基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究

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1、园 艺 学 报 2014，41（7）：13071316 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140410；修回日期：20140619 基金项目：国家自然科学基金项目（31272128）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2011006） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yfcaas） 基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 常耀军1，曹玉芬1,*，张金梅2，田路明1，董星光1，张 莹1，齐 丹1，郑迎春1 （

2、1中国农业科学院果树研究所，农业部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100；2中国农业科学院作物科学研究所，国家作物种质库，北京 100081） 摘 要：从32对叶绿体DNA通用引物中筛选出8对引物用于评价辽宁省梨属种质的遗传多样性，其中4对引物所扩增的叶绿体DNA片段存在突变位点。合并后的叶绿体基因片段（3 688 bp）含有单一突变位点9个、简约信息性位点3个以及插入/缺失（INDEL）2个。在37个样品中，trnL-trnF-487区域、trnL-trnF-413区域、rbcL区域和trnS-psbC区域的单倍型分别为2个、4个、2个和3个，合并之后的叶绿体基因片段的单倍型

3、为4个。非编码区trnL-trnF-413多态性最高，具有最高的单倍型数、最高的单倍型（基因）多样性、最高的核苷酸多样性、最高的单倍型多样性方差和最高的单倍型多样性标准差。辽宁省37份梨种质的单倍型（基因）多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）分别为0.577、0.00055。Tajimas D检验中除了rbcL区域的D值在P 0.05水平上显著外，其余区域的D值未达显著水平，表明自然选择对rbcL区域的突变位点产生了作用。秋子梨和白梨种质共有单倍型HAP_1、HAP_2和HAP_3，显示出一定的亲缘关系；西洋梨则单独共享HAP_5。运用中介邻接网络（Median-Joining network

4、，MJ）算法绘制的中介网络图显示HAP_1与HAP_2、HAP_3的亲缘关系较远，而HAP_5则与上述3个单倍型的亲缘关系较远。 关键词：梨；叶绿体DNA；单倍型；遗传多样性 中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1307-10 Studies on Genetic Diversity of Pear Germplasm Resources in Liaoning Province of China Based on Chloroplast DNA Analysis CHANG Yao-jun1，CAO Yu-fen1,*，ZHANG Jin

5、-mei2，TIAN Lu-ming1，DONG Xing-guang1，ZHANG Ying1，QI Dan1，and ZHENG Ying-chun1 （1Research Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops；Germplasm Resources Utilization，Xingcheng，Liaoning 125100，China；2National G

6、enBank，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） Abstract：Eight chloroplast DNA（cpDNA）primers were selected from 32 universal primer pairs to assess the genetic diversity of 37 pear accessions in Liaoning Province. Among these primer amplification 1308

7、园 艺 学 报 41卷 products，four cpDNA fragments possessed variation sites. Nine singleton variable sites，three parsimony informative sites and two INDELS were obtained from the combined cpDNA fragments（3 688 bp）. Two trnL-trnF-487 haplotypes，four trnL-trnF-413 haplotypes，two rbcL haplotypes and three trnS

8、-psbC haplotypes were identified among the 37 pear accessions，respectively，and four haplotypes were identified based on the combined fragments. Non-coding region trnL-trnF-413 exhibited highest polymorphism with the most number of haplotypes，the most abundant haplotype（gene）diversity and nucleotide

9、diversity，the most variant of haplotype diversity and the highest standard deviation of haplotype diversity. Values of haplotype（gene）diversity（Hd）and nucleotide diversity（Pi）of 37 pear accessions in Liaoning Province are 0.577 and 0.00055，respectively. Tajimas test showed all Tajimas D values are n

10、ot statistical significant except for the rbcL fragment in P 0.05，indicating that natural selection has an effect on mutations of this fragment. Both P. ussuriensis and P. bretschneideri accessions contained haplotypes HAP_1，HAP_2 and HAP_3，showing a close relationship between them；While HAP_5 is sh

