羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究毕业论文

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1、毕业论文羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究The Study on Preparation of Specific E.ovis Antigen学 生： 指导教师： 院 系：河北北方学院动物科技学院专 业：动植物检疫班 级：07级本科动检班论文提交日期：2011年6月9日目录1材料41.1实验动物41.2 主要试剂41.3 主要仪器42方法42.1应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原42.2 羊附红细胞体特异性抗原制备72.2.1 羊附红细胞体抗原蛋白悬液72.2.2 兔抗羊附红细胞体阳性血清的制备72.2.3 兔阴性血清的制备72.2.4 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE试验72.

2、2.5 主要抗原蛋白的切胶纯化82.2.6 纯化抗原蛋白的SDS-PAGE试验82.2.7 纯化抗原蛋白的免疫印迹试验及特异性抗原蛋白的筛选82.2.8 羊附红细胞体特异性抗原的制备103 研究结果与分析103.1 解离液蛋白浓度测定103.2 羊附红细胞体特异性抗原制备结果103.2.1兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果103.2.2 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE分析结果103.2.3 纯化抗原蛋白SDS-PAGE分析结果114 讨论125 结论14参考文献：15致 谢16 羊附红细胞体特异性抗原制备技术研究 摘要：为了提高羊附红细胞体(Eperythrozoon ovis)血

3、清学诊断的特异性和敏感性，本研究探索一种准确高效的羊附红细胞体特异性抗原制备技术。采集红细胞感染率90%的羊附红细胞体阳性抗凝血，应用药物体外驱虫法（每200mL血液依次加入双向红莲灭1mL）对羊附红细胞体进行解离，制备羊附红细胞体悬液。经过超声波裂解，制备附红细胞体抗原全蛋白悬液。应用羊附红细胞体抗原蛋白裂解液免疫家兔，制备兔抗羊附红细胞体阳性血清。将所制的的抗原蛋白进行SDS-PAGE试验，观察羊附红细胞体全抗原蛋白组分，选择4条染色较深的抗原蛋白进行切胶纯化，应用SDS-PAGE检验纯化结果，再应用免疫印迹技术（Western-blotting）确定有免疫原性的抗原蛋白成分。利用切胶纯化

4、技术收集有免疫原性的抗原蛋白成分。结果表明，羊附红细胞体抗原全蛋白经SDS-PAGE试验后，有4条抗原蛋白带显色较深。应用切胶技术分离此4条蛋白条带（条带1、条带2、条带3和条带4），经分析分子量分别为115.35kDa（道尔顿），74.13 kDa，68.87 kDa，32.96 kDa，免疫印迹试验表明，条带1、2、3为阳性，且条带2中只有部分成分与抗体反应，而条带4为阴性。因此，确定分子量为115.35kDa和68.87 kDa两条蛋白带为羊附红细胞体特异性抗原蛋白。 关键词：羊附红细胞体；体外驱虫；特异性抗原；切胶纯化The Study on Preparation of Specif

5、ic E.ovis Antigen Abstract：To improve specificity and sensitivity of serum diagnostic method to sheep Eperythrozoonosis, an accurate, efficient and specific antigen preparation technology was explored in the study.The positive anticoagulant blood (erythrocyte infection rate 90%) for Eperythrozoon ov

6、is was collected, and Eperythrozoon suspension was prepared using deworming methed in vitro.Eperythrozoon suspension was broke and cracked using the thawing - ultrasonic lysis method to prepare crude antigen solution. The crude antigen solution was used to immunize rabbits to prepare rabbit anti-she

7、ep Eperythrozoon positive serum. The prepared antigen protein was adopted for SDS-PAGE experiment, the whole Eperythrozoon wenyoni antigen protein component was observed. Four deeper staining antigen proteins were selected to cut out from gel and purify. The pure rusult was tested through SDS-PAGE.T

8、hrough the transfer electrophoresis and immune staining, the color of imaging protein band in nitrocellulose membrane can confirm whether these antigen proteins have the immunogenicity and the antigen proteins with immunogenicity were collected.The results showed the four protein bands of the Eperyt

