标准物质研制报告

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1、转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质研制报告完成单位：上海交通大学农业部科技发展中心中国科学院植物生理生态研究所中国农科院油料作物研究所中国计量科学院项目负责人：XXX完成时间：2010年12月摘 要转基因产品成分检测是转基因安全管理和标识的重要内容，而转基因生物标准物质是获得准确、可靠、具有可比性检测结果的保证。转基因大豆GTS 40-3-2转化体在我国已批准进口用作加工原料。因此，制备转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质，将其用于转基因产品检测中的应用十分必要。通过将转基因大豆GTS 40-3-2和其受体材料分别冷冻研磨，按质量百分比称量配制形成5%，1%、0.5%、0%四个浓

2、度水平的标准物质。均匀性和稳定性研究表明，本批标准物质的均匀性良好，可在常温下运输1个月，长期稳定性达到12个月。本批标准物质定值采用了8家实验室联合定值，定值方法采用已通过国际循环验证的荧光定量PCR方法方法，最终本批转基因大豆GTS 40-3-2a、GTS 40-3-2b、GTS 40-3-2c、GTS 40-3-2d标准物质的量值确定为4.87%、1.15%、0.56%和0%。本批标准物质每瓶1 g，使用时最小取样量为100 mg，可用于转基因大豆GTS 40-3-2的定性和定量PCR检测，以及转基因大豆GTS 40-3-2特异性检测方法的评价。目 录1. 概述2. 候选物筛选3. 标准

3、物质样品制备4. 均匀性检验5. 稳定性检验6. 定值7. 不确定度评定8. 参考文献9. 附录1. 概述1.1研究背景随着转基因技术的发展，转基因作物无论在种植面积，还是在转化性状的多样性上均有突飞猛进的发展。在转基因作物商业化种植和应用迅速发展的同时，给转基因作物的安全管理带来了挑战。目前已有50多个国家颁布了相关法律对转基因产品进行标识，如欧盟实施强制性的转基因标签制度，规定转基因标识的阈值为0.9%，巴西为1.0%，韩国为3.0%，日本、俄罗斯为5.0%。我国于2001年5月23日颁布实施农业转基因生物安全管理条例，条例明确规定对大豆、玉米、棉花、油菜、番茄等5大类17种转基因产品应当

4、有明显的标识。转基因产品成分检测是转基因生物安全管理和标识重要内容，要实施安全管理条例必须发展相关的转基因检测技术和方法。近年来，我国转基因产品检测技术方法和标准化工作进展迅速，制订了一系列转基因产品检测技术标准。但是，在实际检测工作中，由于转基因植物标准物质的缺乏，已影响转基因检测技术的标准化和已有标准的执行。标准物质是具有高度均匀性、良好稳定性和量值准确性，用来校准、对测量方法进行评价或为物质定值的物质，在分析测试各行业均得到广泛应用。在转基因生物检测领域，标准物质用于建立检测方法、校准和方法验证。有证标准物质用于控制实验过程和方法，以保证分析测试数据的准确性、可靠性、可重复性和可比性。建

5、立转基因产品检测标准物质研制与生产技术平台是我国转基因生物安全监管的基本要求。1.2 国内外研究现状为保证转基因生物安全管理和标识制度的顺利实施，各国政府和研究人员十分重视转基因标准物质研制工作。欧盟、美国和日本在2002年便开始转基因植物及其产品标准物质的研究和制备工作。欧盟为了实施转基因产品标识法规，位于比利时的欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)成立专门的工作小组，建立转基因产品标准物质的研制方法和工艺流程。到2009年，该工作小组已经研制了一系列针对在欧盟商业化生产的

6、转基因作物标准物质，如转基因大豆GTS40-3-2、356043、305423等品系，转基因玉米（MON810、MON863、TC1507、Bt11和Bt176等品系）等。同时，也建立了一套完善和有效的标准物质制备方法和流程体系。欧盟标准物质与测量研究所主要生产基体类标准物质。美国的转基因生物标准物质由美国石油化学家学会负责研制，主要生产植物基因组DNA和种子这两种形态的标准物质，其生产的标准物质数量与欧盟相当，涉及的转化体也几乎覆盖目前已在国际市场上商业化种植的转基因作物。另外日本以及一些生物公司，如SIGMA也制备了质粒形态的标准物质，但研制的数量比较有限。总的来说，目前国内外生产转基因成

