质粒DNA提取原理步骤凝胶电泳分析及其应用

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1、 质粒质粒DNADNA提取的原理、操作步骤、提取的原理、操作步骤、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用质粒质粒DNADNA的提取的提取独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多质粒（质粒（lasmidlasmid）l 质粒能自主复制，在细菌中不断复制自身。在细胞质粒能自主复制，在细菌中不断复制自身。在细胞内的复制分成两种类型：一种是低拷贝数的质粒，内的复制分成两种类型：一种是低拷贝数的质粒，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，这种类型称每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，这种类型称为为“严谨型严谨型

2、”复制的质粒复制的质粒；另一种是高拷贝数的质；另一种是高拷贝数的质粒，拷贝数一般在粒，拷贝数一般在2020个以上，这种类型称为个以上，这种类型称为“松弛松弛型型”复制的质粒复制的质粒l 质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（如抗氨苄青质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（如抗氨苄青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等，霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性 碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 质粒DNA释放法 酸酚法等 选择哪一种方法主要取决以下几个因素： 质粒的大小 大肠杆菌菌株 裂解后用于纯化的技术和实

3、验要求 分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA分离分离质粒质粒收集收集裂解裂解细菌细菌质粒质粒扩增扩增1 1、碱裂解法、碱裂解法基于染色体基于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性与复性的差异；的变性与复性的差异；高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；操作步骤 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到510ml液体培养基中，37 C震荡培养1216h，到细菌浓度远超过对数生长期时收获菌种。 吸

4、取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4 C 12000r/min室温离心1min 小心吸去培养液，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽(细菌沉淀尽可能干燥) 将细菌沉淀悬浮于100L溶液中，充分混匀(涡旋振荡)，室温放置10min 加入200L溶液（新鲜配制），盖紧盖子，快速温和颠倒离心管数次,以混匀内容物 (千万不要振荡),冰浴3分钟 加入150L溶液（冰上预冷），盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置35min 12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中 向上清中加入酚：氯仿：异戊醇（25：24:1），反复混匀，12000r/min离心2min，将上清转至另一离心管中 向

5、上清中加入，混匀后，室温放置2min， 12000r/min 离心1min. 倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心30s，倒去上清液，空气干燥10min 加40LTE（含40g/mL胰RNA酶），使质粒DNA完全溶解，20保存菌体老化菌体老化碱裂解不充分碱裂解不充分菌体中无质粒菌体中无质粒溶液使用不当溶液使用不当请涂布平板培养后，重新挑选请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的可减少菌体用量或增加溶液的用量用量不要频繁转接，每次接种时应不要频繁转接，每次接种时应接种单菌

6、落。检查抗生素使用接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。浓度是否正确。溶液溶液在温度较低时可能出现在温度较低时可能出现浑浊，置于浑浊，置于3737保温片刻直至保温片刻直至溶解为清亮的溶液。溶解为清亮的溶液。q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 原因原因对对策策混有蛋白混有蛋白混有混有RNARNA混有基因组混有基因组DNADNA不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质加入加入RNaseARNaseA室温放置一段时间室温放置一段时间加入溶液加入溶液II II 和和

7、IIIIII后后防止剧烈防止剧烈振荡，可能把基因组振荡，可能把基因组DNADNA剪切剪切成碎片从而混杂在质粒中成碎片从而混杂在质粒中。细。细菌培养时间过长会导致细胞和菌培养时间过长会导致细胞和DNADNA的降解，培养时间不要超的降解，培养时间不要超过过1616小时。小时。q问题二：质粒纯度不高，如何解决？ 原因原因对对策策 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM: DL5000 DNA MarkerM: DL5000 DNA Marker1, 4,7,10

8、1, 4,7,10 为质粒为质粒DNADNA2, 5,8,11 2, 5,8,11 为为PCRPCR产物产物3, 6,9,12 3, 6,9,12 为酶切片段为酶切片段酶切长片段含目的DNA片段的酶切短片段琼脂糖凝胶电泳的应用 1、DNA的制备 适合分离大片段DNA。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。 可提取大分子DNA。在“洋葱帕克霍尔德氏菌HMWDNA的制备及酶切研究”的实验中提到，构建大片段基因组文

9、库的关键就是获得高分子量的基因组DNA3。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA；酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经过研究人员不懈的研究，利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者，因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂，而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别。 2、琼脂糖

10、在其他方面的应用 琼脂糖在免疫扩散法中的应用。 琼脂糖在双链DNA探针的合成方法中的作用。谢谢！免疫扩散法就是利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物

11、质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。双向琼脂扩散实验中也用琼脂或琼脂糖作为扩散介质，原因同上。双链DNA探针的合成方法主要有切口平移法和随机引物合成法。a 切口平移法影响切口平移反应的几种因素: (a) 产物的比活性取决于-32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如

12、琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。b 随机引物合成法随机引物合成法还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。以上是琼脂糖凝胶在生物学各个领域中的部分应用。但由于当今生物研究领域正处于飞速的发展之中，所以琼脂糖凝胶的应用范围可能会更广，会在生物研究中发挥自己应有的作用。50mmol/L 50mmol/L 葡萄糖葡萄糖25mmol/L Tris25mmol/L TrisCl(pH8.0)Cl(pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0) 作用：分散细胞，鳌合金属离子作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活使金属酶失活 注意：菌液一定悬

13、浮均匀，不能注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块有结块 0.2 mol/ L NaOH0.2 mol/ L NaOH1% SDS1% SDS 作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。解，核酸和蛋白质变性。 注意：时间勿太久，动作要温柔，注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次轻轻颠倒几次 5mol/L 5mol/L 乙酸钾乙酸钾 60 ml60 ml冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5ml水水 28.5ml28.5ml 作用：酸性条件下质粒作用：酸性条件下质粒DNADNA复性，复性，变性蛋白变性蛋白-SDS-SDS线性线性DNADNA沉淀，沉淀，NaNa可中和可中和DNADNA 注意：复性时间不宜过长注意：复性时间不宜过长