利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定本科毕业论文1

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1、河北农业大学本科毕业论文论文题目 利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定材料目录：1、任务书 （1）份2、开题报告 （含文献综述） （1）份3、指导教师评阅书 （1）份4、答辩记录表 （1）份5、论文正文 （1）份6、其它材料专业名称农学院，农学专业论文题目利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定题目来源通过对田间高粱对蚜虫的观察以及前人在实验室利用分子标记在高粱抗蚜的鉴定方面的成果目的意义：1、高粱蚜虫严重危害高粱，通过对高粱抗蚜的研究可以有效控制田间高粱蚜虫。2、通过对高粱抗蚜基因的鉴定，可以大大缩减田间育种的年限，对育种工作具有指导性的意义。3、在抗蚜基因的研究可以从生物自身抵

2、御高粱蚜虫，可以避免化学药剂抗蚜虫造成的环境污染。可行性分析：1、研究条件： 高粱具有抗蚜性的基因，对蚜虫表现为抗蚜和感蚜两种性状。其中高粱的抗蚜基因对感蚜基因表现显性，受主效单基因控制。在对高粱抗蚜田间观察中，发现具有抗蚜性基因的植株明显比不具有抗蚜性基因的植株受到危害小，因此可以利用分子标记对高粱的抗蚜基因进行定位，从而指导田间育种工作，前人也曾利用分子标记对高粱蚜基因进行定位并取得突破性的成果，因此本实验是可行的。2、预期结果 通过利用凝胶电泳对一些与抗蚜相关的SSR标记进行多态性分析，筛选出6对具有多态性的引物，并对高粱品种“河农16”和“千三”的F8重组自交系进行SSR多态性分析，从

3、而观察筛选出的6对具有多态性引物在群体中的抗感情况，通过对群体电泳条带的观察，并结合对群体抗感表型的调查来找到与目的性状相连锁的基因。预计实验所用的分子标记与抗蚜基因是相连锁。3、可能存在的问题 由于时间的原因，田间试验的重复数较少，所得到的结论可能存在一定问题，需要多次重复进行验证。进度安排：2012年5-6月：查阅资料，设计试验内容，选择大豆品种。2012年6-12月：撰写课程论文，开展试验内容，完成试验内容。2013年1-6月：整理试验数据，完善试验内容，撰写毕业论文，准备答辩材料，进行毕业答辩。专家意见：论文选题针对性强，依据充分，设计合理，路线可行，进度安排合理，预期结果明确，同意按

4、计划执行。专家签字：2012年 5月10日学院意见: 院长： 年 月 日 农学 学院 农学 专业 陈再军 学生现把 2012-2013 学年，第 2 学期的毕业论文安排下达给你，你本学期承担的毕业论文任务如下：1、依据本任务书中论文题目、目的意义、可行性分析的内容完成开题报告。2、按照开题报告的要求按期完成毕业论文各项工作的实施。3、完成毕业论文的撰写。4、完成毕业论文的答辩。 请按相关要求完成毕业论文任务。教师签字：2012年 5 月 4 日河北农业大学本科毕业论文开题报告题 目： 利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定 学 院： 农学院 学生姓名： 陈再军 专 业： 农学 班级学号：

5、 2009014010215 指导教师姓名： 常金华 指导教师职称： 教授 二零一二年六月五日学生姓名陈再军专业班级农学0902班学 号2009014010215指导教师常金华职 称教授所在学院农学院论文名称利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定选题依据理论依据：高粱具有抗蚜性的基因，对蚜虫表现为抗蚜和感蚜两种性状。其中高粱的抗蚜基因对感蚜基因表现显性，受主效单基因控制。在对高粱抗蚜田间观察中，发现具有抗蚜性基因的植株明显比不具有抗蚜性基因的植株受到危害小，并且前人在实验室也进行过分子标记对高粱抗蚜虫基因进行过定位，因此可以利用分子标记对高粱的抗蚜基因进行定位，从而指导田间育种工作。目的

