OCT4 介导的人羊水干细胞重编程【推荐论文】

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1、精品论文OCT4 介导的人羊水干细胞重编程秦明德，梁含思（苏州大学江苏省干细胞与生物医用材料重点实验室，苏州21，5000）5摘要：羊水干细胞（AFS）是一种干细胞生物学特征介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干 细胞，因此理论上的 AFS 可以更简单、高效的重编程为 iPS。为了进一步简化编程过程中，通过单因子法构建的 iPS 有待进一步研究。这里报告 OCT4 通过外源性表达能够独立诱导重 编程人 AFS 为 iPS 细胞。其中单因子人 AFS-IPS（AIPS）细胞像人胚胎干细胞表达类似的10全基因表达谱，后生状态，畸胎瘤的形成以及在体外和体内的多能性。我们的研究结果表明， 转录因子 OCT

2、4 是必要的和足够直接重新编程人类干细胞多能性。单因子 AFS-iPS 细胞的生成会产生病人特异性多能干细胞，无癌基因作为转基因，简化编程，进一步推动该领域的了 解重编程过程。关键词：羊水干细胞；诱导多能性干细胞；重编程15中图分类号：Q254文献标志码：ADirect reprogramming of human amniotic fluid stem cells byOCT4QIN Mingde, LIANG Hansi20(Soochow University,Jiangsu Province Key Laboratory of stem cells and biomaterials,

3、Suzhou,215000)Abstract: Amniotic fluid stem cell (AFS) is a kind of fetal stem cell with the stemness of between embryonic stem cell and adult stem cell, thus theoretically AFS is more easier and efficient to be reprogrammed into iPS. In order to further simplify the reprogramming process, the25cons

4、truction of AFS derived iPS by single factor remains to be studied. Here we report the generation of one-factor human iPS cells from human AFS cells by ectopic expression of OCT4 alone. One-factor human AFS-iPS (AiPS) cells resemble human embryonic stem cells in global gene expression profiles, epig

5、enetic status, teratoma formation as well as pluripotency in vitro and in vivo. Our results demonstrate that the transcription factor OCT4 is is required and sufficient to30directly reprogram human AFS cells to pluripotency. One-factor AFS-iPS cell generation will produce patient-specific pluripoten

6、t stem cells without oncogenes as transgenes, simplify theprocess of reprogramming that advance the field further towards understanding reprogramming.Key words: Amniotic fluid stem cell; Induced pluripotent stem cells; Reprogramming350引言诱导多能干细胞（iPS）细胞可由小鼠 1 2 和人类体细胞表达胚胎干细胞关键转录因子 获取，它提供了特定病人的 iPS 细胞疾

7、病模型和细胞替代疗法1-4。重编程的分子机制还不完全 清楚，因为在重编程过程中的几个不确定因素，如外源性基因所需数量，诱导靶细胞的异质性。 人类 iPS 细胞的临床应用需要避免癌基因 c-Myc 和 Klf4 5 的使用，在宿主的基因组，如 c-myc40癌基因的活化会导致小鼠嵌合体形成肿瘤 4 。为了简化，避免重编程因子作为转基因，单因子 OCT4 能够将小鼠 6 和人类神经干细胞 7 重编程为 iPS。羊水已知含有多种来自胎儿发育中 的细胞。据报道，从人类羊水细胞可以被重新编程为 iPS。利用四因子重编程系统，人羊水来源 的细胞可以快速有效地诱导出多能性 8 ；不使用癌基因人羊水细胞可由二

8、因子（Oct4 和 Sox2） 重编程为 iPS 9 。最近，一种新的人羊水干细胞（AFS）已被分离 10 。这种干细胞尽占 1%45的总细胞数，其表达干细胞因子受体 c-kit（CD117）。AFS 一种干细胞生物学特征介于胚胎干基金项目：教育部博士点新教师基金（20093201120011）作者简介：秦明德（1978 年 3 月），男，副教授，干细胞生物学. E-mail: qinmingde- 8 -细胞（ESC）和成体干细胞的新型多能干细胞，表达标志物 OCT4，SOX2，NANOG 和 SSEA-4。 因此认为 AFS 可由单因子 OCT4 重编程为 iPS。1 材料与方法501.1