11、ared by P. communis accessions independently. The network constructed with Median-Joining network calculation exhibited that HAP_1 has a far relationship with HAP_2 and HAP_3，whereas HAP_5 has a far relationship with those three haplotypes mentioned above. Key words：Pyrus；chloroplast DNA；haplotype；g

12、enetic diversity 前人对于梨种质资源遗传多样性的研究主要基于不同的DNA分子标记，如RAPD（Teng et al.，2001，2002）、AFLP（Bao et al.，2008）、RFLP（Iketani et al.，1998）和SSR（Yamamoto et al.，2001，2002a，2002b；Bao et al.，2007；Yao et al.，2010）。近20年来，DNA序列分析在植物系统发育进化研究中得到了很好的应用，但在种质资源遗传多样性研究中的应用较少。叶绿体DNA（cpDNA）在大多数被子植物中属母系遗传，且没有或很少经历重组，其中的非编码区具有丰富

13、的变异，如核苷酸替换、插入/缺失、易位和倒位（Petit et al.，1993），是进行低分类阶元系统发育研究、杂种亲本鉴定和遗传多样性研究的理想片段（Katayama & Ogihara，1996；Eiadthong et al.，1999；Kimura et al.，2003）。 目前国内外学者已将cpDNA非编码区用于梨属植物遗传多样性、系统发育及品种鉴定研究中，基于cpDNA的系统发育树和网状图（network）可以推断出物种起源和进化历史（Kimura et al.，2003；胡春云 等，2011）。日本学者最早利用cpDNA对梨属植物进行遗传多样性研究和种质资源评价（Kimura

14、 et al.，2003；Katayama et al.，2007），发现梨属植物cpDNA非常保守，只有accD-psaI和rps16-trnQ区属于cpDNA的高变区（Katayama et al.，2012）。胡春云等（2011）对梨属19个种的叶绿体非编码区trnL-trnF和accD-psaI进行序列分析，并通过构建NeighborNet系统发育网络揭示了梨属系统发育关系。Liu等（2012）在研究浙江省豆梨的遗传多样性和种群结构时，在77个个体中确定了10个accD-psaI和2个trnL-trnF的单倍型。Wuyun等（2013）通过cpDNA多变区的单倍型分析发现总体上野生秋子

15、梨遗传多样性比较低，但其中吉林野生秋子梨的遗传多样性比较高。 辽宁省地处渤海湾，为白梨（P. bretschneideri Rehd.）和秋子梨（P. ussuriensis Maxim.）的主要产区之一。境内有千山、努鲁尔虎山、大老图山等，分别属于长白山余脉和燕山余脉，境内分布有多个梨属植物种，原产辽宁的白梨和秋子梨品种数量较为丰富。然而，迄今为止还缺少对辽宁省原产梨种质遗传多样性的评估。本研究中采用4个cpDNA片段对37个原产辽宁的白梨和秋子梨品种的遗传多样性进行研究，探讨它们之间的亲缘关系。 7期 常耀军等：基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1309 1 材料与方法

16、1.1 试材及取样 37个辽宁省原产的白梨和秋子梨种质来自辽宁兴城中国农业科学院果树研究所“国家果树种质兴城梨、苹果圃”。此外，还选用了4个来自其它地区的砂梨种质，并以3个西洋梨为外类群样本，用于系统发育分析。试验地点为辽宁兴城中国农业科学院果树研究所。2013年5月采集样品嫩叶用于分析。 1.2 DNA的提取 DNA提取采用Doyle和Doyle（1987）的改良CTAB法。通过琼脂糖电泳，并对照DNA（10 ng L-1）将提取基因组DNA的浓度调整到30 ng L-1，用于PCR。 1.3 用于PCR扩增的叶绿体DNA通用引物的确定与筛选 筛选确定32对叶绿体通用引物（表1，由上海San

