核酸适配体在治疗肿瘤中的的作用

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1、核酸适配体在治疗肿瘤中的的作用 江西理工大学 邹涛摘要:核酸适配体是一类能够特异性地和靶物质结合的寡核苷酸序列。它可作用于蛋白质、金属离子、小分子化合物、细胞膜表面受体等靶标。该寡核苷酸序列可以是RNA也可以是DNA,较其他识别分子而言,适配体具有性质稳定、易合成、易标记、分子量较小和目标分子广泛等优势。其结合能力可与抗体相当甚至更强, 并可结合各种药物及载体构建多元复合靶向给药系统用于肿瘤靶向治疗, 在生物医学领域引起了极大的关注.。关键词:核酸适配体;肿瘤治疗;量子点1990年,Ellington与Szostak及Tuerk与Gold筛选出了能与T4 DNA聚合酶高亲和力和特异性结合的随机

2、寡核苷酸,并命名为核酸适配体(aptamer,Apt),该筛选方法被命名为指数富集的配体系统进化技术(SELEX),原理是首先构建容量巨大的随机寡核苷酸序列库,然后经过多轮结合和洗脱,从中筛选得到能够和靶标物质高亲和力结合的寡核苷酸。核酸适配体是通过折叠形成特定空间结构而与靶标结合,其亲和力可与抗体相当,亲和常数(Kd)可达纳摩尔或皮摩尔水平。近年来,核酸适配体受到科学家的广泛关注,由于其分子量较小、可化学合成、生物相容性好等优点,其在基础、临床、药物开发中的研究不断增多,越来越多的针对生命活动中重要分子的适配体被筛选出来,各种基于核酸适配体的分析方法和技术也有报道,核酸适配体在生物医学、疾病

3、诊疗领域已显示出广阔的应用前景。靶向配体在抗肿瘤药物靶向传递方面有很大的应用潜能,其对靶分子结合的选择性可赋予抗癌药物靶向特异性,同时增加药物在病变组织内的富集。核酸适配体可体外合成且易于修饰,同时因其带负电荷,在体循环中很少参加非特异性相互作用。它们对靶物质可高亲和力并特异性地结合,使其具有高的穿透性。抗肿瘤药物一般都是在细胞内发挥作用,提高药物摄取量是其有效性的关键。 纳米粒子能通过细胞内吞途径进入细胞,如果将核酸适配体连接到纳米粒子表面, 药物靶向肿瘤细胞后,可介导内吞发生,有利于提高药物摄取量,这种给药方式成为目前研究的热点。以下综述了核酸适配体在肿瘤靶向治疗中的研究进展。1 肿瘤标志

4、物 肿瘤标志物(TumorMarker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织,或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量,它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质,借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能,以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。利用它的这一特性,可以筛选出某一肿瘤标志物的特异性适配体,从而靶向肿瘤细胞,达到诊断和治疗的目的。1.1甲胎蛋白 甲胎蛋白(AFP)是肝细胞癌定性诊断中最重要的血清肿瘤标志物。利用SELEX技术筛选出了-AFP特异性的RNA适配体,并发现其适配体能下调AFP诱导的细胞中原癌基因的表达。在AFP相关的肝癌中,这特异

5、性的适配体能够作为有效的诊断或者治疗药物。AFP的异质体AFP-L3是肝细胞癌特异性蛋白,对早期肝癌的诊断、发生预警、疗效及预后判断均优于AFP。 1.2 前列腺特异性抗原和前列腺特异性膜抗原 前列腺特异性抗原(PSA)在正常生理条件下,主要局限于前列腺组织内,在血清中浓度很低;当前列腺病变时,血清中PSA浓度升高。血清PSA已经被广泛用于前列腺癌的诊断、分期及治疗后监测,是前列腺癌早期筛查的重要指标。Savory等筛选得到了较于RNA适配体稳定性更高的DNA适配体,其中适配体PSap4#5对PSA的结合力最高。Chen等构建了适配体PSap4#5与金纳米复合物,被DNA适配体修饰的金纳米不能

