第4章基因操作中大分子的分离和分析

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1、第四章 基因操作中大分子的分离和分析第一节 DNA的分离、检测和纯化第四章 基因操作中大分子的分离和分析一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA原理：由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋质粒提取（一）仪器：操作步骤接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA二、电泳检测（一） DNA的琼脂糖凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺电泳（三）脉冲场凝胶电

2、泳（一）DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度依次为：影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。常用染料EB:溴化乙锭SYBR:由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋提纯和未提纯质粒DNA电泳图 pGFP pBSK M（二）聚丙烯酰胺电泳（三）脉冲场凝胶电泳三、DNA片段的纯化1低熔点琼脂糖凝胶电泳法2透析袋电洗脱法3Glass Milk （bead）结合法第二节 RNA的分离、检测和纯化

3、第四章 基因操作中大分子的分离和分析一、控制潜在的 RNA 酶的活性1溶液和用具的去 RNA 酶处理2RNA 酶抑制剂的使用二、RNA的抽提和纯化1酚 - 异硫氢酸胍抽提法组织RNA的提取：2硅胶膜纯化法三、mRNA的纯化mRNA 的纯化主要是针对真核生物而言的四、RNA的电泳检测RNA 的浓度和纯度可通过测试其OD260 来判断1琼脂糖凝胶电泳电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S，表明RNA未降解Total RNA第三节 分子杂交第四章 基因操作中大分子的分离和分析Southern杂交Northern杂交Western杂交一、Southern杂交DNA杂交RNA DNA

4、 DNA 1转膜2分子杂交3检测非放射性标记、检测M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（lDNA/ d）； 1-3，苏云金芽胞杆菌 YBT-1520 菌株的总 DNA 分别经 、 和 酶切。以 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探针，通过随机引物标记的方式，用 DIG 标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。 二、Northern杂交RNA杂交RNA Northern 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是 RNA 而不是 DNA 设计者为之起了一个与 Sout

5、hern blotting 对应的名称 Northern blotting 三、Western杂交蛋白质的免疫分析蛋白质Western 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似四、其他分子杂交1 原位杂交(in situ hybridization)i. 原位菌落杂交原位菌落杂交ii. 原位噬菌斑杂交原位噬菌斑杂交iii. 原位细胞杂交原位细胞杂交iv. 原位组织块杂交原位组织块杂交原位裂解细胞，不需要分离原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的

6、或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。或蛋白质序列。1）原位杂交样品膜的制备）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜原位菌落杂交样品膜涂布基因组文库或cDNA文库克隆LB+AP37过夜0.5-1mm影印NCFLB+AP37 至0.5-1mmAprCmr扩增质粒(不必要）NCF涂菌Apr培养保存平板待用 a 细胞培养（高密度，几百细胞培养（高密度，几百十万个菌落或低密度，几百十万个菌落或低密度，几百个以下）个以下） b 细菌细胞原位裂解与细菌细胞原位裂解与DNA变性变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜原位噬菌斑杂交样品膜 a 细胞感染和噬菌斑形成（细胞感染和噬

7、菌斑形成（10,000-20,000/平板）平板） b 噬菌体转移噬菌体转移用用NCF作影印作影印 c DNA变性与固定（与上同）变性与固定（与上同）I II III IV55510% SDS0.5N NaOH1M Tris pH7.4 1.5M NaCl+0.5M Tris pH7.480真空干燥2 斑点杂交(dot hybridization)NCF滤纸点样板支撑板至真空泵废液储槽96孔1283. 狭线杂交五、探针的标记1. 均匀标记（1）切口移位法切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) 随机随机DNA引物延伸法引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段片段+dNTP(32P)* * * * * *变性5 33 5（4）单链探针i 单链DNA探针ii 单链RNA探针2. 末端标记5 3 3 5 TdT -dCTP32P5 3CCCC * CCCC 3 5 * 5 3 3 5 Klenow片段-dNTP32P5 3 3 5 iii) T4 RNA连接酶反应 3. 标记物及其检测见前