核酸适配体亲和柱净化

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1、核酸适配体亲和柱净化赵颖王楠高华龙郭子轩陆安祥郭晓军卢静华栾云霞摘要以特异性的核酸适配体作为识别元件，制备了黄曲霉毒素B1AFB1的适配体亲和柱AAC，用于AFB1的特异性识别和富集。对AAC的载样液中有机溶剂含量、载样液的体积和淋洗体积等条件进行了优化。此AAC吸附AFB1的柱容量到达334.618.2ng，且AAC可重复使用20次。莲子样品经AAC净化富集后，用高效液相色谱-光化学衍生荧光法检测，外标法定量，AFB1检出限到达0.05ng/mL，回收率为91.8%108.6%。本方法为食品、农产品和中药等复杂基质中痕量毒素的提取富集和分析提供了新的参考，具有良好的应用前景。关键词适配体亲和

2、柱;黄曲霉毒素B1;固相萃取;N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化的琼脂糖;莲子1引言黄曲霉毒素B1AflatoxinB1，AFB1是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级产物【1】，毒性极强，被世界卫生组织的癌症研究机构划分为I类致癌物【2】。AFB1具有致突变性、致畸性和致癌性35，可在采摘前、收获后储存、运输和食用等不同阶段对农产品、食品及中药材等产生污染【6】，威胁人类健康。很多国家对AFB1都有严格的限量标准，欧盟规定中药材植物药中AFB1的限量标准为2g/kg【1】，我国规定中药材中AFB1的限量标准为5g/kg8。因此，为了及时发现污染，防止AFB1进入食物链，并尽量减少国际交易中贸易壁垒带来

3、的损失，研究人员不断寻求快速、可靠地定量检测黄曲霉毒素的方法。莲子是水生草本植物莲的种子，富含蛋白质、维生素和矿物质，可食药两用7，8。然而，莲子极易被黄曲霉毒素污染9，特别在中国南方莲子主产区，其湿润的气候条件适宜AFB1的产生，对消费者的健康造成极大威胁。因此，有必要对莲子中AFB1的污染状况进行监测和评价10，建立莲子中黄曲霉毒素的有效分析方法，而对莲子样品中AFB1进行提取富集是提高其检测灵敏度的关键。目前，常用的AFB1定性与定量检测方法有高效液相色谱法High-performanceliquidchromatography，HPLC1114、高效液相色谱-串联质谱法HPLC-tan

4、demmassspectrometry，HPLC-MS15、酶联免疫吸附法Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA16，17及薄层色谱法Thin-layerchromatography，TLC18，19等，广泛用于谷物、豆类、坚果、调味品、婴幼儿配方食品和辅助食品中AFB1的测定2023。免疫亲和柱Immuneaffinitycolumn，IAC是检测AFB1时广泛使用的前处理方法，已被我国国标、行业标准、中国药典、国际标准AssociationofOfficialAnalyticalChemists，AOAC等收录。然而，IAC以抗体为识别元件，而抗体生产依

5、赖动物，存在批次差异大、本钱高、对温度、pH值以及盐浓度依赖性强、不可逆变性等缺点24，25，导致IAC存在价格昂贵、难以重复使用和检测本钱高等问题。适配体是一类亲和力高和特异性强的单链核苷酸分子，具有可选择性识别特定靶标的能力。作为“化学抗体，核酸适配体具有良好的热稳定性和化学稳定性、易于修饰、可体外制备和合本钱钱低等天然优势26。因此，制备适配体亲和柱Aptameraffinitycolumn，AAC用于真菌毒素的净化富集，具有良好的应用前景。目前，以适配体为识别元件的親和柱已被用于血液、啤酒和花生中小分子目标物的前处理，如可卡因、赭曲霉毒素AOchratoxin，OTA等27，28，23

6、。然而，用于富集净化中药材中AFB1的AAC还未见报道。本研究以无毒的N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化的琼脂糖N-Hydroxysuccinimide，NHS-sepharose替代传统亲和柱中使用的高毒性溴化氰活化的琼脂糖作为固相载体23，29，30，制备了AFB1-AAC。对AFB1-AAC的柱容量、准确性、重复性和特异性等性能进行评价，并与AFB1-IAC的净化效果进行比较。将优化后的AAC用于莲子样品中AFB1的净化富集，并利用高效液相色谱-光化学衍生荧光检测法HPLC-PCD-FCD进行分析检测。2实验方法2.1仪器与试剂1260系列高效液相色谱-荧光检测器美国安捷伦公司;0.2m针筒式滤