17、gon公司合成），随机取6个样品进行PCR扩增。取5 L扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带清晰且有特异性条带的通用引物进行后续试验。 表1 本研究所用的叶绿体DNA通用引物 Table 1 Chloroplast DNA universal primer pairs used in this study 编号 Code 扩增区域 Region 正向序列（53） Forward sequence（53） 反向序列（53） Reverse sequence（53） 长度/bp Size 参考文献 Reference P01 trnT-trnL CATTACAAATGCGATGCTCT T

18、CTACCGATTTCGCCATATC 1 200 Taberlet et al.，1991 P02 trnL-trnF CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC 487 Taberlet et al.，1991 P03 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 413 Taberlet et al.，1991 P04 atpB-rbcL TAAACCCCGGACGAAAGTAGTGGACTTGCTTTAGTTTCGTTTGTGGTGA829 Katayama & Uematsu，2003P

19、05 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 462 Taberlet et al.，1991 P06 rpII6 GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTGCGTACCCATATTTTTCCACCACGAC1 200 Kelchner & Clark，1997 p07 cp-trnk GGGTTGCCCGGGACTCGAAC CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA 2 000 Parducci & Szmidt，1999 P08 trnQ-trnG TCGAACCTCCGAATAACAGG CGCATTCGTT

20、AGCTTGGAAG 3 000 Parducci & Szmidt，1999 P09 trnS-psbC GGTTCGAATCCCTCTCTCTC GGTCGTGACCAAGAAACCAC 1 518 Parducci & Szmidt，1999 P10 psbD-16S CCACAAAAACGAAACGGTCT ACTAACTAATCAGACGCGAGCC 2 000 Parducci & Szmidt，1999 P11 psaA-trnS ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA AACCACTCGGCCATCTCTCCTA 2 000 Demesure et al.，1995 P1

21、2 trnD-trnT ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG 2 200 Demesure et al.，1995 P13 trnH-trnK ACGGGAATTGAACCCGCGCA CCGACTAGTTCCGGGTTCGA 1 700 Demesure et al.，1995 P14 trnL-trnF CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGATAGAGGGACTTGAAC 1 600 Taberlet et al.，1991 P15 accD-psaI GGAAGTTTGAGCTTTATGCAAATGGAGAAGCCATTGCAAT

22、TGCCGGAAA700 Small et al.，1998 cp01 trnH-trnK ACGGGAATTGAACCCGCGCA CCGACTAGTTCCGGGTTCGA 1 690 Demesure et al.，1995 cp02 trnS-trnfM GAGAGAGAGGGATTCGAACC CATAACCTTGAGGTCACGGG 1 700 Demesure et al.，1995 cp03 rbcL TGTCACCAAAAACAGAGACT TTCCATACTTCACAAGCAGC 1 270 Parani et al.，2000 cp04 trnk1-trnk2 GGGTTG

23、CCCGGGACTCGAAC CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA 2 580 Demesure et al.，1995 cp05 trnC-trnD CCAGTTCAAATCTGGGTGTC GGGATTGTAGTTCAATTGGT 3 000 Demesure et al.，1995 cp06 trnD-trnT ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG 1 800 Demesure et al.，1995 cp07 trnM-rbcL TGCTTTCATACGGCGGGACT GCTTTAGTCTCTGTTTGTGG 2 900 De

24、mesure et al.，1995 cp08 trnF-trnVr CTCGTGTCACCAGTTCAAAT CCGAGAAGGTCTACGGTTC 3 492 Dumolin-Lapegue et al.，1997cp09 trnS-trnT CGAGGGTTCGAATCCCTCTC AGAGCATCGCATTTGTAATG 1 500 Demesure et al.，1995 cp10 psbC-trnS GGTCGTGACCAAGAAACCAC GGTTCGAATCCCTCTCTCTC 1 680 Demesure et al.，1995 cp11 accD-psaI TTATTCGA

25、TCCAATCGTACCAC AGAAGCCATTGCAATTGCCGGAAA710 Liu et al.，2012 cp12 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 400 Small et al.，1998 cp13 trnL-trnF2 CGAAATCGGTAGACGCTACG ATTTGAACTGGTGACACGAG 1 000 Taberlet et al.，1991 cp14 trnT-trnF3 CATTACAAATGCGATGCTCT ATTTGAACTGGTGACACGAG 1 400 Taberlet et a