6、意义：1、高粱蚜虫严重危害高粱，通过对高粱抗蚜的研究可以有效控制田间高粱蚜虫。2、通过对高粱抗蚜基因的鉴定，可以大大缩减田间育种的年限，对育种工作具有指导性的意义。3、在抗蚜基因的研究可以从生物自身抵御高粱蚜虫，可以避免化学药剂抗蚜虫造成的环境污染。文献综述：王富德等(1993)对3799份中国高粱品种资源进行了抗高粱蚜鉴定,结果表明,高抗的1份,抗的4份,占总数的0.13%;中感的441份,占总数的11.61%;其余88.26%的高粱资源对蚜虫的为害都很敏感。唯一1份高抗高粱蚜资源是恢复5-27(国家编号8432) ,在它的系谱中有抗高粱蚜的外国高粱品种TAM428。对高粱蚜表现抗的4 份中

7、国高粱品种分别是紧穗高粱(忻县)、红壳散码(鹿邑) 、粘高粱(辉南)和大锣锤高粱(沾化)。潘景芳等(1996) 报道,从1986年开始,利用抗蚜源TAM428等与非抗蚜材料杂交,从分离后代中选育出11份恢复系,并利用这些恢复系与6个不育系选配一批杂交种,又通过人工接蚜鉴定、产量鉴定和主要农艺性状鉴定,从中筛选出几个较为优良的抗蚜恢复系及其高产、优质、多抗杂交种。1996-2000 年,在田间采用人工接菌法进行高粱抗病性鉴定和利用田间自然发生的害虫种群与人工辅助接虫相结合的方法进行高粱抗虫性鉴定,对1282 份高粱种质资源进行了高粱丝黑穗病、高粱靶斑病、高粱蚜虫和玉米螟等4种病虫害的抗性同步鉴定

8、。划清了被鉴定资源对不同病虫害的抗性等级,筛选出兼抗2种病虫害的双抗性资源93份,兼抗3种病虫害的多抗性资源9份。通过对抗蚜的河农16和感蚜品系Tx623B、Tx622B、Tx3197B、千三、晋五及杂交种的物理特性、组织结构、生理生化特性的对比分析,研究了不同基因型高粱理化特性与抗蚜性的相关性。结果表明,高粱抗蚜品系叶片表面较感蚜品系的细胞排列整齐、致密、表皮细胞直径较感蚜品系小、叶片薄、叶片表面光滑、叶片颜色浅感虫后各品系过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性均有升高,与蚜虫的诱导存在相关性,但不同品系感蚜前后均不存在趋势性变化;苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性感虫前在抗虫的河农16

9、及杂交种中具有高水平表达,并与其他感蚜品系存在显著差异;蚜虫侵害诱导后PAL酶活性均有上升,但抗蚜品系中表现稳定,酶活性变化幅度与叶片损伤程度存在相关性,PAL酶活性与高粱的抗蚜性存在明显的相关性。感虫前后氨基酸含量及其变化与高粱品系抗蚜性间无相关性;在感蚜虫前,抗蚜品系及其杂交种可溶性糖含量显著高于感蚜品系,接虫后感蚜品系可溶性糖含量升高显著。1997年进行大面积药效试验,70%高巧拌种即可有效控制蚜虫在高粱抽穗期(即为害盛期)的为害,结果表明70%高巧干种衣剂对高粱出苗期、出苗率及生育期无不良影响, 且有一定的壮苗促长作用。对高粱苗期蚜虫控制效果明显,并可控制蚜虫的危害到高粱抽穗期;即一次

10、拌种就解决蚜害, 同时对地老虎还有一定的抑制作用。头水进地要及时,避免高粱受旱,防蚜效果更佳。1982年，徐守珍等于田间和室内鉴定了500余份国内外种质资源的抗蚜性, 从中发现TAM428和Dubor 2高抗高粱蚜。研究方法、内容： 通过利用凝胶电泳对一些与抗蚜相关的SSR标记进行多态性分析，筛选出6对具有多态性的引物，并对高粱品种“河农16”和“千三”的F8重组自交系进行SSR多态性分析，从而观察筛选出的6对具有多态性引物在群体中的抗感情况，通过对群体电泳条带的观察，并结合对群体抗感表型的调查来找到与目的性状相连锁的基因。DNA提取：主要是利用CTAB法提取高粱叶片组织的DNA。1）CTAB