6、聚集。而存在PSA时,适配体与PSA结合,使金纳米聚集成较大的粒子,共振光强度增加,利用共振光散射光谱分析来检测血液样本中的PSA。 前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种较前列腺特异性抗原更加敏感和特异的前列腺癌肿瘤标志物,其在前列腺癌和多种实体瘤新形成的血管中会过度表达,而在正常新生血管中无表达。2002年,PSMA的特异性适配体A10第一次报道出来,这些适配体能像抑制剂一样用于临床,也可修饰后靶向到前列腺癌细胞,用于诊断和治疗。Cheng等用聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹紫杉醇,再与适配体A10结合,利用A10对PSMA的特异亲和性,将药物运送到前列腺癌细胞,达到治疗的目的。Min等设了一种通

7、过链霉亲和素相连的双适配体复合物,即能特异性结合PSMA()前列腺癌细胞的DUP-1多肽适配体。将阿霉素(DOX)加载到A10 RNA适配体的茎干区域,使阿霉素能被运输到PSMA细胞,而且能诱导各种类型前列腺癌细胞的凋亡。 1.3 黏蛋白1 黏蛋白1(MUC1)是一种型跨膜蛋白,在多种肿瘤中,MUC1异常表达。Tan等人以MUC1的DNA适配体(Apt)作为载体,构建了DOX-Apt复合物,将DOX靶向到MUC1(+)乳腺癌细胞系MCF-7。DOX-Apt复合物经PEG修饰后,既增加了对MCF -7细胞的特异性杀伤作用又增加了正常细胞的存活率,无显著的细胞毒性影响。另有文献报道将紫杉醇(PTX

8、)与MUC1适配体共价结合到PLGA纳米材料表面,构建了适配体-纳米粒子-紫杉醇复合物。与没有适配体的紫杉醇-纳米粒子复合物相比,前者增加了对MCF-7细胞的药物运输作用和细胞毒性。 将MUC1适配体的cDNA、适配体及QDs组装到金电极表面,构建成一种新型的竞争电化学细胞传感器来识别和检测肿瘤细胞。当靶细胞存在的时候,细胞表面过表达的MUC1能与cDNA竞争性结合配体,导致cDNA和适配体组成的双链DNA变性,从电极上释放出Apt-QDs复合物。用电化学溶出法测量QDs离开电极后的Cd离子浓度,以此来检测靶细胞的存在。通过QDs上的荧光还可以清楚的观察到适配体对靶细胞的识别。 1.4 肌腱蛋

9、白C 肌腱蛋白C是一种细胞外基质糖蛋白,在心脏和动脉损伤、肿瘤血管生成和转移、调节干细胞的行为中有重要作用,在多数实体瘤中高效表达。Hicke等筛选出了肌腱蛋白C的RNA适配体TTA1。TTA1能被肿瘤快速摄取,而在血液和其他非靶向组织中快速清除,用放射性核素标记后,能用于肿瘤成像。Daniels等筛选出了肌腱蛋白C的DNA适配体GBI-10。Chen等将GBI-10共价结合到量子点(QDs)表面,构建成新的荧光QD-Apt探针,能识别胶质瘤细胞表面的肌腱蛋白C,从而能方便的在体外对胶质瘤进行诊断分析。 1.5 癌胚抗原癌胚抗原(CEA)是从结肠腺和胎儿肠中提取出来的肿瘤标志物,逐渐在其他胃肠

10、道肿瘤、肺癌、乳腺癌以及胰腺癌等肿瘤中检测到,已经广泛用于临床研究。Wang等筛选出了能特异性结合人癌胚抗原的DNA适配体,为肿瘤的诊断与成像提供了新思路。 2 适配体与药物结合 2.1 非共价结合 将化疗药物嵌入核酸适配体是一种简单而有效的靶向递药方式。这种嵌入条件通常是温和的,且不需要对药物或配体进行任何化学修饰,药物和核酸适配体都能保持生物活性且能达到高的载药量,这种结合方式中的核酸适配体既是靶向配体又是药物载体。阿霉素(Dox)是一种细胞毒类药物,因其具有平面的四环结构, 从而可以嵌入DNA相邻碱基对之间,研究者利用它的特性,将其嵌入核酸适配体, 进而运送到肿瘤部位。Bagalkot等