9、 标本来源羊水标本来自苏州市市立医院，受试者（19-21 周妊娠）同意并在苏州大学第一附属医院 和苏州市市立医院伦理委员会审查1.2 主要实验材料和仪器特级胎牛血清(GIBCO 公司)；KnockOut 血清（GIBCO 公司）；DMEM/F12 细胞培养基55（Hyclone 公司）；FGF-based（PEPRO TECH 公司）；非必需氨基酸（GIBCO 公司）；四 型胶原酶（SIGMA 公司）；慢病毒 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc（本实验室构建）；抗 CEA、 SSEA3、SSEA4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 鼠来源的单克隆抗体（ebiosience 公司

10、）；抗 Oct4， Nanog，SOX2 鼠来源的单克隆抗体（Santa Cruz 公司）；倒置显微镜（Olympus 公司）；EVOS型荧光显微镜（东胜创新生物公司）。601.3 人 AFS 和人胚胎干细胞分离和培养利用细胞表面特异性抗体 c-kit（CD117）, 分离纯化人 AFS。AFS 细胞在 -MEM 培养 基中培养皿中生长含 15%胎牛血清（FBS），1%的谷氨酰胺和 1%青霉素/链霉素（Gibco， Invitrogen 公司，），添加 18%Chang B 和 2%Chang C 培养基（Irvine 科学圣安娜，加利福 尼亚）375% CO2。人类胚胎细胞系 SHhES2

11、金颖教授馈赠 11 ， 生长于 MEF，人类胚65胎干细胞培养基：DMEM 培养基生长（Gibco，罗克维尔，MD）含 20%血清替代品（Invitrogen， 卡尔斯巴德，CA），谷氨酰胺 1 毫米，0.1 毫米 -巯基乙醇，0.1 毫米的非本质的氨基酸，50 U / ml 青霉素加 50g/ml 链霉素和 4 毫微克/毫升 bFGF（Invitrogen 公司）。1.4 AFS 重编程单因子和二因子 iPS慢病毒生产：编码人类 EF1 载体 Oct4 和 Sox2 基因（教授雷肖 12 ，上海生物科学研70究所），使用 lipod293II（signagen，盖瑟斯堡，MD，www.sig

12、nagenlabs。com）共转染缺陷 辅助质粒转染 293T 细胞。含病毒上清转染后四十八小时，病毒转导，2104 羊水干细胞接种于 6 孔板。在细胞扩散以及培养皿，四种病毒的混合物加入。24 小时后，更换培养液与 新鲜 AFS 培养三天后细胞进行第二轮感染，可以获得了 98%以上的感染效率。第二轮感染的人类干细胞在培养皿中培养无 AFS 60mm 的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞。直到细75胞变小（约两个星期），圆形和簇状生长，细胞接种在 MEF 细胞二三周人胚胎干细胞培养 基培养皿 100mm。与典型的 ESC 细胞形态的殖民地（高细胞核向细胞质比）的出现和扩大。1.5 羊水干细胞及羊

13、水干细胞来源 iPS 鉴定羊水干细胞及羊水干细胞来源 iPS 鉴定包括：流式细胞仪分析，流式细胞仪在 FACScan80流式细胞仪进行（贝克曼 Coulter，CA）。单克隆抗体：CD29，CD73，SSEA-3 和 SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81（eBioscience，San 迭戈，CA，www.ebioscience。com）；CD90，CD105，CD106 和 CD45（BioLegend，San 迭戈，CA，www.biolegend。com）；CD34（BD pharmingen，San 迭戈，CA，www.bdpharmingen。org）；CD133（美天旎