26、l.，1991 cp15 trnL-trnF3 GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 400 Taberlet et al.，1991 cp16 trnD-trnT ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG 900 Demesure et al.，1995 cp17 trnV-rbcLr CGAACCGTAGACCTTCTCGG GCTTTAGTCTCTGTTTGTGG 3 850 Dumolin-Lapegue et al.，19971310 园 艺 学 报 41卷 1.4 PCR扩增和测序 PCR扩增体

27、系为40 L，含DNA模板40 ng，引物0.4 mol L-1，dNTP（北京天根）200 mol L-1，MgCl2 2 mmol L-1，Taq DNA聚合酶（北京天根）2 U。扩增程序如下：90 预变性90 s；90 变性30 s，退火温度52 持续40 s，72 延伸90 s，35个循环；最后72 延伸10 min；10 保温10 min。对于大于3 000 bp的扩增产物，延伸条件则为72 延伸2.5 min，其余同上。cp11引物扩增的accD-psaI区域采用如下扩增程序：94 预变性3 min；94 变性30 s，退火温度56 持续40 s，72 延伸90 s，35个循环；最

28、后72 延伸6 min；10 保温10 min。取扩增产物5 L进行2%琼脂糖凝胶电泳。 PCR扩增产物纯化完成后交由上海美吉测序公司（北京）用美国ABI公司的3730XL测序仪进行测序。PCR体系为20 L，含DNA 1 L，BigDye 8 L，引物1 L，ddH2O 10 L。采用如下测序程序：96 预变性1 min；96 变性10 s，退火温度50 持续5 s，60 延伸4 min，25个循环；最后60 延伸30 min；4 保温。每一个片段进行测序时，所用引物的正反向序列见表1，每一个样品的每一个cpDNA片段均进行正、反向测序，2次测定，超过2 000 bp的测通。 1.5 数据分

29、析 为了便于数据分析，所有的序列在人工校对之后都被保存为FASTA和MEGA格式。利用Clustal X ver 2.1软件对序列进行比对。使用软件PAUP beta ver 4.0将叶绿体DNA片段trnL-trnF、trnL-trnF、rbcL和trnS-psbC进行合并。 将单个片段和合并之后的片段保存后，运用DnaSP ver 5.10.01（Librado & Rozas，2009）计算变异位点（Variable sites，Vs）、单一突变位点（Singleton variable sites，Ss）、简约信息性位点（Parsimony informative sites，Ps）、

30、核苷酸多样性（nucleotide diversity，Pi）、平均核苷酸差异（average number of nucleotide differences，k）、单倍型数目（Number of haplotypes，h）、单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd）、单倍型多样性方差（Variance of haplotype diversity，Vh）、单倍型多样性标准差（Standard deviation of haplotype diversity，Sh）和Tajimas D值（Tajimas D）。Tajimas D检验的目的是鉴定目标DNA序列在进化过程中是否

31、遵循中性进化模型。中性进化理论的核心为大部分对种群的遗传结构与进化有贡献的分子突变在自然选择的意义上都是中性或近中性的，因而自然选择对这些突变并不起作用；中性突变的进化是随机漂移的过程，或被固定在种群中，或消失。 将37个梨属种质的相关数据保存为Nexus文件后，运用NetWork ver 4.6.1.2，采用中介邻接网络（Median-Joining network，MJ）算法，并用最大简约（Maximum Parsimony calculation，MP）算法来优化由MJ计算得到的结果，构建其叶绿体DNA单倍型间的关联图。 2 结果与分析 2.1 引物的PCR扩增筛选和突变位点鉴定 用32