11、提取缓冲液（2%CTAB，1M Tris-HClPH8.0，0.5MEDTA PH8.0，1.4 mmol/L NaCl，2-巯基乙醇），65提前水浴；剪取高粱叶片于研钵中加入800ulCTAB提取液研磨，将研磨液转入1.5ml离心管中65水浴40min。（2）将离心管取出冷却至室温，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），充分混匀，配平后10,000 rpm离心10 min，将上清液转移到另一离心管中。 （3）加入2倍体积的预冷过的无水乙醇，轻轻颠倒数次即可见成团白色DNA絮状沉淀析出(可以置于-20放置30 min)，10,000 rpm离心10 min，弃上清。（4）加1 mL 70乙醇进

12、行洗涤，10,000rpm离心5 min，重复本步骤2次。（5）去掉乙醇后室温下风干DNA，加入50ul的dd H2O使之完全溶解。（6）紫外分光分度计检测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶检测DNA完整性。PCR扩增：PCR反应程序为：95预变性 5min, 循环 95变性 30s、退火1min、72延伸 2min, 共 35个循环, 最后在 72延伸 10min。PCR产物用8%的凝胶工作液电泳分离, 银染显色。统计分析：首先利用EXCEL表统计田间表型观察结果以及实验室鉴定结果，然后用Mapmaker对分析结果进行计算, 用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距。进度安排： 2012年5-6月

13、：查阅资料，设计试验内容，选择高粱品种并进行田间种植。2012年6-12月：撰写课程论文，开展试验内容，完成试验内容。2013年1-6月：整理试验数据，完善试验内容，撰写毕业论文，准备答辩材料，进行毕业答辩。指导教师意见：论文以测定利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定为题，立题依据较充分，具有一定的理论和实用价值。试验方案设计合理，科学可行，进度安排合适，预期结果明确，同意开题，并进入下一阶段试验内容。指导教师：2012年6月 5 日审 核 小 组 成 员姓 名职 称备 注姓 名职 称备 注开题报告记录：1、PCR扩增时需要注意什么？答：保证模板、使用物品的无污染和操作规范，针对不同作

14、物的不同试验要求，建立相适应的PCR反应体系，又是取得试验成功的关键。PCR反应有几个关键环节：模板DNA的纯度和数量；引物的质量与特异性；酶的质量与数量；Buffer（Mg2+）数量；PCR循环条件。2、影响高粱蚜大发生的主要条件是什么？答：主要是受空气湿度和温度影响，根据前人相关报道，自6月中旬至7月中旬，平均气温在22-29，旬平均相对湿度在55%-75%，温度系数（旬雨量/旬平均气温）大多在1以下，是大发生的主要条件。审核小组评语：选题依据比较充分，试验安排合理，研究方法可行，同意开题并进入下一阶段试验工作。审核小组组长：（签字）年 月 日学院意见：院长：年 月 日河北农业大学本科毕业

15、论文指导教师评阅书学生姓名：陈再军 学号：2009014010215专业班级：农学0902班级所在学院：农学院论文题目：利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定 指导教师评语： 陈再军在本课题组开展毕业论文工作期间，能够遵守学校和学院的各项规章制度，较好的完成论文涉及研究任务，具有较扎实的基础理论和专业知识。论文以高粱抗蚜基因的定位研究内容。选题针对性较强，依据充分，具有一定的科学意义和应用价值。试验设计安排合理，技术路线可行，工作量较大，符合本科毕业论文要求。论文写作格式比较规范，文献参考得当，符合一般科技论文写作要求。论文不足之处在于：（1）文中讨论部分应着重讨论本研究与前人研究的异同

16、与创新性。（2）英文摘要尚需进一步的推敲斟酌。（3）文中表格注意采用三线表。成 绩 评 定：89是否同意答辩： 指导教师（签名）： 2012年6 月2日河北农业大学本科毕业论文答辩评分表评分指标分 值评 价 内 容得 分论文选题10选题有重要理论意义或实用价值。立题依据充分。文献引用12阅读、引用文献资料较广泛，较全面了解本领域学术动态，综合分析能力较强。论文难度及工作量14难度较大，工作量大。论文成果的创新性12有独到见解，有较大的创新性成果。理论基础与科研能力16具有坚实的基础理论和系统的专门知识，具有较强的独立从事科研工作的能力，研究方法和技术体系得当。写作能力16条理清楚，层次分明，说