14、生物科技，）。抗体稀释至供859095100应商推荐的浓度（1 克/毫升）。RT-PCR 分析，使用 RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司）根 据制造商的指示。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），thermoscript RT-PCR（Invitrogen）被 用来从 1g 总 RNA 合成 cDNA。进行 PCR 反应混合 1 cDNA 模板 L，250 nm 的每个引物，200M dNTP 混合，和 1 U Taq DNA 聚合酶在体积为 20L。免疫荧光染色，4%多聚甲醛 30分钟固定， 0.1%的 Triton-X-100 PBS 室温（RT）5 分钟穿透，3% BSA 30 分钟封

15、闭。所有 抗体稀释后 4C 过夜反应： Oct4，Sox2 和 Nanog（圣克鲁斯，圣克鲁斯，CA，www.scbt。com）；SSEA-3 和 SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81（eBioscience，San 迭戈，CA，www.ebioscience。com）二抗（抗兔 Cy3，杰克逊 immunoresearch，1 / 200）孵育 1 小时，DAPI 细胞核染色为3 分钟。 BX-60 荧光微镜（奥林巴斯，索撒尔，米德尔塞克斯郡，英国，HTTP：/ /www.olympus。），AxioCam 数码相机拍摄及图像分析。基因芯片和 DNA 甲基化分析，全 基因表达分析

16、使用 Affymetrix 公司的人 U133 Plus 2 阵列芯片。Sequenom epityper 法用于分析 Oct4，Sox2 和 Nanog 启动子区域 DNA 去甲基化。三份生物学重复样品：人 AFS，1F，2F 人 AIPS 和人类胚胎干细胞（SHhES2）。实验和分析均在北京博奥生物有限公司完成。 畸胎瘤的形成，AiPS 细胞株 1x106 细胞联合小鼠 Matrigel 胶注射到 NOD-SCID。六到八周后，畸胎瘤取材，苏木精-伊红染色。2 结果2.1 人羊水干细胞分离及鉴定105110流式细胞仪分析人 AFS 的表面分子表达情况（图 1A）。所有 17 株人 AFS

17、细胞系具有相似 的结果。AFS 细胞的血细胞系标志物（CD45 阴性），内皮细胞标记物（CD106）和造血干细 胞（CD34，CD133）为阴性。然而，AFS 间充质和神经干细胞的表面标志物为阳性，包括 CD29（透明质酸受体），CD73，CD90 和 CD105（Endoglin）。人胚胎干细胞特异性表面标志 SSEA-4 弱阳性，但 SSEA-3，TRA-1-60，TRA-1-81 为阴性。流式细胞仪分析说明人 AFS 是一种介于 胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞。为了探讨 1F 和 2F AIPS 构建的可能性，比较了 ESC用于 iPS 重编程的几个标记基因的表达，在人 AFS 和人

18、胚胎干细胞（图 1b）。数据从 RT-PCR显示 c-myc、Rex-1 、Oct4 和 Nanog 表达较强；，中度表达的有 KLF4； AFS 细胞系中 Lin28阴性表达，SOX2 为部分细胞系表达。人 AFS 表达关键重编程因子，因此理论上人 AFS 可以使 用单因子或者二因子重编程为 iPS。115120125图 1。人干细胞标志物的表达。（一）表面抗原的表达是通过使用小鼠单克隆抗体的流式细胞仪进行（填充曲线）。所 有实验采用同种对照抗体（未填充曲线）。抗原测试，包括：CD73，CD90，CD105，CD29，CD34，CD133，CD45，CD106，SSEA-3和 SSEA-4，

19、TRA-1-60，TRA-1-81。（b）RT-PCR 对 AFS 和胚胎的五种细胞系（阳性对照）分析，检测基因为 Oct-4，Nanog，SOX2，KLF4，c-myc，REX1，Lin28。2.2 羊水干细胞来源单因子和二因子 iPS 构建及鉴定130在羊水干细胞来源 iPS 构建中采用了单因子和双因子诱导的方法（图 2A）。AFS（约 20000 个细胞）感染于（在 EF1 慢病毒载体 Oct4 基因），以及 1:1（在 EF1 慢病毒载体 Oct4 和 Sox2 基因）在 AFS 培养基中，98%以上的感染效率。本研究中测试三株 Sox2 阳性 AFS 细胞系，在 OCT4 单因子实验

