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1、橡胶树多主棒孢病菌Cassiicolin基因条形码数据库构建及分子检测技术LIBoxun，LIUXianbao，FENGYanli，XIEHuiting，HUANGGuixiu*EnvironmentandPlantProtectionInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonTropicalCrops，MinistryofAgricultureandRuralAffairs/HainanKeyLaboratoryforMonitoringand
2、ControlofTropicalAgriculturalPests，Haikou，Hainan571101，Chinaandcontrolstrategies.;Cassiicolingenes;DNAbarcoding;moleculardetection10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.015多主棒孢基因序列对不同寄主植物和地理来源多主棒孢别离物的多样性进行了分析，其中47%供试别离物中检测到Cassiicolin编码基因，可编码6种不同类型的蛋白质，通过定义的Cassiicolin毒素类型使聚类分析结果更加清晰明了。刘先宝等9分析了国内橡胶树多主棒孢Ca
3、ssiicolin毒素的多样性与致病力分化之间的关系，初步获得了橡胶树上多主棒孢的主要毒素类型。因此，在多主棒孢的生理小种尚未确定的情况下，国际上常利用Cassiicolin基因编码的6个毒素类型，来进一步划分多主棒孢病菌的致病型，这也是现阶段研究多主棒孢分类的主要依据。多主棒孢在我国分布较广，为害的作物种类多，研究价值大。而传统的鉴定方法常根据寄主、病斑类型、病原菌的形态特征、培养性状等进行区分，而多主棒孢病菌造成的病斑类型多样，病原菌极容易变异，而且不同类型的多主棒孢菌株的形态特征和培养性状上存在一定的差异。而Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因组中一段公认的、特有的、相对较短的D
4、NA序列，能将多主棒孢与其他真菌进行有效区分、精准鉴定。为此，本研究拟构建多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库，利用该数据库对国内主要热带作物多主棒孢菌株进行鉴定，明确病原菌的遗传结构和优势种群，建立多主棒孢病菌的早期分子检测技术。这对明确我国主要热带作物多主棒孢的种类组成，系统发育与寄主的多样性关系，开掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要意义。材料1.1.1供试菌株287株多主棒孢菌株表1以及用于分子检测的其他病原菌菌株均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带工业原料作物病害研究组别离和保存，其中橡胶多主棒孢275株，其他寄主多主棒孢12株。NCBI数据库
5、下载的多主棒孢Cassiicolin基因信息表2。1.1.2培养基与试剂PDA培养基参照?植病研究方法?配制10，用于多主棒孢菌株的培养。引物表3均由华大基因股份合成;克隆载体pMD18-T、PCR扩增反应试剂购于TAKARA公司;pMD18-T载体、DNA聚合酶、dNTP等购自宝生物工程大连。DNAMaker、Trans5大肠杆菌感受态购自北京全式金生物技术。其他化学试剂均为国产分析纯。1.1.3仪器与设备Bio-RadT100型梯度PCR仪，美国伯乐公司;UVIFireReader凝胶成像系统，英国UVItec公司。方法1.2.1DNA提取、PCR扩增和测序采用CTAB方法11提取病原菌D