17、理透彻，文笔流畅，表格、绘图准确规范，中外文摘要简明扼要，语句通顺，语法正确，符合科技写作规范。答辩报告10能简明扼要、重点突出地阐述论文或设计的主要内容，有新见解，结论明确；时间掌握恰当。回答问题10思维敏捷，逻辑性强，准确流利地回答各种问题。总 分10089注：本表为答辩小组成员评分用表，评分标准参照河北农业大学毕业论文质量评定参考标准河北农业大学2013 届本科毕业论文答辩记录表所在学院：农学院 专业班级：农学0902班 时间：2013 年 6 月 7 日学 生 姓 名陈再军学 号2009014010215指导教师姓名常金华职 称教授毕业论文题目：利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性

18、鉴定答 辩 小 组 成 员姓 名职 称成 绩姓 名职 称成 绩答辩小组评语：论文的立题依据较充分，试验数据比较可靠，工作量较大。论文写作格式比较规范，符合一般科技论文写作要求。在论文答辩过程中重点突出，回答问题基本正确。答辩小组组长：（签字）2013年 6 月 7 日答 辩 成 绩：89注：本表与学生毕业论文（设计）一同在学院存档（必须用钢笔书写）农学院 本 科 毕 业 论 文题 目：利用SSR标记对高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定 专业班级： 农 学 0902 班 学 号： 2009014010215 学生姓名： 陈再军 指导教师： 常金华 职 称： 教 授 2013年5月20日利用SSR标记对

19、高粱重组自交系进行抗蚜性鉴定陈再军（河北农业大学 农学0902班071001）摘要：本实验通过利用凝胶电泳对一些与抗蚜相关的SSR标记进行多态性分析，筛选出6对具有多态性的引物，并对高粱品种“河农16”和“千三”的F8重组自交系进行SSR多态性分析，从而观察筛选出的6对具有多态性引物在群体中的抗感情况，通过对群体电泳条带的观察，并结合对群体抗感表型的调查来找到与目的性状相连锁的基因。结果表明：实验所用的分子标记与抗蚜基因是相连锁。关键词：高粱；抗蚜性；SSR标记；遗传分析Identification of the aphid resistance of Sorghum bicolor with

20、 SSR markerChen Zaijun (Agriculture Univercity of HeBei,Class Agronomy of 0902,071001)Abstract: This experiment by using gel electrophoresis for some SSR marker polymorphism analysis associated with resistance to aphid, screened 5 pairs of polymorphic primers, and sorghum varieties “HN- 16” and &quo

21、t;Qian san " F8 recombinant inbred lines for SSR polymorphism analysis, in order to observe the screen for 5 polymorphic primers sense of resistance in the community, through the observation of the groups electrophoresis bands, and combining the survey of group feeling phenotypic resistance to

22、find the traits and purpose in a chain of genes. Results show that the molecular markers used in the experiment with aphid resistant gene is chain. Key words: Sorghum bicolor；aphid resistance；SSR marker; genetic analysis0引言【本实验意义】高粱作为世界上最重要的粮食作物之一，其产量和质量受到世界的关注和研究，它具有抗旱、耐涝及抗盐碱等不良环境的特性。高粱蚜（Melanaphis

23、 sacchari）主要危害高粱又可危害甘蔗、小麦、大麦、玉米等作物，是一种间歇性发生的猖獗害虫，每3-4年突发一次。蚜虫除直接从植物体内吸收营养外，还大量分泌蜜露等物质污染作物，影响了植物的光合作用，严重影响产量和品质1。通过对高粱抗蚜性的鉴定，对高粱研究育种方面具有一定的指导性意义。【前人研究进展介绍】2008年，常金华2等人通过对抗蚜的河农16和感蚜品系Tx623B、Tx622B、Tx3197B、千三、晋五及杂交种的物理特性、组织结构、生理生化特性的对比分析,研究了不同基因型高粱理化特性与抗蚜性的相关性。结果表明,高粱抗蚜品系叶片表面较感蚜品系的细胞排列整齐、致密、表皮细胞直径较感蚜品系

