流式细胞术检测凋亡的方法

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1、流式检测细胞凋亡几种方法的比较2005年10月合肥多色流式分析试剂典范凋亡简介细胞膜事件线粒体事件Caspase 事件多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范细胞核事件 检测中面临的问题多色流式分析试剂典范多色流式分析试剂典范凋亡与坏死NECROSISChromaiin clumpingSwollen organelles Flocculent mitochondriaDisiniegnuionRelease of intracellular contentsInflammationMikl convohiiion ('hromatin compaction and segregati

2、onCondensation of cjtoplasniNuclear fnigmcntalion BlcbbingApoptotic bodies凋亡的途径外源性途径TNFhxFAS内源性途径TNF-(i 1LtzfriChemicals orirradiationcPFADDActivation of % effector caspases (caspase -3z-6,-7)凋亡启动凋亡早期凋亡中期凋亡晚期凋亡启动核染色质凝缩H 细胞膜PS外翻核碎片形成细胞内酸化脱水致细胞皱缩细胞内Ca2+动员DNA切割成低分子量片參线粒体膜电位丧失凋亡小体形成Ca2 +Normal CellCytwl

3、asrnic - . -« .,. . t.Membrane 1 II1J1J1LL1I II I扌田胞膜事件Annexin V Annexin V*Annexin V BindingAPOPTOSIS - -Apoptotic Cell丫 Phosphatidyl serine正常细胞(Normal Cell):凋亡细胞(Apoptotic Cell):膜内磷脂酰丝氨酸(PS)膜内磷脂酰丝氨酸(PS)膜外-磷脂酰胆碱、鞘磷脂膜外磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PS扌田胞膜事件Annexin VBJ坏死细胞独立的核膜破损严重的细胞 晚期凋亡细胞早期细胞: 01O11021O3Annexin-V

4、FITC检测方法：收集细胞并重悬于Binding Buffer（结合液）中加荧光标记的Annexin V和PI室温、避光孵育5分钟流式细胞仪检测结果扌田胞膜事件Annexin V检测特点:简便、快速、准确区分活细胞、:注意事项:细胞制备（如贴壁细胞）或储存时细胞咚璽嬰会豎:ps跨膜分布的改变，造成遐興岂 巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，Armexin V检测也会阳性。多色流式分析试剂典范浮粒体膜电位(¥.)的崩還发生在凋亡的早期r可能与细AIF的释癡关在存在活化Caspase的细胞中持续 一段时间后恢复正常controlCPT103 103 0U Osajon-J 6ue0Gree

5、 n fluorescence淨粒体膜电位(¥)的崩溃染料 C-1(5,55 6,6'tetrachloro-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)亲脂性阳离子荧光染料 正常细胞一线粒体内多聚体红色荧光(Ex:488nm, Em:580/590nm)凋亡细胞一细胞质内单体屋豪光(Ex:488nm, Em:510/527nm)喜树碱(CPT)诱导H60细胞凋亡，3小时 后用JC1检测线粒体膜电位的改变。可见， 凋亡细胞红色荧光降低。"八、一 .夕 l E检测方法a.收集细胞于MitoC

6、apture溶液（含JC1冲 37吃孵育1520分钟离心、去上清重悬于孵育缓冲液中检测特点:注意事项：A最近研究发现，线粒体膜电位的崩 溃在有些细胞中并不是细胞色素C和AIF释放的必需条件。流式分析FL1：凋亡细胞；FL2：正常细胞产品名称产品编号规格MitoCapture Apoptosis Detection KitK250-25K250-10025 tests100 tests生产商BiovisionBiovision联科生物UninducedInduced细胞凋亡时活化Caspase-3的检测。Jurkat细胞无诱导(A)或用喜树碱诱导6h后，使用CaspGLOW FITC Caspa

7、se- 3 Staining Kit(产品編号：K183-100)检测活化的Caspase-30活化Caspase的检测1.荧光标记的Caspase抑制性底物 :荧光标记的Caspase抑制性底物膜通透性高；不可逆结合FITC(Rhodamine)-VAD-FMK(通用)FITC(Rhodamine)-VDVAD-FMK(Caspase-2)FITC(Rhodamine)-DEVD-FMK(Caspase-3)FITC(Rhodamine)-IETD-FMK(Caspase-8)FITC(Rhodamine)-LEHD-FMK(Caspase-9)检测原理：荧光标记的Caspase抑制性底物被