20、中由七个类胚胎干细胞克隆中成功地建立了四株 iPS（重编程效率 0.0066%） 以及 Oct4 和 Sox2 二因子实验（重编程效率 0.03 %）。为了排除胚胎干细胞培养基长期培养诱 导 iPS 的可能性，细胞在胚胎干细胞培养基中连续培养超过 6 周，未见胚胎胚胎干细胞样克隆， 大多数 AFS 细胞自发分化为成纤维细胞样。135140RT-PCR 分析了这些 iPS 细胞中全能性标志基因和重编程因子基因在 mRNA 表达水平的表 达情况（图 2B）。1F 和 2FAIPS 细胞表达人类胚胎干细胞标志物，包括内源性 Oct4 和 Sox2 的表达提高；Nanog，KLF4 和 Lin28 表

21、达增加。免疫荧光染色显示，1F AIPS 表达 ESC 转录因子 OCT4，SOX2，NANOG；人胚胎阶段特异性表面标记：SSEA3，SSEA4，TRA-1-60，TRA-1-81（图 2C）。为了探讨人 AIPS 细胞染色体是否有异常，细胞遗传学分析中在重编程后1F 和 2FAiPS 维持了正常的核型。排除了由于在实验室污染，iPS 细胞来源于人胚胎干细胞的 可能性，人 AFS 基因型（46，XX）人的 AiPS（46 XX）和细胞 SHhES2 细胞（46 XY）被确认，进一步验证 AiPS 细胞的身份（图 2A）。145150图 2。AiPS 细胞构建及鉴定。（一）低倍镜下羊水细胞形态

22、（a）CD-117；阳性 AFS 在低倍镜下（b）；1F AiPS 典型未分化人类胚胎干细胞样克隆（c）和高倍镜（d）。病毒感染六周后，在培养皿中放大显示 1F AiPS可以形成；悬浮类胚体（f）和人类 1F AIPS 基因型（46）(g）250M.（B）AFS RT-PCR（阴性对照），1F AIP AiPS，2F 和人胚胎干细胞（阳性对照），使用的引物对内源性 Oct4，Sox2 基因，KLF4，c-myc，REX1 和 Lin28。（C）免疫细胞化学分析的多能性及表面标志（OCT4，SOX2，NANOG，SSEA3，SSEA4，TRA-1-60，TRA-1-81）1 AiPS.。250M

23、.2.3 全球基因表达分析人类 AiPS 和 DNA 甲基化分析155利用基因芯片（Affymetrix 人类 U133 Plus 2）比较了人 AFS，1F，2F AIPS 细胞以及 hESC， 进行了全基因组基因表达分析。一个热图显示， 1F 和 2F AiPS 细胞全基因表达情况基本类似 于人类胚胎干细胞，但不同于亲代的 AFS（图 3A，左图）。与此相一致，聚类分析表明，1F 和 2F AiPS 细胞集群类似于人类胚胎干细胞但不同于亲代人 AFS（图 3A，右图）。散点图分析 表明，1F 和 2F AiPS 细胞高度相似于人胚胎干细胞，明显区别于 AFS（图 3B）。因此，全基 因表达

24、谱揭示了人 AiPS 细胞和人胚胎干细胞之间的相似程度高。结果表明，单因子 Oct4 或者 双因子 Sox2/OCT4 能够使 AFS 完成重编程。160165为了确认重编程后细胞的外源再塑性，Sequenom EpiTYPER 实验分析了 OCT4, SOX2 和NANOG 启动子区域 DNA 甲基化程度（图 3C）。同胚胎干细胞类似 3 个胚胎干细胞关键转录因子区域都高度去甲基化。一个单一的转录因子 Oct4，可以重新编程人类 AFS 为在分子水平 上对人类胚胎干细胞非常相似的 iPS 细胞。有意思的是，在 AFS 的 SOX2 的启动子去甲基化水 平比 ESC 更高。然而在 AFS 中