24、小、叶片薄、叶片表面光滑，并且在所有的供试材料中，感蚜前后抗虫和感虫品系的PAL酶存在规律性的变化。2010年，邹剑秋等采用SSR技术，应用分离群体分组分析法，分别利用恢复系分离群体（2381R矮四）和保持系分离群体（Tx622B7050B），筛选抗丝黑穗病菌3号生理小种基因的分子标记，最后在所用的SSR引物中筛选出4个，位于B染色体上，Xtxp145位于I染色体上，与抗病基因的重组率分别为9.6%和10.4%，距离抗病基因的遗传图距分别约为9.6CM和10.4CM3。2010年，余传涨等人采用自行开发的52个SSR标记对41个高粱品种进行遗传多样性分析。结果表明, 52对SSR引物在3%琼脂

25、糖凝胶上共检测出277个等位变异,平均每个位点有5-3个等位变异。通过聚类分析将41个高粱品种分为2个类群8 。【本实验切入点】分子标记能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是植物遗传育种领域内的一项新兴技术。SSR（Simple Sequence Repeat,简单重复序列）是当今四大分子标记技术之一。简单序列重复( Simple sequence repeat , SSR) 又称微卫星( Microsatellite) , 它是基于PCR 基础上的一种分子标记, 最早在人类基因组研究中发现, 而后被应用于植物、动物等研究中。它是一种由1-5个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序

26、列5。与形态学标记、细胞学标记、生化标记这3种标记比较，分子标记具有准确度比较高、信息量大、遗传多态性高、稳定性、重复性好等特点6。因此SSR标记在基因组研究中广泛地应用于遗传图谱的构建、比较基因组和系统研究中,同时也是在分子水平上研究遗传多样性的有力工具。近年来随着社会经济的发展和科学技术的进步,高粱的利用价值被逐步发掘出来, 广泛用于饲料, 燃料乙醇, 制糖等产业。合理开发利用高粱, 对我国粮食安全, 缓解能源危机具有重要意义。对高粱抗蚜性在分子方面的研究，一方面有助于高粱的产量的提高，另一方面，有利于缓解能源与粮食危机。【本实验的目的】本实验利用河农16和千三的杂交组合，对高粱抗蚜性鉴定

27、方法，抗性遗传和SSR分子标记等进行了一些调查了解。其目的在于：了解高粱抗蚜性的遗传鉴定方法，充分了解高粱抗蚜性的遗传特点，建立一套适合高粱蚜抗性的SSR体系找到与高粱蚜抗性基因连锁的分子标记，为最终掌握高粱蚜抗性遗传规律，克隆高粱蚜抗性基因奠定基础。1材料和方法1.1供试材料河农16（ HN-16） 来源于河北农业大学利用从优质杂交种NK22 的分离后代中获得, 对高粱蚜表现免疫,是优质粮饲兼用型品种。千三( Q S) 由千晋红和三尺三的杂交后代选育, 是河北农业大学选育的一个丰产性较好的恢复系, 但对高粱蚜表现高感。1.2仪器与药品实验仪器：试管若干、锥形瓶、离心管、研钵、剪刀、水浴锅、离

28、心机等。药品：硝酸银、氢氧化钠、1.4 mmol/L NaCl，2% CTAB，1M Tris-HClPH8.0，0.5MEDTA PH 8.0，1.4 mmol/L NaCl，氯仿:异戊醇（24:1）、无水乙醇、70乙醇等。1.3方法1.3.1 DNA的提取通过使用CTAB法提取高粱叶片组织DNA，具体步骤如下：（1）CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1M Tris-HClPH8.0，0.5MEDTA PH8.0，1.4 mmol/L NaCl，2-巯基乙醇），65提前水浴；剪取高粱叶片于研钵中加入800ulCTAB提取液研磨，将研磨液转入1.5ml离心管中65水浴40min。（2）将离心管

29、取出冷却至室温，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），充分混匀，配平后10,000 rpm离心10 min，将上清液转移到另一离心管中。 （3）加入2倍体积的预冷过的无水乙醇，轻轻颠倒数次即可见成团白色DNA絮状沉淀析出(可以置于-20放置30 min)，10,000 rpm离心10 min，弃上清。（4）加1 mL 70乙醇进行洗涤，10,000rpm离心5 min，重复本步骤2次。（5）去掉乙醇后室温下风干DNA，加入50ul的dd H2O使之完全溶解。（6）紫外分光分度计检测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶检测DNA完整性。1.3.2 SSR扩增 SSR引物序列见下表：引物名称碱基序列（5端到

