[精品论文]雷帕霉素促进人血管内皮细胞氧化低密度

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1、精品论文雷帕霉素促进人血管内皮细胞氧化低密度脂蛋白的自噬性降解张艳林，韩侨，尤寿江，曹勇军，李洁，肖国栋，张霞，刘慧慧，刘春风5（苏州大学附属第二医院，江苏 苏州 215004）摘要：目的 观察雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL） 聚集的影响，并探讨该作用是否与其促进 ox-LDL 的自噬性降解有关。方法 1.运用 Dil 标记 的 ox-LDL（Dil-ox-LDL, 100 g/ml）处理 HUVECs，采用流式细胞技术检测不同时间点下 HUVECs 中 Dil-ox-LDL 的聚集量，并在自噬诱导剂雷帕霉素干预下，观察 HUVECs 中10Dil-

2、ox-LDL 聚集量的变化。2.在雷帕霉素和自噬抑制剂 3MA 干预下，通过免疫荧光技术观 察 HUVECs 中 Dil-ox-LDL 与自噬标记物 MAP1-LC3、溶酶体标记物 Lamp-1 的共定位情况， 以及 MAP1-LC3 与 Lamp-1 的共定位情况；采用蛋白免疫印迹方法检测自噬/溶酶体途径标志蛋白 LC3、Beclin1、Lamp-1 和 P62 的蛋白含量，初步探讨雷帕霉素对 ox-LDL 在 HUVECs聚集的影响，是否与其激活自噬/溶酶体通路，促进 ox-LDL 的降解有关。结果 1.流式细胞15术检测结果显示 Dil-ox-LDL 在 HUVECs 中的积聚量随时间点

3、的延长而增加，3 h 时间点下， 雷帕霉素可减少 HUVECs 中 ox-LDL 的积聚。2.免疫荧光技术显示 3 h 时间点下，Dil-ox-LDL 与 LC3 及 Lamp-1 发生大量共定位，此时 LC3 与 Lamp-1 也大量共定位；免疫印迹技术结果 显示，ox-LDL 作用于 HUVECs 3 h 后，雷帕霉素能明显上调其 HUVECs 中 LC3、beclin1 蛋 白表达，降低 P62 蛋白水平。结论 雷帕霉素能抑制 ox-LDL 在 HUVECs 的聚集，该作用与20其激活自噬/溶酶体途径，促进 ox-LDL 的降解有关。关键词：雷帕霉素；氧化低密度脂蛋白；人脐静脉内皮细胞；

4、代谢；自噬/溶酶体途径中图分类号：R589.2；R743.1Ramamycin prompted the autophagic degradation of25oxidized LDL by human vascular endothelial cellsZhang Yanlin, Han Qiao, You Shoujiang, Cao Yongjun, Li Jie, Xiao Guodong, Zhang Xia, Liu Huihui, Liu Chunfeng(Second Affiliated Hospital,Soochow University, JiangSu SuZhou

5、215004)Abstract: Aims: Oxidized Low-density lipoprotein (ox-LDL) has a great implication in the30initiation of atherosclerosis. Our previous study reported that oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL) can activate autophagy in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Thereforestudies design

6、ed to elucidate the possible role of rapamycin, an autophagic inducer, in the degradation of ox-LDL by endothelial cells. Main methods: In the present study, we have examined the ox-LDL content determined by flow cytometry. The trafficking of ox-LDL within35endothelial cells was analyzed by immunofl

7、uorescence microscopy. Western blot was used todetect the protein level of LC3, LAMP1, beclin1 and P62. Key findings: Under these experimental conditions, we found that rapamycin could decrease the ox-LDL content. At 3h point, rapamycin group obviously upregulate Dil-ox-LDL/LC3 and Dil-ox-LDL/LAMP1

8、co-localization. In addition, at this time point, a significant colocalization of LC3 and LAMP1 occurred in the cells40with rapamycin pretreatment. In the presence of rapacymin, autophagic flux was enhanced and P62 level was reduced. Significance: Therefore, these data identify a critical function f

9、or rapamycin in ox-LDL metabolism and demonstrate that the activation of autophagic-lysosomepathway by rapamycin may accelerate ox-LDL degradation. This could have important基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20113201120016）；国家自然科学基金（81200894）； 江苏省自然科学基金（SBK201241136）作者简介：张艳林，（1981-），女，讲师 副主任医师，主要研究方向：1.动脉粥样硬化与