9、hrozoon ovis entire antigen protein were stained deeply , Molecular weight of four separated protein bands (band 1, band 2, band 3 and band 4) using cutting gel technology was 115.35kDa，74.13 kDa，68.87 kDa，32.96 kDa，respectively. Western blot test showed that band 1, 2 and 3 were positive, and part

10、ingredient in band 2 responsed with antibody. The band 4 was negative.So the protein bands whose Molecular weight was 115.35kDa and 68.87 kDa were identified as specific antigen protein of Eperythrozoon ovis.Keywords: Eperythrozoon ovis; deworming methed in vitro; Specific antigen; Gel purified引言羊附红

11、细胞体病是由羊附红细胞体(E. ovis)寄生于羊的红细胞表面及血浆中所引起的一种烈性传染病，以发热、黄疸、溶血性贫血为主要症状，也可能和其它疾病混合感染，表现不同交叉症状。急性感染的羊临床症状典型，严重病例出现溶血性贫血，造成死亡，给养羊业造成巨大的经济损失。目前，诊断该病常用的镜检法准确性较差，血清学诊断因提取抗原的纯度较低，其特异性和灵敏性受到了影响，因此确诊该病有一定困难，在临床上往往因此而延误治疗时机，因此已经引起动物医学界的高度重视。探索快速准确的诊断方法是控制该病的有效途径，而获得高纯度抗原是关键。1986年， Lang首次从绵羊红细胞上分离出附红细胞体，1988年，Hall对L

12、ang的方法进行了改进，建立了分离附红细胞体的方法，推进了附红细胞体病血清学诊断和分子生物学研究的进程1。目前该方法仍被广泛应用，但存在收率低、纯度差等不足之处。在制备过程中，采血、洗涤红细胞以及摇床振摇等操作都可能造成红细胞溶血，导致所制备的抗原纯度降低，这必然影响血清学检测的准确性和特异性。针对这一问题，许多学者正在努力探索附红细胞体解离的方法，以求获得高纯度抗原。贾立军等于2004年比较了水浴法和化学试剂法解离猪附红细胞体效果，结果显示水浴法优于化学试剂法， 于2005年将两种方法用于解离牛附红细胞体，结果化学试剂法比水浴法好2,3。也有应用低渗法、皂素法和冻融法裂解红细胞，然后收集附红

13、细胞体的方法，但这些方法获取的抗原纯度均不是很高，收率低，并且工作量和难度都比较大。本研究在前人研究的基础上，应用药物体外驱虫法，从被感染羊血样中分离附红细胞体抗原，应用切胶纯化技术、SDS-PAGE和免疫印迹技术分析粗制羊附红细胞体的抗原成分，探究并提取有良好抗原性的蛋白成分，并制备特异性抗原，为建立特异、灵敏的血清学诊断方法奠定基础。1材料1.1实验动物 健康雄性家兔，体重2.02.5Kg，由张家口市某种兔场提供；小尾寒羊，选自张家口市某养殖场。1.2 主要试剂双向红链灭（又名复方三氮脒注射液，江西省百思特动物药业有限公司生产。规格 10ml：三氮脒0.2g ，多西环素0.2g）、酶标羊抗

14、兔IgG HRP、牛血清白蛋白（BSA）、低分子量标准蛋白质、辣根过氧化物酶（HRP）、Taq DNA 聚合酶、EcoR I核酸内切酶、dNTP Mixture、DNA Marker(DL2000)、蛋白酶K。 1.3 主要仪器单条可拆卸酶标板、DYCZ-24D双垂直电泳槽、YYCP-31DN水平电泳槽、DYCZ-40D型转印槽、Anke TGL-20B低速离心机、高速台式冷冻离心机（Anke TGL-16G-A）、WDP型微生物多用培养箱、 紫外可见分光光度计UV755B、 MULTISKAN MK3酶标定量测定仪（Thermo）、JY88-2超声波细胞粉碎机、DYY-10C型电泳仪、WD-

