蜜环菌菌种的复壮研究

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1、蜜环菌菌种的复壮研究第33卷第2期2008年1月中国中药杂志ChinaJournalofChineseMateriaMedicaVo1.33,Issue2January,2008蜜环菌菌种的复壮研究王淑芳,杨金玲,朱平,朱慧新,何惠霞(中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所卫生部天然药物生物合成重点实验室,北京100050)摘要】目的:研究蜜环菌菌种的复壮问题.方法:应用摇瓶扩繁无性后代的方法,观察几种培养基和不同培养方法对蜜环菌菌索形成的影响,并挑取新鲜粗壮菌索的先端部分进行斜面培养.结果:在富含有机氮的半固体培养基上蜜环菌最易形成粗壮的菌索.结论:选择适当的培养基及培养方法摇瓶扩繁蜜环菌

2、后代,再进行选择培养是复壮蜜环菌菌种最简易的方法.关键词】蜜环菌;菌索;复壮中图分类号】S567文献标识码A文章编号】1001.5302(2008)02-0121-03蜜环菌是名贵中药天麻块茎生长发育必不可少的共生菌.栽培天麻时如无蜜环菌菌材伴栽,天麻块茎就会因得不到营养而无法长大并逐渐消亡.现代医学证明,蜜环菌本身就是一种具有天麻药效的药用真菌,蜜环菌可作为传统中药天麻的代用品J.但无论伴栽天麻还是发酵生产天麻蜜环菌片,蜜环片,所用蜜环菌菌种经长期多次传代后都会逐渐发生退化,明显表现为在琼脂斜面上萌发菌丝慢,菌丝不易形成菌素或仅形成少量纤细少分支并很快变为褐色的菌索,有时只形成一片片褐色皮壳

3、状硬块,其上面菌丝丛不多,培养基表面白色菌丝也很少,所以其特有的在黑暗中能发出荧光的特性很弱,甚至没有.已发生退化的菌种不仅会影响伴栽天麻的产量J,也会影响其发酵生产蜜环片的产量和质量.菌索粗壮,分支旺盛的菌株发酵得到的每克干菌丝中的多糖含量一般较高_4J,其中的2种多糖均能抑制四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖升高J.菌索是蜜环菌生活史中存在较长的一个阶段,子实体在菌索上产生.不形成菌索的蜜环菌较难通过培养子实体来复壮,但根据蜜环菌好气性的生物学特性,选用摇瓶深层培养得到较多碎小的新生菌丝段,通过半固体摇瓶培养与静置,可将一株保存20多年,经多次传代,不易形成菌索的退化菌株,恢复为生长旺盛,菌索发达且荧

4、光强的菌株.1仪器与材料收稿日期2007-02-28通讯作者朱平,Tel:(010)63165197,E-mail:zhupingimm.高压灭菌锅,无菌操作超净台,摇床.亮竹蜜环菌ArmiUariameUea为本实验室1986年保存菌种.2方法2.1菌种无性后代的扩繁2.1.1培养基菌种斜面:5%麦麸煮30rain滤液1000mL,加入10g葡萄糖,10g蔗糖,1gKH2PO,0.5gMgSO4?7H20,18g琼脂.种子摇瓶:1%豆饼粉,2%葡萄糖,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4?7H20,自来水配制,pH自然.培养瓶:5%麦麸煮汁滤液(液体);麦麸滤渣(固体);5%麦麸煮汁不

5、滤渣(半固体);同斜面琼脂培养基(固体).以上各培养基除菌种斜面用试管外,其余均用三角瓶.液体,半固体培养基用500mL瓶,装量200mL,固体培养基用100mL三角瓶,装量为瓶体积的1/31/2,压成斜面即可,每处理4瓶,常规高压灭菌30rain.2.1.2扩繁方法从4冷库取出保存20多年经多次传代的蜜环菌母种试管,由于菌种退化,无菌索,只是在褐色菌皮上有一些驼色的菌丝丛,并且培养基表面的白色菌丝较少,所以接种种子摇瓶时,每瓶1支,截为23段,接种后摇床暗培养,转速150r?rain,温度23.因菌种衰老,在摇瓶中调整适应期较长,扩繁时间为3周以上,瓶内充满较多米粒大小的菌丝球后备用.将种子