10、脑血管病；2. 睡眠障碍。韩侨，（1986-），女，硕士研究生，主要研究方向：动脉粥样硬化与脑血管病。 通信联系人：刘春风，（1965-），男，教授 博士生导师 主任医师，主要研究方向：1.帕金森病的基础与临床；2.动脉粥样硬化与脑血管病；3.睡眠障碍。E-mail: Liucf20- 2 -implications on the pathologic process of atherosclerosis. Earlier intervention to increase45autophagic function may therefore provide a new approach to

11、prevent ox-LDL accumulation andits associated pathological process.Keywords: rapamycin; oxidized LDL; HUVECs; degradation; the autophagy/lysosome pathway0引言50脂蛋白与内皮细胞间的相互作用是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成的关键环 节1。近年来，修饰脂蛋白，尤其是低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）在 AS 启 动及形成过程中的角色引起了学者们的广泛关注1。LDL 的某些修饰形式，如

12、氧化低密度脂 蛋白（oxidized LDL ，ox-LDL ）能通过表达于细胞的植物血凝素样低密度脂蛋白受体（lectin-like oxidized low-density lipoprotein-1，LOX-1）和清道夫受体（scavenger receptors）55被血管壁细胞吞噬，进而聚集，参与 AS 进展2-4。然而，对这些修饰脂蛋白在细胞内的代 谢过程却至今知之甚少。自噬是细胞自身保护的一种重要机理，它可以降解细胞内破损的细胞器、变性的蛋白质 和各种大分子物质，在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着十分重要的作 用，是近年来细胞生物学的一个重要进展5。近年来自噬机制

13、研究在帕金森病等神经系统疾60病的快速进展也为我们 AS 性疾病的防治提示了可能的新的防治干预靶点。然而对自噬在 AS 进程中作用的研究却在近年才引起学者们的关注，仅有的几篇报道也仅仅停留在现象上， 对自噬在血管壁细胞对损伤脂质代谢过程中的作用，仍不清楚。我们之前研究表明，ox-LDL 作用能增加培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的自 噬水平，该作用能被自噬诱导剂雷帕霉素所增强，6 小时上调自噬能减少 ox-LDL 在 HUVECs65中聚集，进而保护细胞免受 ox-LDL 引起的增殖、凋亡等损伤6,7，但对其作用

14、机制并未深入 观察。基于此，本研究动态观察 HUVECs 对 ox-LDL 的吞噬作用，及雷帕霉素对 ox-LDL 在 HUVEC 聚集的影响，并探讨其作用是否与雷帕霉素促进 ox-LDL 的自噬性降解有关。1材料和方法1.1 试剂和仪器70雷帕霉素、3 甲基腺嘌呤（3methyladenine，3MA）（Sigma, 美国），兔多克隆 MAP1- 微管相关蛋白轻链（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗体、鼠多克隆溶 酶体相关膜蛋白 1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP1）

15、抗体（abcam， 英国）、 小鼠单克隆 -actin 抗体（Sigma，美国）、兔多克隆 Beclin1 抗体、鼠多克隆 P62（Santa Cruz， 美国）；抗体辣根过氧化酶标记抗兔、小鼠二抗（Santa Cruz，美国）； BCA 蛋白测定试75剂盒、ECL 蛋白显色试剂盒（Pierce, Rockford，英国）。1.2 低密度脂蛋白的分离及氧化修饰用连续超速离心法8从正常人外周血中分离 LDL, 将 LDL 在 20 M Cu2SO4 的磷酸盐 缓冲液中，37°C 避光孵育 24 h, 用过量 EDTA 氧化得 ox-LDL。用琼脂糖电泳法鉴定 LDL 纯度，丙二醛测定试

16、剂盒鉴定 LDL 氧化程度。Ox-LDL 的值分别为非修饰 LDL 的 2.20 倍和80173.33 倍。1.3 细胞及实验分组HUVEC-2C 由上海吉凯基因化学技术有限公司馈赠。- 12 -8590951001051101151.3.1雷帕霉素对 ox-LDL 在 HUVEC 聚集的影响将对数生长期 HUVECs 接种于 12 孔板中，并随机分为：Dil-ox-LDL 组，雷帕霉素+ Dil-ox-LDL 组，3MA+ Dil-ox-LDL 组，干预组的雷帕霉素（10 nM）和 3MA（10 mM）预 先培养 0.5 h，然后再加终浓度 100 g/ml 的 Dil-ox-LDL 分别培