6、NA，用超微量分光光度计进行DNA质量测定，用Cassiicolin引物序列表3对病原菌目的基因进行PCR扩增，反应条件参照Don等【5】的方法，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，经OmegaBio-Tek试剂盒进行目的条带回收之后克隆到pMD18-T载体，转化Trans5a大肠杆菌感受态细胞。筛选阳性克隆转化子，送华大基因技术进行序列测定。1.2.2序列分析、遗传距离计算和系统发育树构建将序列在NCBI中进行BLAST分析，利用CodonCodeAlignerV7.0.1去除测序峰图的低质量区域、完成峰图校对拼接和引物序列切除，应用P4.0软件计算种内、种间遗传距离;利用MEGA7.0
7、软件最大似然法中的Tamura-Neimodel构建系统发育树。1.2.3分子检测技术用Cassiicolin引物对供试菌株的DNA进行特异性检测，通过优化反应体系中各试剂用量及退火温度，建立PCR扩增最正确反应条件：反应体系参加量DNA50ng/L1L，特异引物对10pmol/L1L，dNTP2.5mmol/L1L，10Buffer2.5L，酶0.3L，ddHO作为阴性对照。基因条形码数据库的构建根据菌株地理来源、寄主、年份和毒素类型等信息，挑选了287株代表性菌的Cassiicolin基因序列上传至NCBI数据库，构建了国内主要热带作物多株棒孢的Cassiicolin条形码数据库表1。基于
8、NCBI公共数据库已公布的多主棒孢Cassiicolin基因信息，分别使用BLAST方法和MJ系统发育树法与NCBI数据库已公布的多主棒孢Cassiicolin条形码序列进行比对，共同构建系统发育树图1。结果发现，供试的多主棒孢菌株与NCBI已公布的多主棒孢Cassiicolin序列同源性均高达99%，第大類群是Cas5型，均为橡胶树多主棒孢，主要来源于云南、海南、广东、广西等国内橡胶主产区，还有局部菌株来源于越南、柬埔寨、马来西亚。第大类群是Cas2型，是橡胶和其他作物均有的多主棒孢，主要来源于橡胶树、木薯、黄瓜、番木瓜、大豆、棉花等，不同寄主上的菌株亲缘关系近，都聚类到一个分支上。从系统发
9、育树的结果可以看出，不同毒素类型的多主棒孢菌株与寄主来源密切相关，但与地理来源没有明显的相关性，且Cas5型的多主棒孢仅为橡胶树所特有，为我国橡胶树多主棒孢的优势种群。毒素基因的分子检测本研究对我国橡胶主产区以及主要热带作物上别离保存的919株多主棒孢病菌进行Cassiicolin毒素基因检测。发现我国多主棒孢病菌仅存在2种毒素类型，分别是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型的菌株占94.8%，为国内橡胶树主产区多主棒孢病菌的优势种群，且为橡胶树所特有。而Cas2型是橡胶树和其他作物如：番木瓜、木薯、黄瓜等多主棒孢共有的毒素类型，占3.2%。另一局部菌株未检测到Cassiicolin毒素基因
10、，定为Cas0型，占2%，在供试菌株中均未检测到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株图2。用CassiicolinCas5/Cas2引物进行特异性检测，分别对壳梭孢HNrMLXY1601、茄类镰刀菌FsHHNBS04、尖孢镰刀菌Foc4、胶孢炭疽菌Hbcg01、尖孢炭疽菌YN26-2进行分子检测。从图3和图4的扩增检测结果可以看出，-R引物亦如此，具有唯一性说明这两对引物对多主棒孢菌株有较强的特异性，可以用于多主棒孢病菌的分子检测图3，图4。用-R进行引物的灵敏度检测，分别对Cas5型菌株HCcYN49和Cas2型菌株PaCcSD02进行梯度扩增，使其DNA浓度为30ng/L
11、、20ng/L、10ng/L、5ng/L、1ng/L、100pg/L、10pg/L和1pg/L时进行扩增，并设置阴性对照。扩增结果显示，30ng/L100pg/L浓度的多主棒孢病菌DNA均可扩增到约750bp的特征条带，对照物无扩增条带，-R均可以检测到100pg/L及以上浓度的目标基因组DNA，可用于多主棒孢病菌的快速检测图5。左图为特异引物-R的扩增结果。TheleftpictureistheamplificationresultofthespecificprimerCas5-F/Cas5-Randtherightoneistheamplificationresultofthespecif