7、膜过滤器天津津腾实验设备;玻璃纤维滤纸110mm，1.5m，青岛普瑞邦生物工程;DHM200涡旋振荡器宁波洛尚智能科技;FE28pH计上海梅特勒-托利多仪器;GmbH台式冷冻离心机德国Sigma离心机;光化学衍生器北京华安麦科生物技术;固相萃取柱管1mL带凸缘柱管，天津艾杰尔飞诺美公司;黄曲霉毒素B1免疫亲和柱康源泰博生物科技。5-氨基修饰的AFB1适配体5-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTTCGCCTTCGCTAGGCCCACA-3由上海生工生物技术合成。NHS活化的琼脂糖溶液4B，90mol/L和Tris-HClSigma-Aldrich公司;AFB1、黄曲霉毒素B2Afl

8、atoxinB2，AFB2、黄曲霉毒素G1AflatoxinG1，AFG1、黄曲霉毒素G2AflatoxinG2，AFG2标准溶液美国Romer公司;甲醇和乙腈色谱纯，美国ThermoFisherScientific公司。其它试剂均为国产分析纯试剂。实验用水为Milli-Q系统美国Millipore公司制备的超纯水。反应缓冲液150mmol/LNaCl，pH6.0;封闭缓冲液150mmol/LNaCl和0.2%BSA，pH6.0;清洗缓冲液50mmol/LTrisHCl和150mmol/LNaCl，pH6.0;结合缓冲液10mmol/LTris-HCl、120mmol/LNaCl、5mmol/

9、LKCl、1mmol/LMgCl2，pH7.5，均于4保存。AFB1标准品溶液5ngAFB1标准品用结合缓冲液稀释并定容至30mLHPLC-PCD-FLD分析条件：色谱柱VenusilMPC18柱250mm4.6mm，5m，美国安捷伦公司;进样量40L;柱温箱为35;检测器为荧光检测器，激发波长360nm，发射波长440nm;为流动相为甲醇-水5545，V/V，以0.8mL/min流速进行等度洗脱23。2.2亲和吸附剂的制备通过氨基与NHS共价偶联，将适配体固定在NHS活化的琼脂糖外表。首先，将氨基修饰的适配体溶于反应缓冲液，在95加热5min，室温下静置30min，使适配体形成所需的构象。取

10、300LNHS活化的琼脂糖，用1mL10%HCl洗涤2次。将适配体加到NHS活化的琼脂糖孵育2h，在室温下振荡。离心，去除上清液，参加封闭缓冲液，在室温下振荡2h。将悬浮液装入1mL固相萃取柱管中，用5mL清洗缓冲液清洗，最后用5mL结合缓冲液将适配体亲和柱活化，于4保存。2.3AFB1-AAC的操作流程将AFB1标准品溶液加样至AAC，依次经过淋洗和洗脱，用HPLC检测洗脱液中AFB1，计算回收率，以筛选AAC的富集净化的最正确条件。首先，用5mL结合缓冲液将AAC活化;然后，将30mLAFB1标准品溶液上样至AAC中，以1mL结合缓冲液淋洗，1mL甲醇洗脱。洗脱液于40氮吹至近干，用1mL

11、液相色谱流动相复溶，过0.2m滤膜，用HPLC-PCD-FLD检测。AFB1-AAC的再生：使用前，AAC用5mL结合缓冲液活化，经过富集净化过程后，用5mL结合缓冲液活化，进行再生，4保存，以备下一次使用。2.4样品处理准确称取5g莲子样品精确至0.01g和1gNaCl，参加25mL甲醇-水7030，V/V进行提取，使用涡旋振荡器，以2500r/min振荡20min后，10000r/min离心10min。每管中取5mL上清液，稀释至50mL，用玻璃纤维滤纸过滤，取续滤液，备用。以5mL结合缓冲液活化AAC后，准确移取续滤液30mL上样至AAC，1mL结合缓冲液淋洗，将23mL空气通过AAC，