15、9413B凝胶成像分析仪、PCR扩增仪。 2方法2.1应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原2.1.1采集血样 无菌颈静脉采集羊血液，3.8%柠檬酸钠抗凝，镜检，发现红细胞感染率大于90%，符合试验要求。2.1.2 羊附红细胞体解离 血液经2000r/min离心10min，去除血浆、白细胞及血小板，用生理盐水洗涤红细胞3次，加入生理盐水复原体积，于200ml血液加双向红链灭1.0mL，4作用36h，使附红细胞体游离红细胞。将药物体外驱虫法解离后的血液3000 r/min离心15min，取上清液。将所得的上清液12000r/min离心40min，沉淀即为附红细胞体抗原，加适量生理盐水。2.1.3

16、 制备羊附红细胞体抗原全蛋白悬液 将制备的附红细胞体抗原进行超声波裂解（功率60w，裂解时间10min），即得羊附红细胞体抗原全蛋白悬液。2.1.4 测定蛋白质浓度：取50L附红细胞体抗原全蛋白悬液，加2950L生理盐水稀释，用紫外可见分光光度计分别测定其在260nm和280nm的吸光度(A)值，按照公式 蛋白浓度=（1.45A280 nm-0.74A260 nm）稀释倍数，计算其蛋白含量。2.1.5 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE4-6选取全蛋白裂解液，进行SDS-PAGE实验，观察电泳结果。（1）制胶11%分离胶配制：30%丙烯酰胺溶液5.5mL1 mol/L Tris-HCl

17、(pH8.8)5.6 mL10%过硫酸铵0.1 mLTEMED0.01 mL蒸馏水3.85 mL10% SDS0.15 mL （最后加入，混匀立即使用。）5%浓缩胶配制：30%丙烯酰胺溶液1.66 mL1mo1/L Tris-HCl (pH6.8)1.26 mL蒸馏水6.8 mL10%过硫酸铵0.1 mLTEMED0.01 mL10%SDS0.1 mL（最后加入，混匀立即使用。）按照DYCZ-24D双垂直板电泳槽说明书安装制胶器及其玻璃板，将配制好的分离胶混匀后，迅速倒入两玻璃板间的缝隙内至玻璃板凹槽约3cm处，避免气泡产生，如有气泡立即清理。然后在胶面上轻铺一层双蒸水，将凝胶板垂直放置于室温

18、下有光处。待分离胶凝聚完全后(大约0.5h)，倾出覆盖层面上的水，并用少量浓缩胶冲洗胶面，向玻璃板缝隙中倒入浓缩胶至与玻璃板凹槽处平齐，迅速插入所选梳子，室温下再凝聚0.5h。慢慢取出梳子，用蒸馏水冲洗加样孔凹槽后，再用干净滤纸细条轻轻将加样孔中多余水分吸出，避免破坏胶体。然后倒入10倍稀释好的电泳缓冲液，电泳液高度要没过玻璃板里槽短板，保证胶体都浸入电泳液，而外槽不超过长板。（2）加样及电泳将低分子量标准蛋白质（-20保存）按照说明书，在室温下融化后直接使用。在等待胶体凝聚的过程中，可将待测样品与等量的2倍上样缓冲液混匀，浓度控制在4mg/mL，并于沸水浴中加热2 min，冷却后即可上样。用

19、50L规格的微量进样器在样品槽内分别加人标准分子量蛋白10L和待测样品25L。接通电源，于80V恒压下电泳，注意观察，当溴酚蓝离开浓缩胶部分刚进入分离胶后，电压马上改为110V，继续注意观察，直至指示剂移至凝胶底部，大约1.5h，电泳结束关掉电源。（3）考马斯亮蓝染色及脱色 小心取出凝胶勿破损，置于大平皿中用蒸馏水漂洗3次，以去掉残留电泳液。加入考马斯亮蓝R250染色液，使凝胶能悬浮于染液中，为保证染色均匀，将其于摇床上缓慢震荡1h，弃去染液，用蒸馏水漂洗35次，加入考马斯亮蓝脱色液，再于摇床上作用1h后，更换脱色液，再作用，如此23次直至蛋白条带清晰为止。利用凝胶成像系统拍照。2.2 羊附红