7、分检测有证标准物质的机构主要为欧盟的IRMM以及美国的AOCS。近年来我国在标准物质研究方面也开展了一定工作，制备了少量的用于转基因生物检测工作的工作标样，但仍然缺乏标准物质制备关键核心技术和完善的验证、量值溯源体系，远不能满足我国转基因生物安全监管和执法的需求，这对转基因产品的安全评价、身份验证、国内监管、进出口检验、企业自控和国际贸易互认带来了一定的影响。1.3 研究目的转基因大豆GTS 40-3-2转化体是除草剂的转基因大豆，由美国孟山都公司研制。目前包括我国在内，世界上已有17个国家批准此玉米转化体作为食品或饲料成分。本研究的目的是以转基因大豆GTS 40-3-2种子为基体，制备系列G

8、TS 40-3-2基体标准物质。1.4 预期目标和应用前景预期制备系列转基因GTS 40-3-2基体标准物质，包括不同浓度梯度的转基因大豆GTS 40-3-2成分，通过转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质的研制，为我国转基因生物检测和安全评价提供技术、信息和标准物质服务，以此推进我国转基因生物安全评价和检测工作标准化，维护国际国内贸易的公平性，并构筑国际贸易的技术壁垒，促进我国转基因生物技术研究和产业化的健康发展。2候选物筛选选择田间种植，套袋自交的方式，获得转基因大豆GTS40-3-2及受体其非转基因大豆材料。由于大豆是严格自花授粉植物，且通过套袋自交，我们通过单株种植、单株鉴定、单株

9、收获的方式，种植2代后，我们获得了转基因大豆GTS40-3-2纯合材料和非转基因大豆材料各5和10 kg。图1. GTS40-3-2转化体特异性鉴定1号泳道：GTS40-3-2阳性样品对照，2号泳道：空白对照，317泳道：待测植株图2. GTS40-3-2内源基因鉴定1号泳道：lectin阳性样品对照，2号泳道：空白对照，317泳道：待测植株品3. 标准物质样品制备3.1 样品制备策略转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质样品制备的技术路线如图3所示，主要包括种子研磨、混匀、粒度粒径分析、含水量测定、DNA提取效率、分装等。图3. 标准物质样品制备技术路线图3.2 候选物研磨及粒度大小分布

10、测定候选物加工包括两次研磨过程，利用冷冻研磨机进行研磨，每次处理60 g的材料。材料研磨后对其颗粒粒度大小分布测定。粒度测定时，对研磨后材料进行随机取样，每个样品10 g，采用多级标准网筛，筛选粉末，测定每一级粉末的质量，分析材料的颗粒粒度分布。一次粉碎后的原材料的颗粒粒径分布定结果见表1。表中显示研磨的颗粒的粒度大小按照正态分布，直径主要集中在63355 m范围内。表1. 候选物一次研磨材料粒度大小分布非转基因候选物转基因GTS 40-3-2候选物标准筛孔径（m）粉末质量（g）质量比例（%）偏差粉末质量（g）质量比例（%）偏差7109.9320 100.00 0.00 9.7355 0.00

11、 0.00 5009.9320 100.00 0.00 9.7355 0.00 0.00 3559.2884 93.52 1.36 9.2215 94.72 2.50 2508.2834 83.40 2.30 8.0919 83.12 1.14 1806.6378 66.83 3.40 6.1762 63.44 2.66 1254.4777 45.08 4.80 3.7595 38.62 2.05 902.6578 26.76 3.24 2.0199 20.75 1.22 630.0000 0.00 0.00 0.0000 0.00 0.00 二次粉碎后的标准物质的颗粒粒径分布定结果见表2。表

12、中显示研磨的颗粒的粒度大小按照正态分布，直径主要集中在90250 m范围内，二次研磨后的颗粒分布完全符合标准物质的要求。表2. 候选物二次研磨材料粒度大小分布GTS 40-3-2 （5.0%）GTS 40-3-2 （1.0%）GTS 40-3-2 （0.5%）标准筛孔径（um）粉末质量（g）质量比例（%）偏差粉末质量（g）质量比例（%）偏差粉末质量（g）质量比例（%）偏差7109.9937100010.000710009.985010005009.9937100010.000710009.985010003559.714397.20%0.27%9.622396.220.929.513695.2