8、凋亡细胞 摄取并结合，而正常细胞不能结合该底物。因此洗涤后，凋亡细胞可检测到荧光，正常细胞则不能。活化Caspase的检测 U三1-荧光标记的Caspase抑制性底物K 7-*-检测方法：诱导细胞凋亡重悬细胞、流式分析FITC:FL1； Rhodamine:FL2检测特点：简单；灵敏A快速（0.5-1小时）活化Caspase的检测1-荧光标记的Caspase抑制性底物- * - !' : ' ' * : : : - ' ； ' - : : “ :注意事项：荧光标记的Caspase抑制性底物的特异性不够高，在凋亡细胞中可能也会与Caspase 以外的蛋白结

9、合。适用于区分凋亡和坏死的细胞。产品名称规格生产商CaspGLOWGreen(Red) Multi-Caspase Staning Kit25 tests/100testsBiovisi onCaspGLOWGreen(Red) Caspase-2 Staning Kit25 tests/WOtestsBiovisi onCaspGLOWGreen(Red) Caspase-3 Staning Kit25 tests/lOOtestsBiovisi onCaspGLOWGreen(Red) Caspase-8 Staning Kit25 tests/lOOtestsBiovisi onCasp

10、GLOWGreen(Red) Caspase-9 Staning Kit25 tests/lOOtestsBiovisi on活化Caspase的检测2. Caspase底物 D2R (aspartyl)2-rhodamine 110,二门冬氨酰-罗丹明 110 -Caspase通用底物»膜通透性高>d2r为非荧光物质>D2R被活化的Caspase剪切后，释放出Rhodamine110,发出绿色荧光Controlsrnoo 一0)0+Camptotheci nCaspSCREEN凋亡检测试剂盒对凋亡的分析。喜树碱(Campothecin)(2uM)诱导Jurkat细胞4小

11、时，收集细胞并用 CaspSCREEN Caspase Screening Kit(产品编号：K200-100)染 色，流式分析。活化Caspase的检测2. Caspase底物检测特点:检测方法：收集细胞并重悬于D2R Incubation Buffer（孵育液）中A高度敏感快速（20分钟）特异性高产品名称产品编号规格生产商CaspSCREEN Caspase Screening KitK200-2525 testsBiovisi onK200-100100 testsBiovisi on联科生物LABORATORIES多色流式分析试剂典范严二倍体峰（凋亡峰）染料：PI（碘化丙唳）marke

12、rsM凋亡细胞比例；细胞周期分布；凋亡发生的时相严二倍体峰（凋亡峰）"狂意事项：A固定：乙醇，不能用多聚甲醛。联科公司即将引进小片段DNA高效抽提试剂盒。1400 laoo 10QC0 3S 64961E8对照（未诱导凋亡）DNA Content严二倍体峰（凋亡峰）:注意事项：试剂的选择一不能用抽提细胞核的试剂:BD公司的Cycletest Plus DNA Reagent Kit 佣去污剂Spermine tetrahydrochloride破膜）Beckman Coulter公司的DNA-Prep Reagent System （用DNA-Prep LPR破膜）p凋亡细胞的核碎片

13、被误认为多个凋亡细胞；|进行有丝分裂的标本破膜后释放出的多个染色体或其聚集体被误认为多个凋亡细胞；细胞辐射等造成的微核体也可被误认为多个凋亡细胞。A若凋亡发生在G2，M或S期晚期，DNA含量可能会等同于Go期或S期早期，导致检 测失败；现有DNA分析软件（Modfit/MultiCycle）的缺陷。TUNEL;4（末端脱氧核昔酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法）检测原理:注意事项:BrdUTP的掺入率显著高于dUTP,因此检测灵敏度高而但经济。TUNEL;4(末端脱氧核昔酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)pup一 s<N010°0200400600020040060002