20、细胞体特异性抗原制备2.2.1 羊附红细胞体抗原蛋白悬液 选用2.1中体外驱虫法获得的羊附红细胞体抗原蛋白悬液。2.2.2 兔抗羊附红细胞体阳性血清的制备将制备的羊附红细胞体抗原蛋白液蛋白含量调为3.03.2mg/mL，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等体积混合，乳化，按以下免疫程序免疫家兔：表1 家兔免疫程序时间（d）抗原方法接种量（mL/只）1弗氏完全佐剂抗原兔腘淋巴结、两后腿足部及背部皮下分点注射1.57弗氏完全佐剂抗原背部皮下分点注射1.514弗氏不完全佐剂抗原肩部肌肉、背部皮下分别分点注射3.021不含佐剂抗原耳静脉注射1.5每周免疫前心脏采血，分离血清，用间接ELISA法测定其效

21、价，35d时，再心脏采血，分离血清测效价，待其效价达11280时，颈动脉无菌采血于离心管中，37水浴0.5h，4静置12h，2500r/min离心10min分离血清，-20保存。2.2.3 兔阴性血清的制备选镜检为附红细胞体阴性的两只健康家兔，注射地塞米松（0.3mg/w.kg.d）（免疫抑制剂），连用7天，隔离饲养14天，在此期间，每天镜检，一周后均未发现感染，则确定为阴性。心脏采血100mL于离心管中，37水浴0.5h，4下静置12h，2500r/min离心10min，分离吸取上清作为阴性对照，20保存。2.2.4 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE试验按2.1.5方法进行羊附红细胞

22、体抗原全蛋白的SDS-PAGE试验。2.2.5 主要抗原蛋白的切胶纯化7,8以2.1.5中经染色脱色后的凝胶显示的蛋白条带的位置和染色程度为参照，找出4条显色明显的条带，认为可能是比较主要的蛋白成分，将其作为目的条带。再次将提取的羊附红细胞体抗原按2.1.5经SDS-PAGE方法电泳后，立即将胶置pH 13.0，4mol/LNaAc溶液中在脱色摇床上振摇725min，在黑色背景下观察，抗原蛋白被染成棕褐色，而胶体呈乳白色，对照2.1. 6中染色后的结果，将被选的4条目的蛋白切割下来，分别置于装有蒸馏水的平皿中在脱色摇床上振摇20min，脱去NaAc。剪4个大小相同的透析袋于蒸馏水沸水浴加热10

23、min，待冷却后将脱色干净的4条蛋白胶带分别放入其中（作好标记以区分），装满电泳液并用线密封好，再将透析袋置水平电泳槽内，有胶块的一端靠近负极，在120V的电压下作用3h，使目的蛋白游离出来，然后反向接通电源6min，使膜上的蛋白回到透析袋内的电洗脱液中。然后将透析袋直接用PBS溶液4透析过夜。根据试验所需浓度，将经透析过夜后的目的抗原蛋白用聚乙二醇（PEG-6000）浓缩并收集，再经3000r/min离心5min，除去沉淀的SDS，收集上清液。此上清液即为切胶纯化的目的抗原蛋白。2.2.6 纯化抗原蛋白的SDS-PAGE试验将2.2.5中纯化后的4种羊附红细胞体抗原蛋白成分进行SDS-PAG