17、养 3 h，6 h，18 h，24 h。1.3.2雷帕霉素影响 ox-LDL 在 HUVEC 聚集的机制研究将对数生长期 HUVECs 接种于 24 孔板（用于荧光免疫染色）或 6 孔板（用于免疫印迹 检测）中，并随机分为：正常对照组，Dil-ox-LDL/ox-LDL 组，雷帕霉素+ Dil-ox-LDL/ox-LDL 组，3MA+ Dil-ox-LDL/ox-LDL 组，干预组的雷帕霉素（10 nM）和 3MA（10 mM）预先培 养 0.5 h，然后再加终浓度 100 g/ml 的 Dil-ox-LDL/ox-LDL 培养 3 h。1.4 流式细胞技术检测对 HUVEC 中 Dil-ox

18、-LDL 含量上述各组到达培养时间后终止培养，弃原培养基；PBS 洗 3×5min；后加入胰酶消化 3 分钟，弃胰酶；每孔加入 600 µl 的 PBS 催打细胞，成细胞悬液，并转移到流式管中上机检 测。1.5 荧光免疫细胞技术检测 HUVECs 内 MAP1-LC3、LAMP1 蛋白表达实验组细胞培养中止后，弃培养上清，PBS 洗涤 3×5 min；4%多聚甲醛 PBS 缓冲液固 定 20 min；弃固定液，1BSA 封闭液封闭细胞，4 ，1 h；弃封闭液，LC3、LAMP1（1:500 稀释）一抗孵育，4 过夜；弃一抗，PBS 洗涤 3×10min；

19、cy3 标记抗兔二抗、FITC 标记抗 鼠二抗（1:800 稀释）37 孵育 2 h；弃二抗，PBS 洗涤 3×10 min，DAPI（50 g/ml）染液 室温孵育 10 min；弃 DAPI 染液，PBS 洗涤 3×10 min，荧光封片液封片；Leica 激光共聚焦 显微镜采集图像，并定量每组细胞玻片抗原阳性染色强度（每组选 5 张玻片，至少 50 个细 胞）。（第 6-9 步避光操作）1.6 Western-Blot 检测 LC3，P62，beclin1，LAMP1 的表达Western-Blot 检测 LC3-II、LC3-I、P62、beclin1 和 LAMP

20、1 蛋白表达：将培养终止的HUVECs 用预冷的 PBS ( PH = 7.4 ) 洗 2 次，把细胞刮落后离心 1000 rpm，5 min；每组加入60-100 l 预冷的细胞裂解液，冰上放置 30 min，超声细胞破碎仪破碎细胞。用 BCA 蛋白测 定试剂盒测定总蛋白含量。取适量样品，进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。聚偏二氟乙 烯(PVDF)膜用甲醇活化 5 s 后，在电转移架上恒流 400 mA 转移（40-100 min）。PVDF 膜用 含 50 g/L 脱脂奶粉的 TBST 封闭 1 h。然后用 TBST 按 1:400-1000 稀释的一抗与 PVDF 膜 4°

21、C 下孵育过夜，并轻柔摇动。再用相应二抗 ( 1:5000 ) 与 PVDF 膜室温孵育 2 h。化学发光法检 测膜上目的蛋白表达。扫描后用 Sigma Scan Pro5 图像分析系统对蛋白条带进行定量分析。1.7 统计学分析每个实验至少重复 3 次。实验数据组间比较用 t-test 检验，以 P0.05 为差异有统计学 意义。2结果2.1 不同时间点下，ox-LDL 在 HUVECs 内的聚集量Dil 标记 ox-LDL（Dil-ox-LDL 100 g/ml）在 HUVECs 中含量呈时间依赖性（3 h、6 h、精品论文12012513013518 h、24 h）增加，3 h 时间点下，

22、Dil-ox-LDL 在 HUVECs 中聚集量为 8.53，24 h 时增加至99.45（图 1A、B）。图 1 ox-LDL（3 h-24 h 时间点下）进入 HUVECs 中的含量（注：横坐标为时间点，纵坐标为 HUVECs 中荧光标记的 ox-LDL 含量；与 3 h 时间点相比， # P <0.05。n = 3 注：流式图中标记的 ox-LDL 3 h（8.53）表示在 3 h 时间点下，含 Dil 荧光染料标记的 HUVECs 细胞 占这一时间点样品中所有细胞的 8.53%）Fig. 1 The content of Dil labled LDL in HUVECs2.2 雷