32、对引物（表1）对模板DNA进行扩增，有8对引物能够扩增出单一、清晰、稳定的特异性条带，它们是P01、P02、P03、P09、P14、cp03、cp10和cp13，其余24对引物无扩增条带、或者扩增出不完全条带、或者扩增出的条带模糊无法辨别。通过分析、确认测序结果，8对引物中的4对引物P02（trnL-trnF）、P03（trnL-trnF）、P09（trnS-psbC）、cp03（rbcL）扩增的cpDNA片段存在突变位点，其中引物P02、P03扩增的是叶绿体基因片段trnL-trnF的不同区域，其余4对引物扩增的cpDNA片段没有发现突变位点。本研究涉及的cpDNA区域为trnL-trnF（

33、P02和P03）、trnS-psbC7期 常耀军等：基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1311 （P09）和rbcL（cp03）。 试验获得的单倍型1、单倍型2、单倍型3和单倍型4所包含的梨种质如表2，上述4个区域的突变位点及单倍型类型的具体信息如表3所示。 表 2 供试的梨种质及叶绿体DNA单倍型分布 Table 2 Pear accessions used in this study and their cpDNA haplotype distribution 种类 Species 编号 Code 种质名称 Accession name 来源 Origin 单倍型 Hap

34、lotypes 秋子梨 01 鞍山1号Anshan 1 辽宁鞍山Anshan，Liaoning HAP_2 P. ussuriensis Maxim. 02 大香水 Daxiangshui 辽宁鞍山Anshan，Liaoning HAP_3 03 官红宵 Guanhongxiao 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2 04 花盖 Huagai 辽宁 Liaoning HAP_1 05 黄金对麻 Huangjin Duima 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2 06 辉山白Huishanbai 辽宁沈阳 Shenyang，Liaoning HAP_3 07

35、尖把梨 Jianbali 辽宁开原 Kaiyuan，Liaoning HAP_2 08 六月鲜 Liuyuexian 辽宁鞍山Anshan，Liaoning HAP_4 09 满园香 Manyuanxiang 辽宁绥中 Suizhong，Liaoning HAP_2 10 木梨 Muli 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2 11 南果梨 Nanguoli 辽宁鞍山Anshan，Liaoning HAP_2 12 平梨 Pingli 辽宁 Liaoning HAP_2 13 青糖 Qingtang 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2 14 秋子 Qiu

36、zi 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2 15 热秋子 Reqiuzi 辽宁葫芦岛 Huludao，Liaoning HAP_2 16 砂糖梨 Shatangli 辽宁庄河 Zhuanghe，Liaoning HAP_2 17 甜秋子 Tianqiuzi 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2 18 小核白 Xiaohebai 辽宁开原 Kaiyuan，Liaoning HAP_3 19 小香水 Xiaoxiangshui 辽宁Liaoning HAP_1 20 岫岩慈 Xiuyanci 辽宁岫岩 Xiuyan，Liaoning HAP_3 21 羊奶香 Y

37、angnaixiang 辽宁鞍山Anshan，Liaoning HAP_2 22 早蜜 Zaomi 辽宁建平Jianping，Liaoning HAP_2 23 自生17 Zisheng 17 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_1 白梨 24 半斤酥 Banjinsu 辽宁锦州 Jinzhou，Liaoning HAP_3 P. bretschneideri Rehd. 25 大核白 Dahebai 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2 26 鹅头梨 Etouli 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2 27 海城茌梨 Haichen

38、g Chili 辽宁海城 Haicheng，Liaoning HAP_3 28 金锤子 Jinchuizi 辽宁庄河 Zhuanghe，Liaoning HAP_3 29 六瓣 Liuban 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2 30 六棱 Liuleng 辽宁熊岳 Xiongyue，Liaoning HAP_2 31 软把 Ruanba 辽宁金州 Jinzhou，Liaoning HAP_2 32 绥中谢花甜Suizhong Xiehuatian 辽宁绥中 Suizhong，Liaoning HAP_1 33 洋白小 Yangbaixiao 辽宁海城 Haicheng，