24、E垂直电泳，经考马斯亮蓝染色脱色后，观察出现的条带，再次确认4种抗原蛋白，从而验证切胶纯化后的目的蛋白是否已回收。2.2.7 纯化抗原蛋白的免疫印迹试验及特异性抗原蛋白的筛选（1）转印电泳同时制作两板胶，对分离纯化的4种羊附红细胞体抗原蛋白成分进行SDS-PAGE试验，待溴酚蓝移至凝胶底部时，停止电泳。参照抗体技术实验指南所指导的方法，按照分离胶的长和宽，剪两张硝酸纤维素膜(NC膜) 和八张滤纸，大小均为8.3cm5.4cm，将其与海绵垫一起浸泡于转印缓冲液中约l2min。将胶体的浓缩胶部分切除并标记清楚方向，将分离胶部分放于盛有转印缓冲液的培养皿中，浸泡12min。按照一种“三明治”式的特殊

25、方法放置：夹子+海绵垫+两层滤纸+凝胶+NC膜+两层滤纸+海绵垫+夹子 （见图1），凝胶紧贴NC膜的光滑面。为确保各层之间准确对齐并不留气泡，要不断地滴加转印缓冲液随时保持湿润，并防止凝胶破裂。将按此顺序摆放好的三明治式转印夹层固定在转印槽内，加入转印缓冲液，阴极连接凝胶一侧，阳极连接NC膜一侧，恒压65V，4转印5h。电转印结束后，取出并打开转移盒，分别用夹子夹取NC膜，将其移入至水中5min以上，以驱除留于膜上的气泡。再将NC膜转移至盛放丽春红染色液的小平皿中，使NC膜能悬浮在染液中，染色7min，其间轻轻摇动平皿，以便充分作用，使染色均匀，待蛋白带出现后，用双蒸水漂洗NC膜，用铅笔迅速标

26、出蛋白Marker的位置，否则速度慢将使出现的蛋白带又变得模糊不清。图1 转印夹层组合Figure 1 transfer printing sandwich combination （2） 转印效果检验为检验蛋白质是否转移彻底，在转印电泳结束后，将凝胶块用考马斯亮蓝R250染色并脱色，观察结果，并拍照记录。（3） 免疫染色膜封闭：将NC膜用0.05%的TBST洗膜三次，10min/次，为保证清洗彻底，要置于摇床上振摇。用3%的BSA/TBS封闭液浸泡NC膜，37摇床上封闭1.5h。封闭后用TBST洗三次（摇床上），每次10min。加一抗：将兔抗羊附红细胞体阳性血清及兔阴性血清用0.5%的BSA

27、/TBS作180稀释，将两张NC膜分别放入其中，37振摇2h。摇床上用TBST分别洗膜三次，每次10min。加二抗：将二抗(羊抗兔IgG-HRP) 用0.5% BSA/TBS作1300稀释，再将两张NC膜放入， 37振摇2h。同样于摇床上用TBST洗膜三次，每次10min。NC膜显色：在小平皿中放入适量的底物显色液（DAB溶液），将洗涤过的NC膜放人其中，置于暗处反应，并观察，当斑点显影满意时（约25 min），迅速取出，用双蒸水洗膜三次以终止显色。显影后的NC膜置两层滤纸中间使其干燥。 （4） 筛选有免疫原性的特异性蛋白成分根据NC膜上显影干燥后的蛋白条带颜色筛选出有免疫原性的抗原蛋白成分，

28、并将NC膜放于凝胶成像系统中拍照。2.2.8 羊附红细胞体特异性抗原的制备按照2.2.5的方法，将2.2.7中筛选的2条特异性蛋白条带切割纯化并收集，即为所制备的特异性抗原蛋白悬液。3 研究结果与分析3.1 解离液蛋白浓度测定解离液裂解后测定抗原蛋白浓度，结果见表2。表2 抗原蛋白质浓度测定内容CA260nm0.493A280nm0.453蛋白质浓度（mg/mL）17.5263.2 羊附红细胞体特异性抗原制备结果3.2.1兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果免疫35天后，心脏采血分离血清抗体效价达到1：2560，符合试验要求。劲动脉无菌采血收集血清。3.2.2 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-