25、Sox2 mRNA 表达弱或阴性。为了确认发现，我们设计了不同 的引物检测 Sox2 基因启动子区域， 得到了相同的结果。可能，Sox2 基因启动子区的开放而 Sox2 mRNA 的表达仍被某种未知机制控制着。170175图 3。AiPS 全基因表达谱和 DNA 甲基化分析。（A）热地图（左）和聚类分析（右）比较了 AFS ,AiPS 和 胚胎干细胞的全基因组分析。（B）散点图比较胚胎干细胞关键转录因子在 AFS ,AiPS 和胚胎干细胞中的表达 情况（B）。（C）Sequenom EpiTYPER 分析了 Oct4，Sox2 和 Nanog 启动子区域 DNA 的甲基化程度。黄色的圆 圈代表

26、 CpG 岛，而蓝色的圆圈代表 CpG 岛甲基化。2.4 AiPS 在体外和体内的多能性分析180类胚体的形成的自分化和定向分化实验证明了 1F 和 2F AiPS 的体外分化全能性（图 2A）。 EB 分化过程中，AiPS 细胞分化为泡状结构且具有多种类型的细胞。RT-PCR 分析证实三种胚 层和滋养层表达的标记物，包括内胚层（PAX6 和 AFP），中胚层（ANP 和 BRACHYURY）， 外胚层（Nestin）和滋养外胚层（CDX2）（图 4A）。在 AiPS 细胞体内多能性的评价中，它们被移植到 NOD-SCID 小鼠皮下。注射 6-8 周后，1F 和 2F AiPS 细胞产生了含有

27、所有三个胚层的畸胎瘤，其中包括内胚层（肠上皮细胞），中胚 层（软骨）和外胚层（神经上皮，复层鳞状上皮）（图 4B）。为了排除在 AFS 细胞能够形成畸胎瘤的可能性，AFS 细胞同时进行了畸胎瘤实验，超过 2 个月的观察并未见畸胎瘤形成。185190图 4。AiPS 细胞体内外分化能力分析。（A）RT-PCR 比较分析三胚层及滋养层标记物在 EB 中的表达情况。（B）畸胎瘤切片，苏木精-伊红染色。识别的细胞代表所有三个胚层组织切片：i 肠上皮细胞(内胚层), c 软 骨(中胚层)和 n 神经上皮和 k 角化的复层鳞状上皮(外胚层)显示组织放大用箭头标出，*显示小鼠骨骼肌， 比例尺，100M.3

28、讨论195这项研究表明，Oct4 单因子足以直接重新编程 AFS 的多能性。1F AiPS 多能性标志物的表 达情况类似于胚胎干细胞。AiPS 不仅可以有效地体外分化为所有三种胚层细胞，而且它们也能 够在体内形成畸胎瘤。由于成功的 AiPS 重编程 Oct4，Sox2 和 Nanog 启动子区域去甲基化水平 提高至人胚胎干细胞的水平；AiPS 中几个关键转录因子内源性表达提高并接近胚胎干细胞水平； 大多数 AiPS 细胞传代超过三十五代，仍然保持其正常核型。200205起始细胞 AFS 内源性表达 SOX2, NANOG, c-MYC, KLF4 和 OCT4。因此理论上 AFS 会像 神经干

29、细胞一样只需要 OCT4 单因子即可完成重编程。脊椎动物的神经嵴是一个全能性胚胎细 胞群的神经管闭合在神经板的横向脊衍生。神经嵴细胞分散于神经管的背表面和广泛通过胚胎迁 移，从而产生分化各种各样细胞类型。在这个迁移阶段，NSC 可以呆在羊膜腔或成为部分羊水 干细胞 13 。此外，羊水中有巢蛋白阳性细胞的一个亚群（10%），一个更小的 AFS 细胞 亚群 CD117 阳性细胞1%）表达多潜能标记。SOX2 阳性 AFS 细胞表现出神经元样表型的分 化能力，如 MAP2 表达神经元标记物 NSE 和 NFL 14 。总之，有一小部分 NSC（10%）在 我们的 CD117 阳性的干细胞，也许这一小