23、帕霉素不同时间下对 ox-LDL 在 HUVECs 中聚集的影响HUVECs 暴露于 ox-LDL 3 h 时间时，雷帕霉素明显减少 ox-LDL 在 HUVECs 中聚集（图2 A、B）。随着时间点的延长，雷帕霉素对 HUVECs 中 ox-LDL 积聚的影响不明显（图 2 B）， 因此我们仅放了 3 h 时间点的流式图。图 2 雷帕霉素对HUVECs中ox-LDL含量的影响（注：A 为 3 h 时间点时的流式图；B 为所有时间点统计图；每个时间点内，与 ox-LDL 组相比 * P <0.05，* P <0.01，其中，3 h 时间点时，* P=0.032，* P=0.003；

24、不同时间点之间，与 3 h 时间点 ox-LDL 组相比# P <0.05，# P <0.01。n = 3 ）Fig. 2 Effect of rapamycin on the accumulation of Dil-LDL in HUVECs1401451501552.3 ox-LDL 处理后 HUVECs 中 Dil-ox-LDL 与 MAP1-LC3 和 LAMP1 的定位情 况ox-LDL 组：细胞内 Dil-ox-LDL 含量随时间延长逐渐增多，存在 LaAMP1、LC3 与 Dil-ox-LDL 少量共定位（图 3）；3MA 组： Dil-ox-LDL 含量较 ox-L

25、DL 组增加，Dil-ox-LDL 与 LC3 共定位明显减少，与 LAMP1 共定位增加（图 3）；雷帕霉素组： Dil-ox-LDL 含量 较 ox-LDL 组减少， Dil-ox-LDL 与 LC3、 LAMP1 共定位明显增多（图 3 白色箭头示）， 提示雷帕霉素促进 ox-LDL 入胞后被自噬体及溶酶体包裹。图 3 雷帕霉素和 3MA 对暴露于 ox-LDL 3 h 的 HUVECs 内 Dil-ox-LDL 与 LC3、LAMP1 共定位的影响（注：A: FITC 荧光标记 MAP1-LC3 蛋白表达，B: FITC 荧光标记 LMAP1 蛋白表达。标尺示 25 m，从上 到下分别

26、为 Dil-ox-LDL 组，Dil-ox-LDL+3MA 组，Dil-ox-LDL+rap 组，白色箭头示，rap 处理后明显降低了细胞中 Dil-ox-LDL 的荧光量，此时 Dil-ox-LDL 与 LC3 发生大量共定位）Fig. 3 Effect of rapamycin and 3MA on the colocalization of Dil-LDL with MAP1-LC3 and LMAP1 inHUVECs2.4 ox-LDL 处理后 HUVECs 中 MAP1-LC3 和 LAMP1 的定位情况免疫荧光技术结果显示，在 ox-LDL 作用 3 h 时间点下，与对照组和 3

27、MA 预处理组相 比，雷帕霉素明显增加了 MAP1-LC3 和 LAMP1 的细胞共定位情况（图 4），提示雷帕霉素 促进 ox-LDL 作用后 HUVECs 中自噬泡和溶酶体融合，即自噬溶酶体形成增多。160165图 4 免疫荧光显微镜观察雷帕霉素和 3MA 对暴露于 ox-LDL 3 h 的 HUVECs 内 LC3 与 LAMP1 共定位的影响（注：FITC 绿色荧光标记 LAMP1 蛋白表达，cy3 红色荧光标记 MAP1-LC3 蛋白表达，标尺示 25 m，从 上到下分别为 ox-LDL 组， ox-LDL+3MA 组， ox-LDL+rap 组，白色箭头示，rap 处理后细胞中 M

28、AP1-LC3 与 LAMP1 发生大量共定位）Fig. 4 Effect of rapamycin and 3MA on the colocalization of MAP1-LC3 and LMAP1 in HUVECs exposed to ox-LDL for 3 h1702.5 雷帕霉素对 ox-LDL 上调 HUVECs 中 LC3-II/LC3-I 及 beclin1 蛋白表达的 影响免疫印迹技术检测细胞自噬标志蛋白 LC3-II/LC3-I 及 beclin1 蛋白表达（图 5. A、B） 表明，雷帕霉素明显上调 ox-LDL 作用后 HUVECs 中 LC3-II/LC3-I