39、Liaoning HAP_2 34 洋红宵 Yanghongxiao 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_3 35 油红宵 Youhongxiao 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_3 36 圆把 Yuanba 辽宁金州 Jinzhou，Liaoning HAP_2 37 猪嘴 Zhuzui 辽宁金州 Jinzhou，Liaoning HAP_3 砂梨 38 长十郎 Choujuurou 日本 Janpan HAP_3 P. pyrifolia（Burm. f.）Nakai 39 丰水 Housui 日本 Janpan HAP_3 40 江湾糖梨 Ji

40、angwan Tangli 江西婺源 Wuyuan，Jiangxi HAP_3 41 小梅梨 Xiaomeili 浙江新昌 Xinchang，Zhejiang HAP_3 西洋梨（外类群） 42 巴梨 Bartlett 英国 England HAP_5 P. communis L.（Outgroup） 43 康佛伦斯 Conference 英国 England HAP_5 44 茄梨 Clapps Favorite 美国 America HAP_5 1312 园 艺 学 报 41卷 表3 37个供试样本在trnS-psbC、rbcL和trnL-trnF中的变异位点 Table 3 The va

41、riations in trnS-psbC，rbcL and trnL-trnF regions among 37 accessions 区域 Domain 变异位点 Variation site 单倍型1 HAP_1 单倍型2 HAP_2 单倍型3 HAP_3 单倍型4 HAP_4 trnS-psbC 1 T A T T 2 G T T T rbcL 3 G G G T 4 C C C A 5 A A A C 6 C C C A trnL-trnF-487 7 T T T A 8 C C C A 9 A A A T trnL-trnF-413 10 C C T C 11 A A A C 12

42、 T T T G 13 1 0 0 1 14 0 1 1 1 注：0和1分别表示相应INDEL为缺失或插入。A、T、C、G为相应的碱基。 Note：0 and 1 indicate deletion and insertion for certain INDEL，respectively. A，T，C and G are bases，respectively. 2.2 叶绿体基因单个片段和合并片段的遗传多样性和单倍型信息 叶绿体通用引物P02和P03扩增叶绿体基因片段trnL-trnF时，该片段分成了两部分。P02（trnL-trnF）、P03（trnL-trnF）、cp03（rbcL）和P0

43、9（trnS-psbC）在所有样本中的序列长度范围分别为480 487 bp、403 413 bp、1 255 1 270 bp和1 498 1 518 bp，将各区域对位排列后，上述片段的长度分别为487、413、1 270和1 518 bp。非编码区trnL-trnF-487含3个核苷酸替换；非编码区trnL-trnF-413多态性最高，包括3个核苷酸替换和18 bp的插入/缺失位点；rbcL含4个核苷酸替换；非编码区trnS-psbC多态性最低，仅有2核苷酸替换。4个叶绿体基因片段合并后，序列长度范围为3 636 3 688 bp，对位排列后的长度为3 688 bp，含有9个单一突变位点

44、，3个简约信息性位点，18 bp的插入/缺失位点。18 bp的插入/缺失位点同时为多个样本所共有，因此也看作简约信息性位点，纳入序列分析和单倍型统计。将上述插入/缺失看作是2个INDEL，记为INDEL-1和INDEL-2，分别为8 bp和10 bp，均处理为一次突变事件，并编码为替换用于后续的分析中。 在37个样品中，非编码区trnL-trnF-487、trnL-trnF-413的变异位点分别是7 9位点、10 14位点，单倍型分别为2个、4个；rbcL区域的变异位点为3 6位点，单倍型有2个；trnS-psbC区域的变异位点为1、2位点，单倍型有3个。 如表4和表5所示，平均核苷酸差异（k

45、）最小和最大的区域分别为trnL-trnF-487（k = 0.16216）和trnL-trnF-413（k = 0.95195）。叶绿体基因片段trnL-trnF-413除了有最多的单倍型（h = 4）外，还有最高的核苷酸多样性（Pi = 0.00240）、最高的单倍型（基因）多样性（Hd = 0.577）、最高的单倍型多样性方差（Vh = 0.00442）和最高的单倍型多样性标准差（Sh = 0.066）。而单倍型数（h = 2）最少的叶绿体基因片段rbcL，具有最低的核苷酸多样性（Pi = 0.00017）。trnL-trnF-487和rbcL片段有最低且相同的单倍型（基因）多样性（Hd