29、PAGE分析结果对羊附红细胞体抗原蛋白进行SDS-PAGE试验，经考马斯亮蓝R250染色后，得到染色程度不同的蛋白带，选择4条染色较深的蛋白带，用以切胶纯化（见图2）。M 197.2 kDa66.4 kDa44.3 kDa29.0 kDa20.1 kDa14.3 kDa图2 羊附红细胞体抗原蛋白的SDS-PAGEM：低分子量标准蛋白；1：羊附红细胞体抗原蛋白Figure 2 sheep with the infection of sds-page protein antigenM: low molecular weight standard protein; 1:sheep with the

30、infection antigenic protein3.2.3 纯化抗原蛋白SDS-PAGE分析结果对切胶纯化的4条抗原蛋白再次进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝R250染色后，出现4条蛋白带，与所要切割的目的蛋白吻合，说明抗原切胶纯化的结果准确，分离的蛋白确是所选的抗原蛋白，而且回收效果很好，4条抗原蛋白的分子量分别为115.35kDa，74.13 kDa，68.87 kDa，32.96 kDa（见图3）。97.2 kDa66.4 kDa44.3 kDa29.0 kDa20.1 kDa14.3 kDa74.13 kDa115.35 kDa68.87 kDa32.96kDd图3 切胶纯化

31、后的抗原蛋白的SDS-PAGEFigure 3 rubber cutting of purified protein antigen of SDS-PAGE3.2.4 纯化抗原蛋白免疫印迹及特异性抗原蛋白筛选结果 纯化后的4条羊附红细胞体抗原蛋白经SDS-PAGE后，进行电泳转印，免疫染色后，结果表明，有3条蛋白带（分子量分别为115.35kDa，74.13 kDa，68.87 kDa）均与兔抗羊附红细胞体抗体反应，第4条（分子量为32.96 kDa D）未出现反应带，4条带与兔阴性血清均不反应。说明分离纯化出的4条蛋白带中有3条具有免疫原性，但第2条显色带较细，说明反应的只是一部分蛋白成分。

32、据此，筛选出第1和第3条蛋白带为目的蛋白，即羊附红细胞体特异性抗原蛋白成分（见图4）。5 6 7 81 3 2 4 M 图4 羊附红细胞体抗原蛋白的免疫印迹 M：低分子量标准蛋白；1、2、3、4：兔抗羊阳性血清；5、6 、7、8：兔阴性血清Figure 4 sheep with the infection of antigenic protein immune prints M: low molecular weight standard protein; 1, 2, 3, 4: rabbit of positive serum sheep; 5, 6, 7, 8: rabbit negati

33、ve serum4 讨论4.1大量病例的误诊和延误治疗最佳时机的事实证明，获得高纯度抗原以提高羊附红细胞体血清学诊断是动物医学界势在必行，迫在眉睫的任务。20世纪80年代Hall建立并沿用至今的分离附红细胞体方法，虽然推进了附红细胞体病血清学诊断以及分子生物学研究的进程，但存在收率低、纯度差的弊端，这必然影响血清学检测的准确性和特异性以及灵敏性9-12。针对这一问题，本试验采用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原，应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）探究了羊附红细胞体的抗原蛋白组分，通过切胶纯化和免疫印迹(Western blot)试验筛选出并收集羊附红细胞体有良好抗原性的蛋白

34、成分，成功建立了一种羊附红细胞体特异性抗原制备技术，必将进一步推进羊附红细胞体血清学诊断的进程，对促进养羊业的健康发展起到积极作用。4.2本试验采用切胶纯化技术制备羊附红细胞体特异性抗原。该方法是用电场力把蛋白从切碎的胶中分离出来，即通过电泳将粗制抗原中的目的蛋白与其它蛋白分离，再使用弱碱性醋酸钠染色回收目的蛋白。醋酸钠与目的蛋白以非共价键结合后，再用蒸馏水脱去醋酸钠。识别目的蛋白的染色方法有多种，有使用考马斯亮蓝 R250的，但考马斯亮蓝与蛋白共价结合，会影响蛋白质的一级结构。国内亦有使用不染色切胶的方法，需要用对照染色的方法确定目的蛋白所在位置，但对照胶在电泳和染色脱色的过程中，常会发生改

