二氢石蒜碱对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血的保护作用

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1、二氢石蒜碱对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血的保护作用 作者： 蒋诗琴 余光清 龚培力摘 要 目的： 观察二氢石蒜碱（dihydrolycorine，DL）对小鼠心肌缺血损伤的保护作用。方法： 采用异丙肾上腺素（isoproterenol，Iso）致小鼠心肌缺血模型，检测DL对缺氧条件下小鼠存活时间及心肌缺血损伤后心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响。结果： 模型组缺氧条件下生存时间明显缩短，缺血损伤后心肌组织SOD活性显著下降，MDA含量明显升高，LDH和CK的活性明显升高，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)

2、；与模型组比较，随着药物剂量的增加，DL各剂量（15、30、60 mgkg-1）组生存时间明显延长，SOD活性逐渐回升，MDA含量逐渐趋于恢复正常，LDH及CK活性均明显降低，以DL 30及60 mgkg-1组作用更显著（P<0.01或P<0.05）。结论： DL明显延长小鼠存活时间，抑制Iso致小鼠心肌缺血后血清CK和LDH活性升高，增加心肌组织总SOD活性，减少心肌组织MDA生成。DL对Iso诱导的小鼠心肌缺血损伤具有保护作用。 关键词 二氢石蒜碱；异丙肾上腺素；心肌缺血；小鼠 Abstract: Objective To investigate the protective

3、effects of dihydrolycorine on myocardial ischemia injury induced by 30 mgkg-1 of isoproterenol sc in mice. Methods The myocardial ischemia injury model was developed by 30 mg kg-1 of isoproterenol sc in mice. The survival time of mice, the activities of SOD and levels of MDA in myocardium, the activ

4、ities of serum LDH and CK were all measured. Results The survival time of mice in the close normobaric hypoxia and the SOD activity in model group were decreased respectively after injured by isoproterenol, whereas the activity of LDH and CK and the content of MDA in model group were increased signi

5、ficantly (P<0.01 vs normal group). In mice injured by isoproterenol that were treated with 15, 30, 60 mg kg-1 dihydrolycorine, LDH and CK release and MDA content were decreased, while the survival time and SOD activity were increased in dose-dependent manner (P<0.05 vs model group). Conclusion

6、 The results showed that dihydrolycorine prolonged the survival time of mice in the close normobaric hypoxia, increased the activities of total SOD, and decreased the levels of MDA in myocardium. The activities of serum LDH and CK were also decreased. These results indicated that dihydrolycorine has

7、 protective effects on myocardial ischemia induced by isoproterenol in mice . Key words： Dihydrolycorine; Isoproterenol; Myocardial ischemia； Mice二氢石蒜碱（dihydrolycorine，DL）是从石蒜科植物石蒜的鳞茎中提取的石蒜碱经接触氢化而获得的一种异喹啉类生物碱，为吡咯骈啡里啶（pyrrophenthridine）的衍生物。早期的研究发现DL有抗阿米巴痢疾的作用，60年代以来，有研究发现DL有降压作用，对大鼠局部脑缺血/再灌注损伤亦有保护作用

8、1-5，最近的研究发现DL对培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用6，但DL对整体动物心肌缺血有无作用未见报道。本实验拟采用异丙肾上腺素（isoproterenol，Iso）致小鼠心肌缺血的整体动物模型，观察DL对小鼠心肌缺血损伤的作用。 1 材料和方法 1.1 动物昆明种小鼠，体重202 g，雌雄各半，雌鼠未孕，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 1.2 药品与试剂 二氢石蒜碱（dihydrolycorine，DL）：由郧阳医学院赵国举教授提供;普萘洛尔（propranolol，Pro）注射液：上海禾丰制药厂;盐酸异丙肾上腺素（isoproterenol，Iso）：上海禾丰制药