12、icprimerCas2-F/Cas2-R.1：30ng/L;2：20ng/L;3：10ng/L;4：5ng/L5：1ng/L;6：100pg/L;7：10pg/L;8：1pg/L;9：阴性对照negativecontrol;M：DL2000DNAmarker。DNA条形码是生物基因组中普遍存在的、较短的、标准化的DNA序列，它具有稳定的种内保守性，又包含足够的种间遗传变异，实现了对物种的快速而准确的鉴定12。相比于传统的形态学鉴定，DNA条形码技术不受个体发育阶段、完整性等方面的影响，可以一次性快速鉴定大量的样本，极大的促进了生物分类学、生物多样性以及分子系统学等领域的研究13。Cassii
13、colin毒素基因是多主棒孢基因组中一段公认的、特有的、相对较短的DNA序列，能将多主棒孢与其他真菌进行有效区分，实现精准鉴定。在多主棒孢生理小种尚未定论的情况下，国际上常利用Cassiicolin基因编码的6个毒素类型作为多主棒孢种内和种间遗传结构、种群变化以及致病类型的主要依据14。本研究基于Cassiicolin基因，构建了含287个菌株的国内主要热带作物多主棒孢基因条形码数据库，建立了多主棒孢早期分子检测技术，分析了919株多主棒孢的毒素类型，发现我国多主棒孢病菌仅存在2种毒素类型，分别是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型为国内橡胶树主产区多主棒孢病菌的优势种群，且为橡胶树所特有，
14、而Cas2型是橡胶树和其他作物如：番木瓜、木薯、黄瓜等多主棒孢共有的毒素类型。在供试的多主棒孢菌株中均未检测到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株。据Don等【5】研究发现，Cas1型菌株主要是非洲国家橡胶树和其他作物共有;Cas2和Cas6型菌株来源于国外其他寄主植物非橡胶;Cas3和Cas4型均但Cas2型只有在我国的橡胶树上发现，其他国家的Cas2型只有在非橡胶的其他寄主植物多主棒孢上存在。目前，有关多主棒孢Cassiicolin毒素类型与致病性之间的关系尚未得到广泛的研究，尤其是毒素类型与寄主专化性、致病力强弱、生物学特性、形态学以及病症类型之间的关系值得在今后的研究
15、中深入开展。另外，在多主棒孢生理小种尚未明确的情况下，Cassiicolin毒素基因有助于对多主棒孢潜在的种内或种间遗传进化关系的解析，特别是那些还没有确认Cassiicolin毒素类型的Cas0型菌株，可能是多主棒孢新的种群。DNA条形码分析方法有5种12，本研究采用了系统发育树的分析方法，构建了多主棒孢基因条形码序列的系统发育树，在系统发育树上形成了2个大的遗传类群，分别是Cas5类群和Cas2类群，与分子检测结果一一对应，各分枝与毒素类型相一致。系统发育树的DNA条形码分析法在一定程度上反映了物种的亲缘关系，但由于不完全谱系分类、祖先多态性及物种旁系同源性等原因，某些物种在系统发育树上不
16、能形成单系，但本研究构建的多主棒孢Cassiicolin基因的系统发育树没有出现由于种内遗传距离小，在系统发育树上常形成嵌套关系的现象。而且相比于其他几种DNA条形码的分析方法，系统发育树法摆脱了遗传距离阈值等影响，只考虑序列内部的特征核苷酸，不涉及系统发育关系，在近缘种的鉴定上也表现出一定的优势。通过系统发育树进一步分析发现橡胶多主棒孢单独成为一个类群，与其他寄主的多主棒孢菌株存在明显的差异，但不同地理来源的菌株间无明显差异。致病力分化分析显示9，橡胶多主棒孢菌株不能侵染其他寄主，存在明显的寄主专化性现象，由于多主棒孢病菌寄主范围广，不同毒素类型结构上的差异导致病原菌在致病性和寄主专化性上存在明显差异。综上所述，本研究首次构建了国内主要热带作物多主棒孢Cassiicolin基因条形码数据库，建立了基于Cassiicolin基因的多主棒孢早期分子检测技术，系统分析了我国橡胶树、木薯、番木瓜、瓜菜等主要热带作物多主棒孢的毒素类型，明确了国内多主棒孢的种群结构、优势种群和特有毒素类型。本研究为明确我国主要热带作物多主棒孢病菌的种群遗传结构和优势种群情况，开掘、保存多主棒孢菌种资源以及制定病害的防治策略上具有重要意义。参考文献
橡胶树多主棒孢病菌Cassiicolin基因条形码数据库构建及分子检测技术