13、80.552508.720887.26%2.63%8.791987.913.028.701887.150.611806.979769.84%3.06%6.152061.527.276.550665.617.481253.787737.90%3.19%3.902039.023.734.068040.758.94901.238012.39%2.74%1.385413.852.311.569915.722.0163-3.3 GTS 40-3-2与受体非转基因玉米粉末DNA抽提效率比较在转基因大豆GTS 40-3-2和非转基因玉米候选物研磨材料混合之前，我们对GTS 40-3-2与非转基因受体研磨材料

14、的DNA抽提效率进行了比较，从而保证研磨获得的材料具备相近的抽提效率。对干燥后的转基因和非转基因研磨材料分别进行随机取样3次，每次取样100mg，以标准CTAB法抽提DNA，以Picogreen DNA荧光定量方法测定抽提的DNA浓度，计算两种材料的DNA抽提效率比,计算公式为： 来源于100mg 转基因材料的DNA的质量(g)来源于100mg 非转基因材料的DNA的质量(g)基体标准物质是将转基因材料和非转基因材料按照一定的质量比例配比混合而成的，而标准物质在应用于转基因产品PCR检测时需检测其DNA，因此二者的DNA抽提效率影响的差异会影响配制的标准物质的转基因百分含量（GM%）。本研究中

15、采用的转基因材料GTS 40-3-2和非转基因材料是具备相似的遗传背景的，二者的遗传差异仅在于转基因材料基因组中插入外源基因及其表达产物，理论上二者应具备相似的DNA抽提效率。鉴于此，本研究测定了二者的DNA抽提效率。实验结果显示二者的DNA抽提效率比为1.11,接近于1，二者具备相似的DNA抽提效率。表3. 转基因大豆GTS 40-3-2和非转基因玉米研磨后材料的DNA抽提效率比抽提方法抽提效率比SDCTAB0.923.453.4 含水量测定从一次粉碎并干燥后的GTS 40-3-2和受体材料及封装前的混合材料（配制的GMWT%为5%、1%和0.5%的基体标准物质）中，随机抽取3个子样品，每个

16、子样品3g,以HB43-s水分测定仪（METTLER TOLEDO）测定其湿度，取三个样品的均值为待测材料的湿度。测定结果见表4。表4. 转基因大豆GTS 40-3-2和非转基因玉米一次粉碎并干燥后的湿度测定材料湿度均值（%）SDRSDGTS 40-3-27.827.477.787.69 0.19 0.02 非转基因大豆7.457.577.437.48 0.08 0.01 GMWT%-5%8.018.218.198.14 0.11 0.01 GMWT%-1%8.988.518.83 8.77 0.24 0.03 GMWT%-0.5%8.78 8.61 8.49 8.63 0.15 0.02 基

17、体标准物质中转基因材料和非转基因材料的湿度差异会影响配制的基体标准物质的转基因百分含量（GM%）,因此在两种材料进行称量配比混合前需测定材料的湿度，以便在称量材料质量时校正其湿度差异。同时基体标准物质所含的水分会影响其稳定性，湿度是基体标准物质的一项质量评价指标。转基因大豆GTS 40-3-2和受体材料的湿度约为7.5%，二者具备相近的湿度。同时基体标准物质的湿度为8.01%8.98%。3.5 GTS 40-3-2基体标准物质的分装我们在GMP认证的实验室分装混匀的转基因GTS 40-3-2基体标准物质。采用10 ml的棕色玻璃瓶，每瓶装入1000 mg基体标准物质，塞上橡皮塞，铝帽密封，贴上

18、标签，具体分装数量见下表5。表5. GTS 40-3-2基体标准物质的分装WT GMO%瓶数5%1251%1250.5%12501254. 均匀性检验本批转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质共制备了4个浓度梯度，依次为0.5%，1%，5%和0%。采用荧光定量PCR方法对转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质的百分含量进行检测，采用方差分析法（F检验法）进行均匀性检验，确定样品的最小取样量，并根据均匀性检验的结果合成均匀性不确定度。4.1 均匀检验方案方差分析法（F检验法）是均匀性检验过程中常用的检验方法之一。此法是通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量之间有无系统偏差。按以下步骤