30、3端）退火温度/Sb6m3174FTAg Cgg ATT CAA TgT TgC52.74Sb6m3174RTCC ACA TCA TCT TCC ACA A53.25Sb6m3500FTCg TgC TgC TTg CCT TCA57.3Sb6m3500RCCg AgC gTT gTT gTC TTC A57.56Sb6m3610FgAA AAg gTT gCT TCg TAA50.47Sb6m3610RgAA CAT CCg TCC CAT AAA52.74Sb6rj2880FATC gAg CCA TCC ATC TCA AC57.8Sb6rj2880RTgg TCg AAA TTT A

31、Cg AgA CAA A54.48G5-Q-5-FATT gACg TAC CgA TgT CTC TA55G5-Q-5-RTCA gTC CAT AAA ACA TgT ACA g55本实验中SSR扩增采用10lPCR反应体系。PCR体系（10l）模板DNA 1.5l引物 0.5l10×Buffer 1lDNTP 0.2lTaq酶 0.1ldd 水 6.2 l反应循环参数参照刘国庆7的方法，略作改动：PCR反应程序为：95预变性 5min, 循环 95变性 30s、退火1min、72延伸 2min, 共 35个循环, 最后在 72延伸 10min。PCR产物用8%的凝胶工作液电泳分

32、离, 银染显色（其8%的凝胶工作液和银染试剂的配制见表1、2）。8%的凝胶工作液配制成分/溶液体积 20406080100超纯水/ml 142842567010×TBE/ml 24681040%贮液/ml 48121620TEMED/l 2040608010010%AP/l 2004006008001000（注：TEMED作用是促进凝固，应先加，AP作用是凝固，应后加）银染过程药品配制成分/溶液体积ml100150200250300硝酸银/g0.20.30.40.50.6显色液氢氧化钠/g1.52.2533.754.5甲醛40%/ml11.522.531.3.3 数据统计SSR扩增产

33、物以0、1、2建立数据库，在相同的标记位置上， 抗蚜的条带标记为1，感蚜的条带标记为0，具有双亲的杂合体条带标记为2，没有条带或者模糊不清的条带忽略不计（记为*），其中鉴定结果B表示感蚜， A表示抗蚜。根据赵雪梅，刘太峰，李云静等人用人工去雄方法，利用抗蚜x感蚜、耐蚜x感蚜、感蚜x感蚜等组合的杂交后代和回交后代，对高粱品种抗蚜的遗传规律进行研究。结果表明，高粱的抗蚜基因对感蚜基因表现显性，受主效单基因控制8。因此在存在杂合体的引物中，以抗蚜为表现性状。2结果与分析2.1 模板 DNA 质量检测用紫外分光光度计对提取的 DNA 进行检测, OD260/OD280的比值处于 1.691.92 之间

34、, 表明提取的 DNA样品纯度比较高, 少部分 DNA 样品有轻微的蛋白质或 RNA 污染。2.2 多态性引物的筛选图1：亲本引物条带电泳结果根据上述两亲本间多态性引物的筛选结果和观察，表明：所扩增的条带清晰、分辨率高、重现性好、多态性强，是较适宜的扩增体系（见下图1）。2.3数据结果统计株系编号sb6m3174sb6m3500sb6m3610sb6rj2776sb6rj2880引物G5-Q-5表型调查鉴定结果1000200AA2000000BB3111111AA402*000AA50002*0AA6000000BB7000011AA811*111BA9220220AA11111111BA12

35、220220BA13000200BA1410*111BA15010000AA16010000AA17000000BB18000000AB19111111AA20111111BA21000000AB22020200BA23000200AA24220222BA25110110AA26000000AB27000000BB28111111AA29212212AA30111111BA31000200BA32220220AA33111111AA34111111AA35000200AA36000200BA37111112BA38111111AA39000000AB40000000AB41000000BB42