6、菌液接入4种培养基后,和先放摇床上摇培4d,生长旺盛后静置,和接种后即静置,25避光培养1个月.121?第33卷第2期2008年1月中国中药杂志ChinaJournalofChineseMateriaMedicaVo1.33,Issue2January,20082.2不同培养基与浓度比较2.2.1培养基用含2%葡萄糖,0.2%KH2PO和0.1%MgSO?7H2O的水溶液配制含4种不同氮源的培养基:5%麦麸滤汁;1%豆饼粉汁;0.25%NHNO液;麸豆滤渣.2.2.2配制与培养按500mL三角瓶装量200mL,用琼脂将,3种营养液分别配制成不同体积分数的半固体,依次为0%,0.2%,0.4%,

7、0.6%,每处理3瓶,为和的混合滤渣(含水230%)按重量比均分于各三角瓶中,依次形成4个浓度即0%,9%,18%,27%,培养基常规高压灭菌30min.菌源为麦麸滤渣培养的菌种,每瓶接入1cm菌块,接种时将菌块放在瓶El尽量压碎,先摇培90h,然后25c【=避光静置培养1个月.2.3培养基添加有机氮固形物及培养方法基于添加琼脂配制的综合NHNO半固体培养基缺少有机氮营养,将琼脂改为含少量有机氮的硬木屑及稻壳粉,按2.2.1方法中将NHNO基本液配分别制成含固形物1%,3%,5%,7%,3重复,灭菌,接种和培养方法均同上.3结果3.1扩繁菌种生长状况由于蜜环菌在自然界中菌索多贴附在树木皮层缝隙

8、中,所以在4种不同物态的培养基上,同样的种子菌液出现了不同的生长状况.麦麸煮汁滤液(液体):上液面飘浮多块圆形褐色绒状菌丝丛,下有淡棕色冻状菌丝团,未形成明显菌索;麦麸滤渣(固体):上表面为生有驼色菌丝丛的菌皮,瓶壁及底部可见白色线状菌索;5%麦麸煮汁不滤渣(半固体):上表面有驼色菌丝丛,培养基内充满白色粗壮多分支的贴瓶壁的菌索;麸汁综合琼脂(固体):上表面及周边有褐色菌线与白色菌丝形成大小不等分隔区,底部可见白色菌索.在人工培养条件下,蜜环菌在固体培养基上均可形成菌索,但从其长势及生长量上来看半固体培养基培养效果较好,便于从直观上分辨菌索的形成以尽快筛选到复壮的菌株.3.2菌索形成状况各处理

9、的菌索形成状况见表1.综合麦麸滤汁和综合豆饼粉汁所有培养瓶中都能形成菌索,不添加琼脂也能形成菌索,但菌索较细且呈浅红褐色.加0.2%及0.4%琼脂后菌索形成较多且较粗壮,主?122?菌索直径可达3mnl.而NHNO披理的12瓶,均未形成菌索,但摇瓶期菌丝发出荧光最早,亮度最强,可能是因为其可溶性速效营养被菌利用得快,菌丝生长旺盛,而摇培3d后其荧光亮度下降至不及其他3种培养基;静置后NHNO孜理缺长效有机氮,所以营养不足以使菌形成菌索.在麸豆滤渣处理中,无论滤渣多少,每瓶均可形成菌索.只有未添加滤渣的处理,因仅仅是葡萄糖和无机盐溶液,缺乏氮源,营养不足,所以未形成菌索.表1各处理的菌索形成状况

10、形成菌索瓶数/培养瓶数未添加琼脂的含9%,18%,27%湿麸豆滤渣的3个处理均能形成菌索,未添加滤渣的处理则不能形成菌索.3.3硬木屑及稻壳粉对菌索形成的影响硬木屑及稻壳粉对菌索形成的影响结果见表2.无论硬木屑还是稻壳粉,由于有机氮含量较低,远不及麦麸及豆饼粉,所以其含量为1%的培养瓶中只形成一团团菌丝,上表面有较多驼色及白色菌丝丛,下边菌丝连成一片片浅褐色的膜,未形成菌索.含硬木屑或稻壳粉3%及更高浓度的各培养瓶中则都形成了菌索,但菌索均较细长,直径大多在1mm左右,没有综合麦麸及综合豆饼粉的培养基中长出的菌索粗壮,量多,但长期静置又比添加琼脂有利于菌索洁白颜色的保持.表2硬木屑及稻壳粉对菌