19、对均匀性检验中的试验结果进行F检验：从标准物质总体单元中抽取m个包装单元，选择不低于定值方法精密度和灵敏度的测量方法，对每个包装单元都进行了n次重复测定，从而计算单元内方差和单元间方差。单元内方差的计算公式如下：式中：均匀性检验中所得的单元内方差；每一单元内重复测定的次数；均匀性检验抽取的单元数；第个单元内的第个测定值；第个单元内的测定平均值。单元间方差的计算公式如下：式中：均匀性检验中所得的单元间方差；个单元测量结果的总平均值；其余符号，意义同前。计算统计量F计算公式如下：查分布表，得临界值。若，单元间方差与单元内方差无显著性差异，样品均匀；若，单元间方差与单元内方差有显著性差异，样品不均匀

20、。4.2 均匀性检测结果对每个浓度水平的样品各随机选取15瓶，每瓶取样三次，因此每个浓度共45份样品。取样量为100mg，通过植物基因组DNA快速提取试剂盒（上海瑞丰农业科技有限公司）提取DNA后，利用荧光定量PCR扩增外源基因和内标准基因进行分析，检测样品在瓶内以及瓶间的均匀性情况。利用方差分析法对瓶内以及瓶间的均匀性进行分析，将这三个浓度的标准物质均匀性检验结果列于表6。均匀性方差检验结果表明：统计量，样品的转基因含量在瓶内和瓶间无显著差异，样品是均匀的。表6. GTS 40-3-2a、GTS 40-3-2b、GTS 40-3-2c均匀性检验结果样品 GMWT%-5% GMWT%-1% G

21、MWT%-0.5% 测试瓶 Ct 均值 SD RSD Ct 均值 SD RSD Ct 均值 SD RSD 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 4.13 3.78 4.12 4.01 0.20 0.05 5.83 6.36 6.09 6.09 0.27 0.04 6.75 6.99 6.82 6.85 0.12 0.02 2 4.54 4.13 4.10 4.26 0.25 0.06 6.18 5.97 6.07 6.07 0.11 0.02 6.71 6.91 7.39 7.00 0.35 0.05 3 3.93 3.84 3.78 3.85 0.08 0.02 6.01 6.19 6.2

22、1 6.14 0.11 0.02 6.29 6.27 6.95 6.50 0.39 0.06 4 3.91 3.78 4.00 3.90 0.11 0.03 6.41 6.11 6.24 6.25 0.15 0.02 7.20 7.04 7.14 7.13 0.08 0.01 5 3.90 3.97 3.64 3.84 0.17 0.05 6.28 5.81 6.12 6.07 0.24 0.04 6.93 6.90 6.88 6.90 0.03 0.01 6 4.17 3.72 3.88 3.92 0.23 0.06 6.06 5.87 6.31 6.08 0.23 0.04 7.27 7.

23、07 7.31 7.22 0.13 0.02 7 4.80 4.21 4.19 4.40 0.35 0.08 5.85 6.38 6.46 6.23 0.33 0.05 6.83 6.85 7.06 6.91 0.12 0.02 8 4.39 4.37 3.90 4.22 0.28 0.07 6.70 6.45 6.25 6.47 0.23 0.03 6.92 7.01 7.09 7.01 0.09 0.01 9 3.82 4.64 4.05 4.17 0.42 0.10 6.06 6.21 6.08 6.12 0.08 0.01 6.91 7.04 6.58 6.84 0.24 0.04 1

24、0 3.95 4.96 3.84 4.25 0.62 0.15 6.61 6.14 6.09 6.28 0.29 0.05 6.87 6.70 7.17 6.91 0.24 0.03 11 3.80 3.82 3.89 3.84 0.05 0.01 6.48 6.28 6.20 6.32 0.14 0.02 6.69 6.65 6.93 6.75 0.15 0.02 12 4.11 3.92 4.02 4.02 0.10 0.02 5.98 6.52 6.06 6.19 0.29 0.05 6.71 6.49 6.91 6.70 0.21 0.03 13 4.22 4.17 4.02 4.14