29、 和 beclin1 蛋白表达，蛋 白上调水平明显高于对照组和单纯 ox-LDL 作用组，3MA 作用后结果与之相反，说明 HUVECs 暴露于 ox-LDL 3 h 后，雷帕霉素上调了 HUVECs 的自噬水平。175180185图 5 雷帕霉素对 ox-LDL 上调 HUVECs 中 LC3-II/LC3-I、beclin1 蛋白表达的影响（注：从左到右依次为对照组、ox-LDL组、ox-LDL+3MA组、ox-LDL+rap组，与正常对照组相比 * P <0.05，* P <0.01；与ox-LDL组相比 # P <0.05，# P <0.01。n = 3）Fig

30、. 5 Effects of rapamycin and 3MA on the upregulation of LC3-II/LC3-I and beclin1 protein levels induced by ox-LDL2.6 雷帕霉素对 ox-LDL 处理后 HUVECs 中 P62、LAMP1 蛋白表达变化的影 响雷帕霉素明显降低 HUVECs 中 P62 蛋白水平，3MA 作用后 P62 蛋白水平明显增高，表 明此时雷帕霉素促进自噬流的完成，自噬底物降解从而使 P62 蛋白水平降低（图 6 A）；免 疫印迹技术检测细胞 LAMP1 蛋白表达（图 6 B）表明，较单纯 ox-LDL

31、组相比，雷帕霉素 作用后上调 HUVECs 的 LAMP1 蛋白表达，3MA 组：LAMP1 蛋白表达增高程度高于雷帕霉 素组，提示此时自噬抑制剂对溶酶体激活高于自噬诱导剂，自噬抑制后溶酶体被大量激活， 与前面免疫荧光结果相一致。190195图 6 雷帕霉素对ox-LDL调节HUVECs 中 P62、LAMP1蛋白表达的影响（注：从左到右依次为对照组、ox-LDL组、ox-LDL+3MA组、ox-LDL+rap组，与正常对照组相比 * P <0.05，* P <0.01；与ox-LDL组相比 # P <0.05，# P <0.01。n = 3）Fig. 6 Effect

32、s of rapamycin and 3MA on the change of p62 and LAMP1 protein levels induced by ox-LDL3讨论2002052103.1 氧化低密度脂蛋白和血管内皮细胞血管内皮细胞覆盖在血管腔内表面，对于维持血管结构和功能的完整性具有重要的作 用，另外还参与调节凝血、炎症过程中白细胞的黏附、血管的紧张性等。ox-LDL 引起血管 内皮细胞功能障碍和内皮细胞损伤是启动 AS 发生的重要环节9。ox-LDL 做为一种氧化应激损伤性蛋白，不能经 LDL 受体途径代谢，而主要和 ox-LDL 受体识别、结合、内吞入细胞并丧失正常的胆固醇

33、代谢途径10，ox-LDL 摄入速度是天然 LDL 的 3-10 倍，且不受细胞内胆固醇含量的调节11。ox-LDL 能抵抗溶酶体酶和组织蛋白酶对它 的降解，造成细胞内脂质大量聚集而形成泡沫细胞12。进入细胞内的 ox-LDL 还可诱导细胞 一系列毒性反应，进一步增加内皮细胞的摄取量13。Dil 标记的 ox-LDL 能够被内皮细胞和巨噬细胞所吞噬，对细胞的活性无影响14。本实 验通过流式细胞术检测 HUVECs 中 Dil-ox-LDL 的荧光含量表明，ox-LDL 在 HUVECs 中的 积聚随时间点的延长而增加（图 1）。3.2 雷帕霉素减少 HUVECs 中 ox-LDL 的聚集我们之

34、前研究表明，雷帕霉素预处理能减少 ox-LDL 诱导的 HUVECs 损伤。TOR 激酶 是氨基酸、ATP 和激素的感受器，也是自噬的负调控分子，能抑制自噬的发生。哺乳动物 细胞中存在 TOR 的类似物 mTOR（mammalian target ofrapamycin，mTOR），它以一种类 似酵母中的机制调控着自噬。雷帕霉素通过抑制 mTOR 的活性，诱导自噬的发生15。那么215220225230235240245250在此雷帕霉素对 HUVECs 的保护作用是否与其调节 Dil-ox-LDL 在 HUVECs 中的积聚有关呢？实验结果表明（图 2），雷帕霉素预处理可明显减少早期 3 h