12、1mL甲醇洗脱，收集的洗脱液在40氮吹至近干，用1mL液相流动相复溶，过0.2m滤膜，转入进样瓶后，用HPLC-PCD-FLD检测。2.5AFB1-AAC和AFB1-IAC的比较莲子加标样品0.5、5和50g/kg分别通过AFB1-AAC和AFB1IAC进行净化和富集。根据AFB1-IAC的使用说明，取10mL上清液，用20mL水稀释后，用玻璃纤维滤纸过滤。将15mL稀释液上样至IAC，10mL结合缓冲液淋洗，通入23mL空气，1mL甲醇洗脱，洗脱液经40氮吹至近干，用1mL液相流动相复溶，过0.2m膜。最后，分别用HPLC-PCD-FLD检测，计算回收率，比较IAC和AAC对AFB1的识别与

13、捕获能力。3结果与讨论3.1AFB1-AAC的富集原理将氨基修饰的AFB1适配体共价偶联至NHS活化的琼脂糖上，制备AAC31。蓮子样品经过提取、过滤、稀释后，过柱。AFB1与适配体特异性结合，未被结合的干扰物质被淋洗出来，flowofAFB1-apatmeraffinitycolumnAAC最后用甲醇洗脱，洗脱液用HPLC-PCD-FLD检测，AAC净化的步骤如图1所示，包括亲和柱的活化、样品的载入载样过程、干扰物的淋洗和靶标的洗脱。3.2AFB1-AAC应用条件的优化载样中有机溶剂浓度影响适配体结合活性，而AFB1通常是用有机溶剂从样品中提取的，如本研究采用甲醇-水7030，V/V，高浓度

14、的甲醇会破坏适配体的结构。因此，需考察载样过程中适配体亲和柱对甲醇的最大耐受度。5ngAFB1用含有不同浓度的甲醇1%、5%、10%、25%、40%、55%和70%V/V的结合缓冲液稀释到30mL，分别全部载样到适配体亲和柱中，用结合缓冲液淋洗，1mL甲醇洗脱。由图2可见，随着甲醇浓度增加，AFB1的回收率逐渐下降。载样液中甲醇浓度小于10%时，回收率接近100%，这与本研究组之前的研究结果一致12，23，说明甲醇浓度应控制在10%以下。因此，本研究采用10倍稀释法稀释提取液，以降低有机试剂的浓度和基质效应。进一步考察AAC捕获AFB1的最大载样体积。将AFB15ng标准品溶液分别用结合缓冲液

15、稀释至1、2、5、10、20、30、50和65mL12，23。，将稀释后的溶液分别上样到AAC中，以相同的淋洗和洗脱步骤处理，结果如图3A所示，当载样体积大于30mL时，回收率低于70%。因此，在实际样品分析中，选择载样体积为30mL，为文献23报道的AAC载样体积的6倍。在本课题组之前的报道12中，磁珠需在液相体系中进行实验，为开放体系;而本研究采用的AAC是在固相体系中进行净化富集，属于封闭体系，因此，AAC更适合富集纯化毒性靶标。另外，本研究的偶联方式与文献12，23有所不同。链霉亲和素和生物素非共价偶联的方式，存在载样体积小、不可重复使用等缺点12;溴化氢活化的琼脂糖和氨基修饰的适配体

16、的偶联反应需过夜反应，所需实验时间较长23;而本研究中适配体和固相载体的偶联时间仅需2h。对于痕量AFB1的检测，载样体积的增加使更多的AFB1被适配体识别捕获，经AAC富集净化后的洗脱液中目标物含量更高，有利于提高HPLC-PCD-FLD的检测灵敏度。21SetlemK，MondalB，RamlalS，KingstonJ.Front.Microbiol.，2021，7：190922ZHANGHong-Bo，JINZhi-Min，GAOZhi-Hui，ZHENGYu-Shan.FoodSafetyGuide，2021，1：70-73張宏博，靳志敏，高智慧，郑玉山.食品平安导刊，2021，1：7

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