35、变，与未染色胶比较时，切胶位置可能会发生偏移。本试验用弱碱性盐醋酸钠染色目的蛋白，目的蛋白被染成棕褐色（暗背景下），容易被蒸馏水脱色，不影响蛋白一级结构化学键，而且能保证切割的准确性。切胶纯化法与其它纯化蛋白法相比具有以下优点：(1)试剂材料价格低廉，无需复杂的仪器设备；(2)方法简便易行，可省去多次洗涤洗脱步骤，不需要昂贵的蛋白层析住；(3)一次可纯化大量蛋白，且试验周期短；(4)应用范围广，可用于绝大多数蛋白质的纯化。4.3免疫印迹技术是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。由于其具有 SDS-PAGE 的高分辨率、固相免疫测定的高特异性和敏感性、固相膜保存时间长等优点，

36、常用于鉴定某种蛋白成分，并能对蛋白成分进行半定量和定性分析。现已成为蛋白分析的一种常规技术，常用于抗原组分及抗原特性的分析等13,14。羊附红细胞体与大多数微生物一样也具有多种抗原成分，也可利用SDS-PAGE及免疫印迹技术分析羊附红细胞体抗原蛋白组分。4.4本试验对羊附红细胞体抗原全蛋白进行SDS-PAGE，通过观察选择4条染色较深的条带，利用切胶技术纯化后，经免疫印迹试验，有3条蛋白带均与兔抗羊附红细胞体抗体反应，显示阳性，分子量分别为115.35kDa，74.13 kDa，68.87 kDa，其中第2条免疫染色后条带变细，说明仅有部分蛋白成分具有免疫原性，因此确定分子量分别为115.35

37、kDa，和68.87 kDa的蛋白条带作为羊附红细胞体特异性蛋白。5 结论5.1 粗制羊附红细胞体抗原进行SDS-PAGE试验，分离胶浓度为11%，浓缩胶浓度为5%，加样量为4mg/mL-25L，于80V恒压下电泳，到达分离胶后电压改为110V。经染色脱色后可显示清晰的条带，主要为4条带；5.2 利用切胶纯化技术分离提纯4条主要条带：粗制羊附红细胞体抗原经SDS-PAGE后，置于pH 13.0，4mol/LNaAc溶液中振摇约10min，即可观察到条带。水平电泳电压为120V，作用3h，再反向接通电源6min，可达到较好分离效果。经SDS-PAGE检验，分子量分别为115.35kDa，74.1

38、3 kDa，68.87 kDa，32.96 kDa。细胞体阳性血清为180稀释，37作用2h； 二抗(羊抗兔IgG-HRP) 为1300稀释，37作用2h。结果表明，有3条蛋白带（分子量分别为115.35kDa，74.13 kDa，68.87 kDa）均与兔阳性血清反应，即羊附红细胞体抗原决定簇主要集中在3种蛋白质上。但第2条显色带较细，提示只是一部分蛋白成分反应。因此，将第1和第3条蛋白带作为目的蛋白，即羊附红细胞体特异性抗原蛋白成分。应用切胶纯化技术纯化该蛋白成分，成功建立了一种新型的羊附红细胞体特异性抗原制备技术。参考文献：1 S.M. Hall, J.A. Cipriano, D.A.

39、 Schoneweis, et al. Isolation of infective and non-infective Eperythrozoon suis bodies from the whole blood of infected swineJ. Veterinary Record, 1988, (123): 65.2 贾立军，柴方红，张守发.猪附红细胞体解离方法的比较J.延边大学农学学报，2004，26（4）：229232.3 贾立军，张守发，薛书江，等.牛附红细胞体解离方法的比较J.吉林畜牧兽医，2005，（6）：78.4 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法M.人民军医出版社，20

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