35、 时间点 ox-LDL 在 HUVECs中的积聚。奇怪的是，我们发现雷帕霉素并不能减少晚期（18 h，24 h）ox-LDL 的积聚，相反与对 照组和雷帕霉素组相比，自噬抑制剂 3MA 预处理后 ox-LDL 的含量明显降低，我们推测与3MA 长时间作用后致内皮细胞活性降低相关。我们课题组以前曾发现，3MA 作用内皮细胞18 h 和 24 h 后能明显降低内皮细胞的活性7。内皮细胞活性的降低可能使其细胞膜上结合、 吞噬 ox-LDL 受体的含量和活性下降，ox-LDL 进入 HUVECs 的过程受阻从而使其在细胞中 含量降低，该作用有待进一步证实。3.3 雷帕霉素减少 HUVECs 中 ox-

36、LDL 的聚集与其促进 ox-LDL 的自噬性降解 有关beclin1/PI3K-III 复合体参与了自噬泡的形成和自噬的启动，一种被广泛应用的自噬抑制 剂 3MA 就是通过抑制 PI3K-III 干预此途径而实现的16。实验结果表明，与雷帕霉素相反，3MA 能增加 3 h 时间点 ox-LDL 在 HUVEC 的积聚增加，提示雷帕霉素的此作用可能与其调 节自噬/溶酶体通路有关。3.3.1雷帕霉素增加 Dil-ox-LDL 处理 HUVECs 中自噬体、溶酶体数量，促进自噬体与溶 酶体的融合激活的自噬通过降解细胞内异常聚集的蛋白对细胞起保护作用，如果认为内皮细胞内吞 噬过多的脂蛋白是异常聚集蛋

37、白，那么雷帕霉素抑制 ox-LDL 聚集的作用是否与其激活自噬 促进 ox-LDL 的降解有关呢？Atg8 是在酵母中发现的一种为自噬形成所必须的泛素样蛋白质17。LC3 是哺乳动物 Atg8-PE 共轭体的同源物，LC3-II 是胞浆中的 LC3-I 经过剪切、脂解后的表达形式，为自噬 泡形成所必须，其含量与自噬泡的数量相关联18。LAMP1 是溶酶体膜的重要组份，其在介导自噬泡和溶酶体融合过程中起重要作用 19,20。溶酶体是自噬激活后发挥降解作用的最终 场所21，它负责细胞对入胞蛋白质的自噬性代谢22。自噬泡被诱导后，会与溶酶体融合形 成自噬溶酶体，进而实现对被包裹物质的降解 19,23

38、。我们研究发现（图 3,4），雷帕霉素预 处理后，Dil-ox-LDL（3 h）与 MAP1-LC3 及 LAMP1 发生共定位现象的同时，MAP1-LC3 和 LAMP1 在 HUVECs 内存在着大量共定位，共定位程度较对照组和 3MA 组明显增加。表 明雷帕霉素上调 ox-LDL 作用后 HUVECs 中自噬体和溶酶体形成增多的同时，也促进自噬 体和溶酶体融合。另外，我们发现 3MA 作用 3 h 后，HUVECs 中 Dil-ox-LDL 与 LC3 共定位明显减少， 与 LAMP1 共定位增加，提示抑制自噬情况下，溶酶体可直接吞噬 Dil-ox-LDL。P. gingivalis 是

39、一种存在于 AS 斑块中的致病菌。有研究表明，自噬可降解血管内皮细胞中 P. gingivalis。 在无自噬抑制剂干预下，内皮细胞中的 P. gingivalis 被自噬体包裹，继而进入溶酶体，并在自噬溶酶体中降解。在自噬抑制剂 3MA 干预下，侵入内皮细胞的 P. gingivalis 不经过自噬 体而直接包裹入溶酶体24，我们的结果与此相一致。3.3.2雷帕霉素促进 ox-LDL 处理 HUVEC 自噬溶酶体的降解 上述结果提示，雷帕霉素使 HUVECs 中的 ox-LDL 早期被自噬泡吞噬，继而包裹有ox-LDL 的自噬泡和溶酶体融合。beclin1 是哺乳动物体内酵母 Atg6 的类