36、000200BA43111111AA44000200AA45101110BA46101220BA4720*2*0AA48111110AA49200200BA50000000AB51020200BA52000000BB53000000BB54210210AA56000000BB57110000AA58000000BB59000000AB601*111AA61000000BB6210*111AA63000000BB64210000BA65010000BA66010000AA670*1*BA68000000BB690001*0BA701011*1AA71110000BA720100*0AA73000

37、000BB74000000AB75000000AB76111111BA77200220AA78111111AA79210220AA80000000BB8200*2*0BA8300*000AB84111111BA8511*111AA86111111AA87000000BB88000220AA89000000BB90210220AA910000*0BB92000011BA94*00210BA96000000BB98000000BB99000000BB1000000*0BB101000000BB102000000BB103000000AB104000200BA108000000BB109111111

38、AA110111211BA111000000BB112000000BB113000000BB114000000BB115111111AA116000000BB117220220AA118000000BB121000000BB122111111BA123000000AB124000000BB12520022*AA1270000*0BB128000200BA129200220AA130200220AA13211111*AA133000200BA134000000BB135000000BB137200222AA138000000BB139000000BB140111111AA141000000BB1

39、42000000BB143000000BB144000000BB2.4 抗蚜鉴定结果通过对高粱中这5对引物以及对高粱群体田间表型的调查，田间表型调查结果中有表现抗蚜的有59株，感蚜的有85株。在对引物进行凝胶电泳后的结果鉴定中，可以发现其中植株表现为抗蚜的有79株，感蚜的65株。用Mapmaker对分析结果进行计算, 用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距(见图4)。结果显示, 表型抗蚜具有与抗亲一致的分子标记，能够用分子标记对高粱重组自交系群体进行抗蚜性鉴定。图4：分析连锁图图2：田间调查时观察到高粱叶片的抗感情况图3：凝胶电泳结果条带3讨论在凝胶电泳的结果和田间表型调查作比较，发现一些

40、存在有抗性基因的植株，在表型上却表现为感蚜，而另外一些具有感蚜引物的植株，却表现为抗蚜，其可能原因分析如下：3.1高粱植株的物理性状与抗蚜性的关系通过田间调查和室内分析 ,研究了不同基因型高粱对高粱蚜的抗性及其与高粱物理性状间的关系。结果表明 ,高粱的抗蚜性属显性遗传。高粱抗、感基因型间的蜡质含量、叶片颜色、叶片表面结构均存在差异。抗蚜品系的蜡质含量和叶绿素含量均低于感蚜品系 ,并且叶片表面光滑 ,细胞排列整齐致密12。因此某些叶片蜡质层含量高的3.2 不同温度下对高粱植株抗蚜性的影响在高粱蚜虫大发生时期，由于蚜虫繁殖量较大，会对高粱植株造成严重危害，某些抗蚜的植株也可能会由收到危害。随着气温

41、的升高，从5月下旬开始田间高粱苗陆续出土并见长。同时在越冬寄主上的有翅蚜向高粱田迁移，迁移时间能一直持续到7月上旬，但尚有一部分高粱蚜居留于狄草上。在东北地区，高粱蚜是高温干旱条件下发生严重的害虫，自6月中旬至7月中旬，平均气温在22-29，旬平均相对湿度在55%-75%，温度系数（旬雨量/旬平均气温）大多在1以下，是大发生的主要条件。3.3 高粱抗蚜性基因的表达受环境的影响性状表现是遗传因素和环境因素综合作用的结果，用Cry1Ab/Cry1Ac板式试剂盒测定了不同光照时间、不同温度和不同水平氮肥处理下,Cry1Ab蛋白在转基因高粱中的表达水平。结果表明,不同光照长度处理的Cry1Ab蛋白含量

42、有较大差异,其顺序为12 h16 h18 h14 h10 h;不同温度处理对Cry1Ab蛋白含量也有较大差异,为2530203540;不同施肥水平下对Cry1Ab蛋白量也有较大影响,作基肥的以300 kg.hm-2纯氮效果最佳15。3.4 人为因素对实验结果也具有很大方面的影响SSR标记包括PCR和电泳检测。安全进行PCR的前提是保证模板、使用物品的无污染和操作规范，针对不同作物的不同试验要求，建立相适应的PCR反应体系，又是取得试验成功的关键。PCR反应有几个关键环节：模板DNA的纯度和数量；引物的质量与特异性；酶的质量与数量；Buffer（Mg2+）数量；PCR循环条件9。因此在进行抗性鉴