30、部分细胞是 AFS 中能够单因子重编程为 iPS 的供体 细胞210减少构建 iPS 所需因子数目，具有十分重要的意义。首先，在编程过程中 1F AIP 避免使用c-Myc 和 Klf4 致癌基因。iPS 细胞可以没有 c-myc 基因3,5感染产生。KLF4，另一个致癌基因， 可能导致肿瘤形成的后代。其次，减少的因子使用的数量同时减少的逆转录病毒整合时诱变的机会。最早的 4 因子 iPS 细胞显示了 20 多个逆转录病毒整合位点 3，15 。第三，由于重编程过 程中所需多个外源性基因，导致了具体重编程的分子机制还不完全清楚。综上所述，AFS 单因子 iPS 研究为 iPS 机制研究提供了新的

31、途径。4 致谢215感谢 Anthony Atala 教授在 AFS 分离培养中的建议；雷肖教授提供慢病毒载体；金颖教授 提供人 ESC 株（SHhES2）。这项工作是由教育部博士点新教师基金（20093201120011）资 助完成。220参考文献2252302352402452501 Takahashi, K and Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and AdultFibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006，126, 663-

32、676.2 Yu,J.etal. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007，318, 1917-1920.3 Wernig, M., Meissner, A., Jaenisch, R. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotentES-cell-like state. Nature 2007 448, 318-324.4 Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong,

33、 H., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008 322, 949-953.5 Huangfu, D., Maehr, R., Guo, W., Eijkelenboom, A., Snitow, M., Chen, A., and Melton, D.A. Induction ofpluripotent stem cells by defined factors is greatly improve

34、d by small-molecule Compounds. Nat. Biotechnol.2008 26, 795-797.6 Kim, J.B., Sebastiano, V., Wu, G., Sasse, P., Gentile, L., and Scholer H.R. et al. Oct4-Induced Pluripotency inAdult Neural Stem Cells. Cell 2009 136, 411-419.7 Kim, J.B.,Greber B, Marcos J. and Scholer H.R Direct reprogramming of hum

35、an neural stem cells by OCT4. Nature 2009 461, 649-653.8 Chunliang Li , Junmei Zhou , Guilai Shi , Yu Ma , Ying Yang , Junjie Gu Hongyao Yu , Shibo Jin , Zhe Wei ,Fang Chen , Ying Jin, Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. HUMAN MOLECULAR GENETICS

36、, 2009 18 (22): 43409 Lin Ye , Judy C. Chang , Chin Lin , Xiaofang Sun , Jingwei Yu , and Yuet Wai Kan. Induced pluripotent stemcells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. PNAS, 2009 vol. 106 no. 24:9826-9830.10 Copp

37、i, P. D., Bartsch, G., Atala, A. et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat.Biotechnol. 2007 25, 100-106.11 Chunliang Li, Ying Yang, Xiaowei Lu, Yijuan Sun, Junjie Gu, Yun Feng and Ying Jin. Efficient derivation of Chinese human embryonic stem cell lines from frozen

38、 embryos. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIOLOGY. 2010 Volume 46, Numbers 3-4, 186-191.12 Liao, J., Cui, C., Chen, S., Ren, J., and Xiao, L., et al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cell Lines from Adult Rat Cells. Cell Stem Cell 4, 11-15 (2008).13 D. Huszar, A. Sharpe and R. Jaenisch. Migr

39、ation and proliferation of cultured neural crest cells in W mutantneural crest chimeras. Development 1991 112, 131-141.14 A. Jezierski., M. Sikorska and M. Bani-Yaghoub et al. Probing Stemness and Neural Commitment in HumanAmniotic Fluid Cells. Stem Cell Rev and Rep 2010 6:199-21415 Aoi,T.,Yae,K.,Nakagawa,M.,Ichisaka,T.,Okita,K.,Takahashi,K.,Chiba,T.,and Yamanaka, S. . Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2008 321, 699702.