25、 0.10 0.03 6.2 5.91 6.27 6.13 0.19 0.03 6.97 6.95 7.16 7.03 0.12 0.02 14 4.43 3.93 3.93 4.10 0.29 0.07 6.32 6.29 6.27 6.29 0.03 0.00 7.07 7.37 7.33 7.26 0.16 0.02 15 4.17 4.14 3.96 4.09 0.11 0.03 5.62 6.17 5.92 5.90 0.28 0.05 6.71 6.71 6.74 6.72 0.02 0.01 均 匀 性 评 价 总均值 4.07 总均值 6.18 总均值 6.92 总相对标准偏差

26、 0.22 总相对标准偏差 0.09 总相对标准偏差 0.16 组内平方和/自由度 2.15/30 组内平方和/自由度 1.38/30 组内平方和/自由度 1.11/30 组间平方和/自由度 1.29/14 组间平方和/自由度 0.77/14 组间平方和/自由度 1.70/14 F 1.28 F 1.20 F 3.28 F0.05（14，30） 2.04 F0.05（14，30） 2.04 F0.05（14，30） 2.04 比较结果 F F0.05（14，30） 比较结果 F F0.05（14，30） 比较结果 F F0.05（14，30） 结论 样品均匀性良好 结论 样品均匀性良好 结论

27、样品均匀性良好 4.3样品不均匀性引起的标准不确定度根据均匀性检验中单元间和单元内的方差，按照下式计算样品不均匀性引起的标准不确定度：式中均匀性检验中单元内重复测定次数；均匀性检验中所得的单元间方差；均匀性检验中所得的单元内方差。当测量方法带来的差异成为不均匀性的主导因素时，采用下式计算样品不均匀性引起的标准不确定度：根据均匀性的方差分析结果，可以计算出样品均匀性带来的不确定度。GTS 40-3-2a不确定度为0.16，GTS 40-3-2b不确定度为0.12，GTS 40-3-2c不确定度为0.05。4.3 最小取样量在标准物质均匀性分析过程中，根据样品的研磨细度，样品的取样量为100 mg

28、。结果表明在最小取样量为100 mg时可以代表本批次产品中转基因成分的含量。5. 稳定性检验5.1稳定性检验方案标准物质的稳定性是衡量标准物质的另外一个重要参数。标准物质的长期稳定性与贮存条件下有关，短期稳定性与样品运输过程中的外部因素有关。稳定性的评价是通过在不同时间测定标准物质的特性值，以时间为X轴，以特性量值为Y轴，描绘出特性量值与时间的关系。斜率可用下式计算：截距由下式计算：直线之中的点的标准偏差可由下式计算：与斜率相关的不确定用下式计算：若，则表明斜率是不显著的，未观测到不稳定性。稳定性的不确定度贡献采用公式：5.2短期稳定性测试短期稳定性测试选取不同温度（-20，4，20，37和6

29、0），不同时间点（0，2，4和8周）进行测试，每次每个浓度梯度随机选取5瓶，每瓶取样3份（N=5，n=3），计算方法和评价标准用定量PCR的方法进行测定。取样量为100mg，通过植物基因组DNA快速提取试剂盒（上海瑞丰农业科技有限公司）提取DNA之后，利用荧光定量PCR扩增外源基因和内标准基因进行扩增，通过检测其转基因含量变化情况，评价样品的短期稳定性。样品短期稳定性分析结果见表6。样品在37储存8周后，转基因含量变化不明显。经过t测试对数据进行分析，结果表明变化的差异未达到显著水平，样品在37的条件下储存4周是稳定的。因此转基因大豆GTS 40-3-2基体标准物质可在常温下运输。表6. 转基

30、因大豆GTS 40-3-2标准物质短期、长期稳定性结果0.5%标准物质长期CtMeansample 1Meansample 2Meansample 3Meansample 4AverageSDRSDt TESTt0.05(11)结论200月0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.181月0.49 0.53 0.47 0.45 0.48 0.033 0.069 1.692.20稳定2月0.50 0.51 0.62 0.47 0.52 0.063 0.120 1.322.20稳定4月0.46 0.49 0.54 0.59 0.52 0.054 0.104 1.