43、定实验过程中一定要特别注意这些步骤的操作。而且实验材料的选择是在株系群体中选择的，应避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠最好是一次性的，如果是反复使用小钢球，必须彻底清洗干净。使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒10。以及在使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使用样品磨成粉末状。3.5其他因素的影响通过田间人工接虫、田间调查和室内生化分析研究了不同高粱材料对蚜虫的抗性及其与次生代谢物的关系。结果显示，高粱抗蚜虫性状属单基因

44、显性简单遗传，通过回交转育方式容易获得抗性基因。高粱抗蚜虫性状与植株体内多酚氧化酶活性及丁布（DIMBOA）含量间的关系表现出年度间的差异，有时抗性与感性材料间的多酚氧化酶活性和丁布含量都不表现质的不同，说明另有更重要的次生代谢物实际控制着高粱的抗蚜性状11。另外由于时间原因，所分析的引物较少，以及实验材料播种时，品种混杂等因素，也可能对实验结果造成一定的影响。4 结论（1）高粱抗蚜性状的表达主要是遗传基因的影响，具有抗蚜性基因的植株在田间调查具有明显比不抗蚜的植株受危害小（见图2）。（2）在对高粱重组自交系群体的6对引物分析以及通过田间表型观察结果作比较，利用MAPmaker软件进行作图比较

45、，可以知道田间表型鉴定与分子标记的鉴定结果一致。（3）采用分子标记技术，对高粱的抗病虫基因进行定位，可以实现实验室对抗病虫的选择，免去了田间复杂的选择步骤，节省了育种时间。（4）由于时间原因，本试验存在缺陷，需要多做几个重复对结果进行验证。参考文献：1 常金华,夏雪岩,张丽,李荣改,刘国庆,罗耀武.高粱抗蚜基因的遗传分析和SSR标记定位.草业学报,2000,15(2):113-118.2 常金华, 张丽, 申书兴, 马峙英 不同基因型高粱的理化特性与抗蚜性的相关性研究 植物遗传资源学报 2008, 9 (1) 3 邹剑秋;李玥莹;朱凯;等高粱丝黑穗病菌号生理小种抗性遗传研究及抗病基因分子标记.

46、中国农业科学,201043（4）:713-720.4 余传涨 ,翟国伟,邹桂花,等. 41个高粱品种遗传多样性的SSR标记检测J.江苏农业学报, 2010, 26(2): 248-253.5 曾莉娟, 郑成木. SSR 技术及其应用 J .热带农业科学, 2001(3):56-59.6 薛薇高粱抗蚜基因的定位及分子标记辅助选择的研究D.河北农业大学，2009:3-6.7 刘国庆,颜辉煌,傅强,等.栽培稻中抗褐飞虱基因的遗传定位J.科学报,2001,46(9):738-742.8 赵雪梅，刘太峰，李云静. 高粱抗蚜遗传规律研究初探.吉林农业科学,200429(5):7-8,11.9 夏雪岩, 常

47、金华, 罗耀武, 李荣改, 刘国庆. 高粱抗蚜虫SSR体系的建立.河北农业大学学报,2004(5)，27（3）10戴剑;吴燕.SSR分子标记实验操作注意事项.江苏省农业科学院粮食作物研究所 2011（11）：3011 Catherine S K, Andrew H P, Geoger L T,etal. Molecular analysis of Sorghum resistance to the Greenbug(Homoptera:Aph-idae)J. Journal of Economic Entomology, 2002,95(2):448-457.12 常金华,张丽,夏雪岩,李荣改,罗耀武,刘国庆. 不同基因型高粱植株的物理性状与抗蚜性的关系. 河北农业大学学报2004年第4期13 黄瑞冬;马鸿图;吴琼;王春慧;关欣;贾永旭. 高粱抗蚜虫性状与次生代谢物关系的研究沈阳农业大学学报, 1998年04期 14 张影;郭文静;张伟.高粱蚜及其防治.吉林农业.2005年08期