14、004006000302DNA content用树碱(CPT)诱导HL60细胞凋亡.0. 120和150分钟时用TUNEL(BrdUTP)/PI双染法检测DNA断裂，同时分析细胞周期。可见凋亡随着诱导时 间的增加而增多，且可知凋亡发生的时相。-检测方法：（固定细胞/组织固宗：笫聚甲酵（交联型）僦细胞TUNEL/PI 双染：Aoo-BrdU Kit区分凋亡和非凋亡细胞Apo-DIRECT Kit |同时分析细期TdT/BrdU标记细胞TdT/FITC-dUTP标记细胞*洗细胞Anti-BrdU-FITC 染细胞*Pl/Rnase 处理洗细胞1r洗细胞Pl/Rnase 处理洗细胞v流式分析流式分析

15、TUNEL;4（末端脱氧核昔酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法）:注意事项：成纤维细胞、上皮细胞凋亡时并不发生核小体间DNA的断裂（DNA仅断裂为50- 300kb的大片段即终止），TUNEL法的灵敏度无法检测出产品名称产品编号规格生产商ApoBrdll DNA Fragmentation Assay KitK401-6060 testsBiovisi onApoDirect DNA Fragmentation Assay KitK401-6060 testsBiovisi on联科生物LABORATORIES多色流式分析试剂典范1.阳性和阴性质控:产生误差的原因:A非典型性凋亡A操作不当T

16、UNEL实验时TdT酶因保存不当而失活；染色时出现错误。解决方法:A设立阳性质控A设立阴性质控自己制备质控细胞或由公司提供（如TUNEL法试剂盒内包含了阳性和阴性质控细胞）2.凋亡假阳性:产生原因:APS的外翻使得凋亡细胞和凋亡小体很容易被邻近的细胞所吸附并被吞噬A吞噬细胞并非仅为专职的呑噬细胞（如单核和粒细胞），成纤维细胞或上皮细胞也具呑噬作用。尤其是实体瘤，常可见在凋亡细胞周围的肿瘤和非肿瘤细胞中有含有凋亡小体的吞噬体。A邻近细胞吞噬凋亡细胞后的残留物中即包含了变化的细胞膜、断裂DNA等凋亡特征物。A即使很轻微的处理，如胰酶消化、机械振荡、细胞刮取等，均会造成PS的外翻。例证：A化疗后患者

17、骨髓中的非凋亡细胞，主要是单核和巨噬细胞中可发现大量的凋亡小体，且TUNEL法检测时强阳性。Bedner E., Li X., et al. 1999. Cytometry 29:191-1963区分凋亡、坏死和凋亡的“坏死期"：产生原因:A晚期凋亡与坏死相似细胞膜破裂，用PI排染和Annexin V结合实验无法区分。»胰酶消化时间过长、机械损伤（如细胞刮取、肿瘤细胞分离或反复离心等）、电穿孔或某些药物处理时，细胞膜的通透性和对称性均会改变。3.样本制备过程中凋亡细胞的选择性丢失贴壁培养细胞的分离凋亡早期，细胞即脱离培养瓶表面并悬浮在培养液中。因此去除培养液，然后加胰酶 或

18、EDTA消化的方法不可避免的会失去很多凋亡细胞。将培养液和消化下来的细胞合在一起胰酶消化本身就倾向于破坏细胞膜已破损的晚期凋亡和坏死细胞，导致丢失。密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll或Percoll)选择性丢失即将死亡和死亡细胞，因凋亡早期细胞脱 水，核和胞浆皱缩，其密度高于非凋亡的细胞。反复离心和机械振荡离心时，某些细胞可静电吸附在管壁上。如白细胞中的单核和粒细胞在反复离心时丢 失，而淋巴细胞仍留在悬液中。加入过量的载体细胞，如鸡红细胞等凋亡细胞，尤其是晚期凋亡细胞很脆弱，在反复离心或振荡时易碎。加入血清或白蛋白、缩短离心时间、降低离心转速联科生物 www.antibody.c n - V < - .in '*s <.v.* *r *.<. *,*.<».*? 十丄 、.= *«*.v. fww.aoto