46、 = 0.054）、单倍型多样性方差（Vh = 0.00255）和单倍型多样性标准差（Sh = 0.050）。合并之后的叶绿体基因片段，共有单倍型4个，核苷酸多样性（Pi）、平均核苷酸差异（k）、单倍型（基因）多样性（Hd）、单倍型多样性方差（Vh）和单倍型多样性标准差（Sh）分别为0.00055、2.02402、0.577、0.00442和0.066。 7期 常耀军等：基于叶绿体DNA分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1313 表4 通过DnaSP软件获得的37个供试梨种质的cpDNA片段多态性信息 Table 4 The polymorphic information of cpDNA

47、fragments of 37 pear accessions in this study by using DnaSP software 叶绿体DNA片段 cpDNA fragments 长度/ bp Length Vs 变异（多态性）位点 Variable （polymorphic）sites Ss 单一突变位点 Singleton variable sites Ps 简约信息性位点Parsimony informative sitesIs 插入/缺失位点Insertion/ deletion gaps Pi 核苷酸多样性 Nucleotide diversity k 平均核苷酸差异 Av

48、erage number of nucleotide differencestrnL-trnF-487 487 3（0.6%） 3（0.6%） 0 0 0.00033 0.16216 trnL-trnF-413 413 3（0.7%） 2（0.5%） 1（0.2%） 18（4.4%） 0.00240 0.95195 rbcL 1 270 4（0.3%） 4（0.3%） 0 0 0.00017 0.21622 trnS-psbC 1 518 2（0.1%） 0 2（0.1%） 0 0.00046 0.69369 合并Combined 3 688 12（0.3%） 9（0.2%） 3（0.1%）

49、18（0.5%） 0.00055 2.02402 注：括号中数据表示变异位点或者插入/缺失位点数在总位点数中所占的比例。 Note：Data in the bracket indicate the proportions of the number of variable sites or insertion/deletion gaps to the number of all sites. 表5 通过DnaSP软件获得的叶绿体DNA单倍型数和多样性数值 Table 5 Chloroplast DNA haploypes and the diversity by using DnaSP 扩增区

50、域 Region h 单倍型数 Number of haplotypes Hd 单倍型（基因）多样性 Haplotype（gene） diversity Vh 单倍型多样性方差 Variance of haplotype diversity Sh 单倍型多样性标准差 Standard deviation of haplotype diversity 中性检验 Tajimas D test trnL-trnF-487 2 0.054 0.00255 0.050 1.72176 trnL-trnF-413 4 0.577 0.00442 0.066 0.53169 rbcL 2 0.054 0.0

51、0255 0.050 1.88391* trnS-psbC 3 0.562 0.00373 0.061 0.86380 合并Combined 4 0.577 0.00442 0.066 1.26941 注：* 表示在P 0.05水平上差异显著。 Note：* indicates statistical significance in P 0.05. 2.3 Tajimas D检验 如表5所示，Tajimas D值只有在trnS-psbC片段中为正值（Tajimas D = 0.86380），在其余片段中均为负值。在所有为负值的叶绿体基因片段中，最低的D值（Tajimas D =1.88391）

52、出现在rbcL中。就数据的显著性而言，除了rbcL区域的D值在P 0.10水平上不显著，说明合并后的片段遵循中性进化模型。 2.4 基于4个叶绿体基因片段合并数据的单倍型间的中介网络图的构建 运用中介邻接网络（Median-Joining network，MJ）算法和最大简约（Maximum Parsimony calculation，MP）算法分别计算和优化结果，构建辽宁省梨属种质cpDNA单倍型间的关联图（图1）。秋子梨小香水、自生17、花盖和白梨绥中谢花甜的单倍型类型为HAP_1；22份种质的单倍型类型为HAP_2，其中秋子梨15份，白梨7份；14份种质的单倍型类型为HAP_3，包括4份