31、322.20稳定6月0.49 0.47 0.63 0.54 0.53 0.071 0.134 1.512.20稳定40月0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.181月0.45 0.62 0.57 0.50 0.54 0.075 0.140 1.712.20稳定2月0.52 0.49 0.50 0.60 0.53 0.048 0.092 2.022.20稳定4月0.47 0.49 0.61 0.56 0.53 0.063 0.119 1.722.20稳定6月0.59 0.52 0.52 0.45 0.52 0.056 0.107 1.242.20稳定-20

32、0月0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.181月0.48 0.53 0.47 0.46 0.49 0.031 0.063 1.652.20稳定2月0.50 0.51 0.58 0.49 0.52 0.040 0.076 1.802.20稳定4月0.55 0.49 0.48 0.54 0.51 0.035 0.068 1.482.20稳定6月0.55 0.49 0.48 0.57 0.52 0.046 0.088 1.782.20稳定短期600周0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.182周0.47 0.48 0.

33、58 0.56 0.52 0.056 0.108 1.392.20稳定4周0.59 0.45 0.53 0.50 0.52 0.056 0.109 1.062.20稳定8周0.56 0.51 0.47 0.56 0.53 0.044 0.084 2.062.20稳定370周0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.182周0.53 0.60 0.50 0.48 0.53 0.052 0.099 1.842.20稳定4周0.52 0.50 0.47 0.57 0.51 0.043 0.084 1.172.20稳定8周0.51 0.55 0.49 0.50 0.

34、51 0.027 0.052 1.202.20稳定200周0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.182周0.50 0.47 0.48 0.52 0.49 0.022 0.044 1.452.20稳定4周0.49 0.53 0.47 0.45 0.48 0.033 0.069 1.692.20稳定8周0.50 0.51 0.62 0.47 0.52 0.063 0.120 1.322.20稳定40周0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.182周0.49 0.48 0.52 0.55 0.51 0.035 0.068

35、0.962.20稳定4周0.45 0.62 0.57 0.50 0.54 0.075 0.140 1.712.20稳定8周0.52 0.49 0.50 0.60 0.53 0.048 0.092 2.022.20稳定-20 0周0.54 0.49 0.48 0.50 0.50 0.027 0.054 0.54 2周0.58 0.55 0.50 0.47 0.53 0.052 0.098 0.58 2.20稳定4周0.48 0.53 0.47 0.46 0.49 0.031 0.063 0.48 2.20稳定8周0.50 0.51 0.58 0.49 0.52 0.040 0.076 0.50

36、2.20稳定1%标准物质短期600周1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.032周0.99 1.04 0.95 1.09 1.02 0.059 0.058 0.902.20稳定4周0.95 1.15 1.06 0.99 1.04 0.090 0.086 1.412.20稳定8周0.93 1.08 0.87 0.96 0.96 0.087 0.091 1.562.20稳定370周1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.032周1.16 1.00 1.06 0.96 1.05 0.089 0.085 1.762.20稳定

37、4周1.14 0.94 0.99 1.18 1.06 0.117 0.110 1.832.20稳定8周1.05 1.11 1.20 0.92 1.07 0.116 0.109 2.062.20稳定200周1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.032周1.09 1.00 1.05 0.98 1.03 0.049 0.047 2.072.20稳定4周1.22 0.93 1.07 1.08 1.08 0.118 0.110 2.252.20稳定8周1.01 0.97 1.18 0.97 1.03 0.101 0.098 1.082.20稳定40周1.02 0.

38、91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.032周1.05 0.93 1.13 1.06 1.04 0.083 0.079 1.662.20稳定4周0.91 1.13 1.01 1.16 1.05 0.113 0.108 1.662.20稳定8周0.93 1.09 1.03 1.17 1.06 0.104 0.099 1.842.20稳定-20 0周1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.032周1.14 0.93 0.99 1.21 1.07 0.129 0.121 1.792.20稳定4周1.14 1.05 1.12 0.91 1

39、.05 0.105 0.100 1.782.20稳定8周1.02 1.09 1.13 0.95 1.04 0.079 0.075 1.972.20稳定长期200月1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.031月1.22 0.93 1.07 1.08 1.08 0.118 0.110 2.252.20稳定2月1.01 0.97 1.18 0.97 1.03 0.101 0.098 1.082.20稳定4月1.00 1.18 1.19 0.92 1.07 0.134 0.125 1.882.20稳定6月0.96 0.94 1.15 1.21 1.06 0.13

