动校准、自动显示、去皮重、自动数据输出、动校准、自动显示、去皮重、自动数据输出、自动故障寻迹、超载保护等多种功能。自动故障寻迹、超载保护等多种功能。 电子天平的心脏电子天平的心脏- -重力电磁传感器簧片重力电磁传感器簧片，细而，细而薄薄, , 极易受损，使用中应特别注意保护极易受损，使用中应特别注意保护, , 不不要向天平上加载重量超过其称量范围的物体要向天平上加载重量超过其称量范围的物体（注意称量范围）（注意称量范围

29、）电子天平电子天平对环境高度敏感对环境高度敏感, , 使用时应小心操使用时应小心操作作, , 安装台面应无明显振动；注意要安装台面应无明显振动；注意要调整底调整底角螺丝使水平指示器的气泡居中角螺丝使水平指示器的气泡居中（调水平调水平） 电子天平的使用方法：电子天平的使用方法： 操作方法操作方法开机开机去皮去皮称量：记录数据，回称量：记录数据，回“零零” 注意注意水平放置水平放置称量范围称量范围精度精度The density of water at different temperatureT(0C)Density(g/cm3)T(0C)Density(g/cm3)T(0C)Density(g/

30、cm3)00.999 868120.999 525240.997 32610.999 927130.999 404250.997 07420.999 968140.999 271260.996 81330.999 992150.999 126270.996 54241.000 000160.998 970280.996 26250.999 992170.998 802290.995 97360.999 968180.998 623300.995 67670.999 929190.998 433310.995 36980.999 876200.998 232320.995 05490.999 8

31、69210.998 021330.994 731100.999 728220.997 799340.994 399110.999 632230.997 567350.994 059 校准工具校准工具实验步骤实验步骤 一、一、刻度吸管的操作刻度吸管的操作： 选择选择5mL、0.5mL的刻度吸管，按照教师要求，把的刻度吸管，按照教师要求，把相应体积的相应体积的ddH2O移取到烧杯中，称重。重复该移取到烧杯中，称重。重复该步骤步骤3次。次。二、二、微量可调式移液器的操作微量可调式移液器的操作：选择选择1000 m ml、 200 m ml的微量可调式移液器，按照教的微量可调式移液器，按照教师要求，把

32、相应体积的师要求，把相应体积的ddH2O移取到烧杯中，称移取到烧杯中，称重。重复该步骤重。重复该步骤3次。次。实验结果实验结果刻度吸管刻度吸管真值真值( (mlml) )3.8 (or 0.42)学学 号号次数次数1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112测量测量值值(g)(g)体积体积( (mlml) )平均平均值值(ml)(ml)SDSDCVCV校正校正值值微量可调式移液器微量可调式移液器真值真值( ( l l) )550 (or 160 )学学 号号次数次数1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112测量测量值值(g)(g)体积体积( (l ) )平均平均值值(ml)(ml)S

33、DSDCVCV校正校正值值思考题思考题 你所使用的移液管和加样枪的准确度和精你所使用的移液管和加样枪的准确度和精密度如何？密度如何？ 为减小误差，在操作中要注意哪些方面？为减小误差，在操作中要注意哪些方面？下次实验下次实验 分光光度法测定物质的浓度分光光度法测定物质的浓度（实验指导，（实验指导，p11-17，p121） 预习：预习：吸光光度法原理，定量分析方法，吸光光度法原理，定量分析方法， 721E分光光度计的构造与操作方法分光光度计的构造与操作方法 书写预习报告，书写预习报告，包括实验目的、原理、试剂和包括实验目的、原理、试剂和操作步骤等，下次实验课前检查操作步骤等，下次实验课前检查 组长安排本次做清洁的同学组长安排本次做清洁的同学