11、人将Dox嵌入到核酸适配体A10二级结构形成的双链中,以此来介导Dox靶向肿瘤部位,由于这种结合是物理的相互作用, Dox 和A10的化学结构都没有发生改变,因此不会降低药效。Shieh等人通过简单嵌入光敏剂TMPyP4到AS1411核酸适配体中,用于靶向乳腺癌MCF-7细胞,AS1411 是一个富含鸟苷酸的含有26个碱基的DNA寡核苷酸,它可形成G-四链体结构。 研究结果表明,,AS1411- TMPyP4复合物对MCF-7细胞的光毒性约是TMPyP4的2 倍,且对正常上皮细胞(M10)的光毒性只有TMPyP4 的1/2。2.2 共价结合 药物可经化学修饰形成稳定的酯、胺和二硫键结合至核酸适

12、配体上或通过连接子共价结合。这些共价结合相对稳定,使得药物输送到特定的靶点之前不会被释放。Huang等人将Dox化学共价结合到DNA核酸适配体(sgc8c)上,sgc8c能特异性靶向人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中的酪氨酸蛋白激酶7(PTK),与Dox化学偶联形成一个酸不稳定腙键,在特异性地靶向CCRF-CEM细胞后,偶联物被内吞方式摄取到肿瘤细胞的内涵体内,腙键在低pH下断裂从而释放药物,sgc8c-Dox 复合物CCRF-CEM细胞的毒性为非靶向细胞的6.7倍。Boyacioglu等人则筛选出了新的靶向PSMA的核酸适配体(SZTI01),含有48个核苷酸,他们将其连接

13、成二聚体复合物(DACs),复合物富含CpG位点,并通过可逆连接子共价连接Dox形成DAC-Dox复合物,靶向PSMA高表达的前列腺癌细胞(C4-2)产生细胞毒性,而对PSMA低表达的人前列腺癌细胞(PC-3)毒性很低。 2.3 适配体偶联药物载体 由于核酸适配体可经化学合成,因此可在其末端修饰不同的化学基团,使之与药物载体连接,制备出不同功能的药物传递系统。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种可降解的功能高分子有机化合物,具有无毒、良好的生物相容性和成囊、成膜性能,因其这些特性,成为与核酸适配体结合的重要载体。PLGA纳米粒经过聚乙二醇(PEG)修饰后可显著降低其体内清除率并增强穿透性。

14、PEG 末端经羧基修饰,可以进一步和核酸适配体结合。Farokhzad等人及Cheng等人利用具有羧基末端的PLGA-b-PEG-COOH聚合物包裹多西他赛(Dtxl)制备纳米粒子,再与2-氟嘧啶修饰的A10通过酰胺键共价结合,用于靶向传递药物。体外实验发现,其和LNCaP细胞孵育2h后,相比未修饰核酸适配体的纳米粒子细胞毒性瘤内注射也可以观察到抗肿瘤作用和毒性降低。2008年, Dhar等人合成了PLGA-b-PEG包载顺铂Pt()的纳米粒子,通过将纳米粒表面PEG羧基末端偶联A10靶向LNCaP细胞,该系统结构稳定并可将顺铂以缓释的方式释放。纳米粒对LNCaP细胞的半数抑制率浓度(IC50

15、)值显著低于对PC-3细胞的IC50值,未结合适配体的纳米粒子对LNCaP细胞的IC50为适配体修饰纳米粒子的4.3倍, 说明结合适配体能提高疗效。后来的体内研究表明,其在血液中的滞留时间延长, 并且肾脏铂堆积降低。A10 功能化的PLGA-PEG纳米粒子顺铂用量只有普通顺铂治疗组的0.3倍,表明其在治疗前列腺肿瘤中有显著效果。Kurosaki 等人将质粒DNA (pDNA)和聚乙烯亚胺(PEI)形成复合物,然后再和MUC1适配体偶联用于靶向人肺癌(A549)细胞,发现其比非靶向的纳米粒子细胞摄取作用更显著。Kim 等人发现,支链聚乙烯亚胺(PEI)经PEG修饰可作为抗Bcl-xL基因的小发夹

16、RNA(shRNA)的载体,进一步修饰能靶向PSMA的RNA核酸适配体,同时将Dox插入到适配体形成(shRNA/PEI-PEG- Apt/Dox)共递送复合物,其IC50值低于(shRNA/脂质体+Dox)的简单混合物约17倍,表明核酸适配体介导的共递送抗癌药物和shRNA 能提高对肿瘤细胞的选择性杀伤。该类递药系统合成简单,可生物降解,细胞毒性低,可携带药物种类多,是目前药物载体主要的研究方向。 3 适配体与量子点结合 量子点(QD)是一种半导体纳米晶体,它有着独特的光学性质,在窄发光谱上有宽吸收、高量子产率、荧光不易漂白、耐化学降解作用等特点,在药物传递系统中, QD 则是一种新型的纳米