53、秋子梨、6份白梨以及来自其它地方的4份东方梨即小梅梨、江湾糖梨、丰水和长十郎；HAP_4仅存在于六月鲜中；外类群中的3份西洋梨共享HAP_5单倍型。 单倍型和中介矢量载体的名称分别表示为HAP和mv。从图1中可以发现，HAP_4和HAP_5位于中介网络图的躯干（torso）上，HAP_1和HAP_5、HAP_2和HAP_5分别由HAP_4和mv1连接。在变异位点上HAP_2和HAP_3仅有两个差异，图1中显示HAP_2包含HAP_3，HAP_1与HAP_2和HAP_3亲缘关系较远，HAP_5与HAP_1、HAP_2、HAP_3的亲缘关系也较远。 1314 园 艺 学 报 41卷 图1 基于4个

54、叶绿体基因片段合并数据分析的单倍型间的中介邻接网络图（Median-Joining network，MJ） Fig. 1 Median-Joining network for cpDNA haplotypes in 44 pear accessions based on four combined chloroplast DNA fragments 3 讨论 本研究中涉及的cpDNA区域有trnL-trnF-487、trnL-trnF-413、trnS-psbC和rbcL。曾有研究表明，梨的基因间隔区accD-psa和trnL-trnF多态性最高（Kimura et al.，2003）。本研究

55、中，非编码区trnL-trnF-413也是4个叶绿体基因区域中最具多态性的区域，与前人的研究结果一致。 cpDNA遗传属于母系遗传，没有或很少经历重组。叶绿体基因相当保守，突变类型主要表现为点突变、碱基插入或缺失，进化速率平均每年每个位点约为0.2 10-9 1.0 10-9，仅为核基因的1/3（Badenes & Parfitt，1995；Demesure et al.，1996）。本研究中所采用的cpDNA片段，除了rbcL外，其余片段都符合中性进化模型（表5），适合于遗传多样性研究。研究表明，梨的cpDNA的遗传多样性比较低（Katayama & Uematsu，2003；Katayam

56、a et al.，2012）。与来自浙江省的豆梨（Hd = 0.719，Pi = 0.00105）的遗传多样性（Liu et al.，2012）相比，本研究所得到的辽宁省梨种质的遗传多样性更低（Hd = 0.577，Pi = 0.00055）。究其原因，可能是Liu等（2012）采用了比trnL-trnF进化更快的accD-pasI区域之故，而本研究中采用的片段中没有包含accD-pasI。当然，野生种的遗传多样性一般高于栽培类型。研究表明accD-psaI片段比trnL-trnF具有更快的进化速率，更适合应用于种及种以下分类水平的梨属植物系统关系研究（胡春云 等，2011；Katayama

57、et al.，2012）。 秋子梨和白梨品种均包含HAP_1、HAP_2和HAP_3单倍型，揭示了秋子梨和白梨在单倍型上具有的多样性，暗示秋子梨和白梨品种演化中可能存在相互的基因渐渗。利用DNA标记，采用UPGMA法构建的梨种质系统发育树中一些秋子梨和白梨并没有独自形成各自的组（Teng et al.，2002；Bao et al.，2007；曹玉芬 等，2007；张妤艳 等，2008；Bassil & Postman，2010），间接说明了秋子梨和白梨具有一定的亲缘关系。 菊池秋雄（1946）认为中国白梨可能起源于秋子梨和砂梨的杂交，并将中国白梨命名在秋子梨P. ussuriensis var. sinensis（Lindley）Kikuchi名下。本研究中发现中国辽宁省的白梨、秋子梨共享HAP_1、HAP_2和HAP_3，同时与中国浙江省和江西省的砂梨、以及日本梨共享单倍型HAP_3，反映了中国白梨、秋子梨和砂梨（日本梨）之间错综复杂的亲缘关系。Teng