11、索形成的影响形成菌索瓶数/培养瓶数综上所述,已退化的不能形成菌索的蜜环菌菌种,通过摇瓶扩繁形成大量米粒大小菌丝球,菌丝片后,可通过含有机氮和葡萄糖的半固体摇瓶进一步培养后静置,生活力强的菌丝球或片段即脱颖而出并快速生长,形成粗壮旺盛的菌索,挑取新鲜菌索的第33卷第2期2008年1月中国中药杂志ChinaJournalofChineseMateriaMedicaVo1.33,Issue2January,2008先端部分移植于试管斜面上即可得到复壮的菌株.参考文献1陈士瑜,陈海英.蕈菌医方集成M.上海:上海科学技术出版社,2000:433.2栗德林,余传隆,杨思树,等.中国药物大辞典M.上册.北京

12、:中国医药科技出版社,199l:ll89.3王秋颖,郭顺星,关凤斌.不同来源蜜环菌对天麻产量影响的456研究J.中草药,2001,32(9):839.王秋颖,郭顺星,樊锦艳.不同蜜环菌菌株生物学特性及多糖含量研究J.中国药学杂志,2001,36(9):588.于敏,沈业寿.蜜环菌菌索多糖对小鼠血糖及急性毒性作用研究J.中国食用菌,2002,21(1):35.王淑芳,徐贵样,杨永春.室温条件下药用真菌菌种的保藏J.中国食用菌,1991,10(2):25.StudiesonrejuvenationofArmillariamelleaWANGShu.fang,YANGJin.ling,ZHUPing

13、,ZHUHui.xin,HEHui.xia(KeyLaboratoryofBiosynthesisofNaturalProductsofMinistryofHealth,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)AbstractObjective:TostudytherejuvenationofArmillariamelleastrain.Method:Observetheinfluencesofseveralingredien

14、tsanddifferentculturalmethodsontheshoestringformationoftheclonaloffspringsinflask,andselectthetippartoftheshoestringforcultivation.Result:ThestrongshoestringswereeasilyrestoredinthesemisolidmediumwithrichorganicnitrogenSOUrCe.Con?clusion:ItwastheeasiestwaytorejuvenateA.melleastrainbymuhiplyingtheclo

15、naloffspringsinapropermedium,togetherwiththeproperselection.KeywordsArmillariamellea;shoestring;rejuvenation责任编辑张宁宁】土壤因子对怀菊质量影响研究郭巧生h,梁迎暖,张重义,王桃银,汪涛(1.南京农业大学中药材研究所,江苏南京210095;2.河南农业大学中药材研究所,河南郑州450002)摘要目的:研究土壤因子对怀菊内在质量的影响.方法:分别测定河南温县,江苏南京和浙江桐乡三地怀菊样品中绿原酸,总黄酮和微量元素的含量,并分析相应土壤的理化性质,测定矿质元素含量,通过相关分析和通径分析

16、研究土壤环境对怀菊内在质量的影响.结果与结论:结果表明三地怀菊内在质量差异显着,土壤因子对怀菊内化学成分含量有很大的影响,其中直接作用较大的依次是脲酶活性,速效钾,CEC和速效磷的含量,而且其微量元素与土壤矿质元素有很好的相关性,其中怀菊对土壤中镁,砷的富集能力较强.关键词怀菊;内在质量;土壤中图分类号】S567文献标识码】A文章编号】10015302(2008)02-0123-06药用菊花ChrysanthemummorifoliumRamat.为菊科植物,其干燥头状花序为常用中药,有散风清收稿日期2007-0618基金项目国家科技攻关计划项目(2004BA721A20);国家”十一五”科技支撑计划项目(2006BA106A12一l1)通讯作者郭巧生,Tel:(025)84396591,Email:gqs?123?