17、给药系统,功能化的量子点能被抗体、小分子、多肽、适配体等生物分子所修饰,在诊断和治疗方面运用广泛。Savla等人合成了QD和DNA适配体复合物来靶向MUC1过度表达的细胞,该复合物是由pH敏感腙键键合的方法连接Dox与QD,在中性和碱性条件下稳定,在肿瘤细胞内酸性环境快速水解释放药物,从而达到治疗卵巢癌的作用。这种复合物在体内血液循环比游离Dox有更好的稳定性, 且对多药耐药(MDR)细胞有更强的细胞毒性。这项研究也为QD在药物传递系统中的利用提供了新的领域。在人脑胶质细胞瘤细胞膜表面含有细胞外基质蛋白-腱生蛋白C,GBI-10能够与其特异性结合.。Li 等人使用了树枝状聚合物对量子点进行改性

18、修饰,提高其在水溶液中的溶解度。树枝状聚合物修饰的量子点共价结合DNA适配体,可特异性地靶向人脑胶质瘤(U251)细胞。汤进录等利用作为肿瘤细胞识别分子的核酸适配体的高特异性和高亲和力以及作为信号报告单元的近红外量子点(QDs)的高荧光发射强度和低生物背景干扰特性构建了一种基于核酸适配体功能化近红外QDs的新型纳米荧光探针,并进一步结合流式细胞术在单细胞荧光分析方面的高通量 、 简便和快速等优势,建立了一种检测白血病细胞的新方法。以基 于Cell-SELEX技术针对CCRF-CEM人急性白血病细胞筛选的特异性Aptamer sgc8c为模型 , 构建 了sgc8c-QDs探针,其仅需与细胞样品

19、培育30m i n即可实现对缓冲液和血清中靶细胞的简单、快速和高特异性检测。运用的检测原理是,以对靶细胞具有特异性结合功能的生物素化Aptamer为识别单元,以具有近红外荧光发射的链霉亲和素化QDs为信号单元,通过”生物素-亲和素”特异性相互作用构建了Apt-QDs探针。该探针表面的Aptamer可与靶细胞表面的特定受体分子发生选择性结合,将具有高荧光发射强度的QDs带到靶细胞表面,采用流式细胞仪对单个细胞荧光信号进行统计分析,即可实现靶细胞的有效检测。段诺等将核酸适配体识别技术与高灵敏荧光分析方法结合,建立了检测 O T A 的新方法,基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发

20、生变化,导致预先与其互补杂交的 FA M标记短链 DN A 解 离,引起荧光信号发生变化,据此可实现对OTA的 定量检测。 4 核酸适配体的荧光信号检测由于核酸适配体体外合成能够根据实际需要对其进行化学修饰,故可设计在核酸适配体不同部位修饰荧光物质,经修饰的核酸适配体与靶物质结合后荧光物质发出的荧光信号会发生变化,实现靶物质的检测。如在适配体中部适当的位置修饰荧光物质( 如F C M,荧光胺 ),靶物质的结合引起荧光基团周围环境的改变,导致发射光的强度发生改变,产生响应信号,实现靶物质分子的检测。末端修饰荧光基团的核酸适配体,与靶物质结合后分子质量增大,荧光基团的旋转速度急剧变慢,导致荧光的各

21、向异性发生改变。利用这种方法可以设计核酸适配体 荧光探针,实现均相中对适配体与目标分子的相互作用进行实时监测,并且能够高灵敏、高选择地定量检测目标物质。就以凝血酶的检测为例,目前,应用核酸适配体荧光检测蛋白主要是基于适配体与目标蛋白作用后产生的荧光偏振度或荧光强度的改变来检测蛋白.,核酸适配体荧光检测凝血酶也主要采用这两种方式,由于适配体与核酸作用结合后其分子量发生变化,从而引起偏振角度变化,用其检测蛋白,其信号变化范围较小,线性范围较窄,并且荧光偏振对非均相溶液的测定存在一定的局限性。也有人设计分子信标或分子开关与核酸适配体作用,其荧光强度在核酸适配体与目标蛋白结合前后产生变化(主要是由于分