40、4 0.126 1.642.20稳定40月1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086 0.031月0.91 1.13 1.01 1.16 1.05 0.113 0.108 1.662.20稳定2月0.93 1.09 1.03 1.17 1.06 0.104 0.099 1.842.20稳定4月1.15 1.07 0.93 1.08 1.06 0.093 0.088 2.102.20稳定6月1.00 1.09 1.04 0.99 1.03 0.049 0.047 2.192.20稳定-200月1.02 0.91 1.11 0.95 1.00 0.086 0.086

41、0.031月1.14 1.05 1.12 0.91 1.05 0.105 0.100 1.782.20稳定2月1.02 1.09 1.13 0.95 1.04 0.079 0.075 1.972.20稳定4月1.27 1.16 0.91 1.06 1.10 0.153 0.139 2.282.20稳定6月1.13 0.95 0.99 1.09 1.04 0.088 0.085 1.572.20稳定5%标准物质短期600周4.86 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.042周5.18 4.57 5.63 5.43 5.20 0.460 0.088 1.522.20

42、稳定4周5.03 5.43 4.63 6.07 5.29 0.613 0.116 1.662.20稳定8周5.36 4.60 5.66 5.40 5.26 0.457 0.087 1.932.20稳定370周4.86 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.042周4.70 5.59 5.59 5.18 5.26 0.423 0.080 2.142.20稳定4周5.66 4.63 5.55 5.21 5.26 0.463 0.088 1.982.20稳定8周5.03 4.80 5.82 5.14 5.20 0.441 0.085 1.562.20稳定200周4.86

43、 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.042周4.90 6.37 5.11 5.25 5.41 0.661 0.122 2.132.20稳定4周5.32 5.95 5.66 4.60 5.38 0.581 0.108 2.292.20稳定8周5.03 4.67 5.21 5.95 5.21 0.538 0.103 1.382.20稳定40周4.86 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.042周5.21 4.86 4.86 5.74 5.17 0.416 0.080 1.422.20稳定4周5.43 4.51 5.40 5.55 5

44、.22 0.481 0.092 1.592.20稳定8周5.18 4.86 5.63 4.97 5.16 0.338 0.066 1.622.20稳定-20 0周4.86 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.042周4.06 4.76 4.73 5.47 4.76 0.576 0.121 1.462.20稳定4周5.86 4.73 5.51 4.86 5.24 0.537 0.102 1.562.20稳定8周5.40 4.86 5.03 5.18 5.12 0.226 0.044 1.812.20稳定长期200月4.86 5.21 4.90 5.03 5.00

45、0.159 0.032 0.041月5.32 5.95 5.66 4.60 5.38 0.581 0.108 2.292.20稳定2月5.03 4.67 5.21 5.95 5.21 0.538 0.103 1.382.20稳定4月5.47 4.76 6.03 5.03 5.32 0.553 0.104 2.032.20稳定6月5.70 4.60 5.59 5.07 5.24 0.507 0.097 1.642.20稳定40月4.86 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.041月5.43 4.51 5.40 5.55 5.22 0.481 0.092 1.592

46、.20稳定2月5.18 4.86 5.63 4.97 5.16 0.338 0.066 1.622.20稳定4月5.40 5.43 5.95 4.51 5.32 0.598 0.112 1.862.20稳定6月5.40 4.86 6.03 4.80 5.27 0.572 0.109 1.642.20稳定-200月4.86 5.21 4.90 5.03 5.00 0.159 0.032 0.041月5.86 4.73 5.51 4.86 5.24 0.537 0.102 1.562.20稳定2月5.40 4.86 5.03 5.18 5.12 0.226 0.044 1.812.20稳定4月4.

47、54 5.21 5.63 5.99 5.34 0.622 0.116 1.902.20稳定6月4.73 5.40 5.99 4.90 5.25 0.566 0.108 1.552.20稳定5.3 长期稳定性测试长期稳定性测定温度为20，4和-20，在不同时间点（1，2，4，6，12月，）每次每个浓度梯度取样随机选取5瓶，每瓶取样3份（N=5，n=3），用定量PCR的方法进行测定。取样量为100 mg，通过植物基因组DNA快速提取试剂盒（上海瑞丰农业科技有限公司）提取DNA之后，利用荧光定量PCR扩增外源基因和内标准基因进行扩增，通过检测其转基因含量变化情况，评价样品的长期稳定性。样品长期稳定性