40、似物25,26。Atg6255260265270275280285290（beclinl）复合体与自噬体形成的启动有关，beclin1/PI3K-III 复合体参与了自噬泡的形成和自噬的启动16。免疫印迹技术检测细胞 LC3-II/LC3-I、beclin1 蛋白含量是检测自噬流的公认 手段16。免疫印迹结果发现（图 5），雷帕霉素能上调 ox-LDL 处理细胞中 LC3、beclin1 蛋白表 达，与上述荧光免疫细胞结果一致，提示雷帕霉素能上调 ox-LDL 处理 HUVECs 的自噬水 平。然而在此增加的吞噬了 ox-LDL 的自噬泡及自噬溶酶体是否能被有效的降解？P62 是一 种在多种信

41、号传导途径中发挥作用的支架蛋白，泛素化的靶蛋白（包括错误翻译、错误折叠、 突变或变性的蛋白等）能与 P62C 端的的 UBA 发生结合，并通过 P62N 端的 PB1 结构域自 我聚集；该聚集体能通过 P62 上的 LPS /LIR 与 LC3 结合并形成复合物、并由 LC3 介导形 成自噬小体，最后自噬小体与溶酶体融合完成蛋白的降解27。自噬流的激活会导致胞内 P62 含量的降低28。细胞中 P62 蛋白水平可反映自噬是否最终完成。结果表明（图 6），雷帕霉 素在上调溶酶体膜蛋白 LAMP1 同时，明显降低 ox-LDL 作用后 HUVECs 中 P62 蛋白表达， 表明增加的自噬流促进自噬

42、溶酶体融合的同时，包裹入自噬溶酶体的 ox-LDL 被进一步降解， 从而使 P62 蛋白水平降低。在雷帕霉素干预下，HUVECs 中 ox-LDL 作为自噬底物，从自噬 泡运输至溶酶体，在 P62 介导下最终完成在自噬溶酶体中的降解，导致 HUVECs 中 ox-LDL 聚集的减少。自噬溶酶体途径作为细胞中异常蛋白的降解通路参与了 HUVECs 中 ox-LDL 的降解。最后值得注意的是，本文流式结果示（图 2），随着 ox-LDL 在细胞积聚量增多，雷帕 霉素并未使 HUVECs 中 ox-LDL 含量降低。对此，我们推测，ox-LDL 作为一种氧化应激脂 蛋白，其过量积聚可能干扰自噬体和溶

43、酶体正常膜结构，从而使二者融合障碍，ox-LDL 的 自噬性降解完成受阻。因有报道，高脂喂食的小鼠肝脏中自噬体和溶酶体融合存在障碍，推 测其作用与高脂引起自噬体膜结构脂质分布异常有关29。3.4 自噬对 ox-LDL 代谢调节具有重要意义关于自噬和脂质代谢的文章并不多，Shibata 等人做的研究中发现，在肝脏组织中，自 噬可通过脂质自噬动员脂滴中的脂质代谢30。给予自噬抑制剂 3MA 或者自噬基因 Atg5 的 敲除都可明显上调肝脏细胞中甘油三酯的含量。电镜结果显示脂滴存在于自噬囊泡中，免疫 共聚焦结果也显示脂质与自噬体和溶酶体蛋白发生共定位，提示脂质通过自噬通路降解。其 确切机制尚不清除。

44、大鼠 Atg7 敲除发现，自噬通过控制脂肪细胞分化，调节白色和棕色脂 肪的平衡，可调控机体脂质聚积，引起大鼠体重减轻31。上述研究多集中在肝脏组织和细胞中，我们的实验第一次阐述了自噬诱导剂雷帕霉素对 血管内皮细胞中脂质代谢的影响。发现，诱导自噬可抑制 ox-LDL 在 HUVECs 中聚集，其 机制与 ox-LDL 通过自噬溶酶体途径降解相关。ox-LDL 是 AS 发生、发展的核心环节，雷 帕霉素可通过促进内皮细胞中 ox-LDL 降解代谢延缓 AS 进展。但自噬同样具有双刃剑，过 度诱导自噬可至细胞死亡，因此，如何适时、适量诱导自噬发挥其在心脑血管疾病中最大保 护作用也将成为我们以后研究的

45、重点。4结论雷帕霉素早期作用可抑制 ox-LDL 在 HUVECs 中的聚集，该作用与其增加 HUVECs 中 自噬流水平，促进 ox-LDL 的自噬性降解有关。参考文献2953003053103153203253303353403453503551 Tabas I, Williams WJ and Borén J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: Update and therapeutic implications J. Circulation,

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