22、子间距离变化产生的荧光猝灭或是分子开关微环境变化产生的自猝灭作用),通过荧光强度的改变量来测定蛋白。徒永华等将一条5端带氨基修饰核酸适配体通过酰胺化反应固定于磁性纳米颗粒上,利用核酸适配体与凝血酶的强结合作用捕捉凝血酶分子,通过磁性分离技术去除杂蛋白干扰。另一条带荧光标记的核酸适配体结合凝血酶的另一位点,用以测定凝血酶的量。其设计的类似三明治结构的传感器,以凝血酶的两条核酸适配体为目标分子识别元件,利用磁性纳米颗粒的磁性分离作用消除了共存蛋白的非特异性吸附影响,在提高测定选择性和专一性的同时,降低了荧光背景,提高了测定的灵敏度,采集到的荧光信号稳定,满足了微量分析的要求。 5 前景与展望随着核

23、酸适配体在肿瘤靶向治疗中的不断研究,基于细胞的SELEX技术是以后的主要发展方向,构建双靶向或多靶向的递药系统,能提高抗肿瘤效果。将核酸适配体形成聚合物或多个核酸适配体构建成纳米器件再嵌入化疗药物,是比较新的递药思路。根据肿瘤的类型、药物的性质可以选择合适的剂型。如何对核酸适配体进行修饰以增加其稳定性,如何筛选具有更高亲和力和新型广谱肿瘤靶向性的核酸适配体,如何提高核酸适配体和药物载体的跨膜性能,探讨核酸适配体的细胞内转运机制及生物学效应,研究其动物体内的代谢动力学、体内稳定性、肿瘤靶向性等将是今后适配体在生物医学领域的研究重点和热点。目前大多数研究还处于基础研究阶段,要把核酸适配体变成药物用

24、于临床还需要进一步确定其有效性和安全性。核酸适配体介导的靶向给药系统虽然不够完善,但随着研究的更加深入和技术的不断完善,核酸适配体将会在疾病的治疗中发挥重要的作用且具有广阔的发展空间。参考文献1. 徒永华;程圭芳;林莉;郑静;吴自荣;何品刚;方禹之 基于核酸适配体的新型荧光纳米生物传感器用于凝血酶的测定 2006(12)2. 李瑜;王源升;于斌;张静秋;董瑞 核酸适配体在光生化检测中的应用 2012(14)3. 段诺;吴世嘉;王周平 核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A 2011(39)4. 汤进录;石慧;何晓晓;王柯敏;李朵;颜律安;雷艳丽;刘剑波 核酸适配体功能化近红外量子点结合流式细胞术

25、快速检测白血病细胞 20145. 刘珍宝;石依倩;陈长仁;段林花;王薪茹 核酸适配体在肿瘤靶向治疗中应用的研究进展 2014(14)6. 李晓佩;杨良嵘;黄昆;李文松;孙西同;刘会洲 核酸适配体在生化分离及检测领域中的进展 20137. 谢海燕;陈薛钗;邓玉林 核酸适配体及其在化学领域的相关应用 2007(6)8. 吕彬 Cell-SELEX技术在肿瘤诊治中的应用进展 20139. 赵娟;顾月清 核酸适配体在肿瘤诊断与治疗中的研究进展 2013(2)The role of Aptamer in the treatment of tumors Jiangxi university of scie

26、nce and technology zoutaoAbstract:Aptamers are a class of oligonucleotides that can specifically bind to targeted molecules, such as proteins, ions, small compounds, and cell surface receptors. This class of oligonucleotides may be DNA or RNA.Compared to other recognition molecules,aptamers are high

27、ly stable,easier to synthesize and modify,smaller in size and specific to a wide range of targets. Their specificity and affinity properties are equal to those of antibodies and can be sometimes be stronger. Aptamers exhibit low immunogenicity and good stability, as well as the ability to conjugate with various drug carriers for the construction of targeted multi-element drug delivery systems. These systems have attracted considerable interest from researchers working in the field of biomedical research.Key words:Aptamers;tumor treatment;QDs 7 / 7文档可自由编辑打印

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