48、检验结果列于表6。样品在-20、4、20储存12个月，转基因含量未发生显著变化，因此样品可于4或-20稳定储存12个月。5.4 稳定性的标准不确定稳定性的不确定度贡献采用公式：。有效期个月的长期稳定性的不确定度贡献计算，分别为0.12, 0.08和0.09。.6. 定值标准物质特性值的测定有几种技术上有效的方式。包括一个或多个实验室用一种或多种方法进行测量。具体选择哪一种方法根据标准物质的类型、最终使用需求、参加实验室的资质、所用方法的质量水平及评估特性值不确定度的实际能力。由于样品中的转基因含量测定，目前国内外主要是采用荧光定量PCR技术，转基因含量表述为外源基因的拷贝数与内标准基因的拷贝数

49、之比。因此，转基因大豆GTS 40-3-2标准物质的量值测定通过荧光定量PCR技术，采用实验内部多人员定值策略进行定值。6.1溯源性在测定过程中，以纯合的转基因大豆GTS 40-3-2粉末为100%的标准品。该标准品的纯度已通过测试。转基因含量测定的是基因片段的拷贝数，拷贝数可通过下式溯源到质量单位kg。： 6.2 定值结果定值结果分析时，对每个实验室的测量结果进行分析，根据格拉布斯和狄克逊法剔除可疑值，具体每个实验室测定结果见定制报告。汇总8个实验室的定值数据，统计分析定制结果是否具有正态分布性，将每个实验室的测量结果平均值作为新的单一数据，依据拉布斯和狄克逊法剔除可疑值，从而计算最终的总平

50、均值和标准偏差。根据各实验室定值结果，统计分析确定标准物质GTS 40-3-2a的量值为4.87%，标准物质GTS 40-3-2b的量值为1.15%，标准物质GTS 40-3-2c的量值为0.56%，标准物质GTS 40-3-2d的量值为0%。7不确定度评定根据ISO、EURACHEM导则、测量不确定度评定与表示（国家计量技术规范），对GTS 40-3-2基体标准物质的不确定度进行了评定。7.1 不确定度来源分析对于标准物质来说，其定值结果的不确定度有三部分组成，分别为：标准物质的不均匀性引入的不确定度；标准物质的不稳定性引入的不确定度；标准物质的定值过程带来的不确定度。7.1.1均匀性引入的

51、不确定度的确定与估计参照全浩、韩永志主编标准物质及其应用技术（第二版），从标准物质总体单元中抽取m个单元，每一个单元进行n此测量，选择重复性好和灵敏度高的测量方法进行测定，假定得出如下结果：X11、X11、X1nX21、X22、X1nXm1、Xm2、Xmn若则由于物质不均匀性性质引起的标准偏差为：当SHS2时，则认为样品很不均匀；SHS2时，则认为样品均匀；SHS2时，则应将SH的值合成到该标准物质的定值不确定度中。7.1.2由标准物质的稳定性所产生的不确定度的确定与评定参照全浩、韩永志主编标准物质及其应用技术（第二版），选择重复性好和灵敏度高的荧光定量PCR方法，在不同的时间进行m次测量，每

52、次测量n次数据，类似于均匀性不确定度的确定可有样品稳定性所产生的标准偏差ST为8.2.3标准物质定值过程带来的不确定度：本课题研究的标准物质采用测序和荧光定量PCR的方法来进行定值，其中由测序定值引入的不确定度偏差很小，可以忽略。荧光定量PCR方法定值引入的不确定度uchar为：其中k表示组的数目。sA表示为组间的标准偏差，而swithin表示为组内的标准偏差。7.2 不确定度的具体量化7.2.1定值带来的不确定度：根据定值结果，计算获得定值不确定度为0.58,0.15和0.05。8.2.2 均匀性差异带来的不确定度根据上述公式，计算出无论以转基因大豆GTS 40-3-2转化体特异性序列或内标准基因为扩增目标，SH的值均小于S2的值。表明样品具有良好的均匀性，量值稳定。8.2.3 稳定性带来的不确定度根据上述公式，计算出ST的值。用格拉布斯发从统计上剔除可疑惑值，稳定性测量结果表明在监测时间内稳定性变化较小，量值稳定。7.3 不确定度合成得到不确定度的各分量，按公式将各分量合成即为总体不确定度uCRM：合成标准不确定度乘以扩展因子4.30（扩展因子的值：参考全浩、韩永