9、厂;SOD、MDA、CK、LDH、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所;其它试剂均为市售分析纯。 1.3 仪器低温高速离心机：德国Heraeus公司;ELx-800型酶标仪：美国 Bio Tech公司;可见紫外分光光度计：上海分析仪器厂;超声波细胞破碎仪：北京东方仪器厂。 1.4 异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血后小鼠常压耐缺氧试验7小鼠60只，随机分为6组：正常对照组：NS+NS;模型组：NS + Iso;阳性对照组：Pro 30 mgkg-1+ Iso;DL低剂量组：DL 15 mgkg-1+ Iso;DL中剂量组：DL 30 mgkg-1+ Iso;DL高剂量组：DL 60 m

10、gkg-1+ Iso。小鼠禁食12 h后，各组均腹腔注射（ip）预防给药，给药容积为0.2 ml/10 g体重。预防给药30 min后，各组小鼠背部皮下多点注射Iso 30 mgkg-1（正常对照组皮下注射等容积NS）造模。15 min后将小鼠放入容积为250 ml的密闭广口瓶中，塞上瓶盖，瓶口密封，瓶内放有25 g钠石灰，以呼吸停止为指标，观察并记录小鼠存活时间。 1.5 异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血模型8小鼠分组同上。各组小鼠分别按照给药剂量ip预防给药，给药容积为0.2 ml/10 g体重。每日一次，连续7 d。第5天开始，除正常对照组外，各组小鼠皮下注射Iso 30 mgkg-1（正常对

11、照组皮下注射等容积NS），连续3 d。末次给药后2 h，小鼠眼球采血处死，分离血清待测。 1.6 心肌组织匀浆制备9动物处死后，迅速开胸摘取心脏，置于04 生理盐水中洗净血液，滤纸吸干称重，剪碎，在冰面上按19（W/V）加入4 匀浆介质（pH 7.4，Tri s-HCl 10 mmol/L，蔗糖10 mmol/L，EDTA-Na2 0.1 mmol/L，NaCl 137 mmol/L），然后转入玻璃匀浆器中4 匀浆，3 000 r/min 4 离心15 min，上清液即为10%的组织匀浆液。采用考马斯亮兰法测定蛋白含量，分装于-70 冰箱保存备用。 1.7 观察指标CK活性测定采用N-乙酰半胱

12、氨酸法，LDH活性测定采用丙酮酸法，SOD活性测定采用邻苯三酚自氧化法，MDA测定采用硫代巴比妥酸法，按试剂盒操作说明书测定血清CK、LDH活性和心肌组织SOD活性、MDA含量。 1.8 统计分析所有数据均应用SPSS11.5统计分析软件包进行处理；多组间均数比较应用ANOVA法进行分析，两两间比较应用Student-Newman-Keulsa法进行q检验。数据应用均数标准差(xs)表示。P<0.05，P<0.01分别表示差异有显著性和差异有极显著性。2 结果 2.1 二氢石蒜碱对心肌缺血小鼠生存时间的影响小鼠心肌缺血后，模型组与正常对照组比较，小鼠生存时间明显缩短，具有显著差异（

13、P<0.01）。与模型组比较，Pro组及DL 15、30及60 mgkg-1组小鼠存活时间均延长，其中DL 30和60 mgkg-1剂量组具有显著性差异（P<0.01，表1）。表1 DL对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血后常压缺氧条件下小鼠生存时间的影响（略） 2.2 二氢石蒜碱对小鼠血清LDH及CK活性的影响 小鼠心肌缺血后，模型组与正常对照组比较，血清LDH、CK活性均增高，具有显著差异（P<0.01）。与模型组比较，Pro组及DL各剂量组LDH及CK活性均降低，以DL 30和60 mgkg-1组作用明显，差异显著（P<0.05或P<0.01，表2）。表2 DL对异

14、丙肾上腺素致小鼠心肌缺血后血清LDH和CK活性的影响（略） 2.3 二氢石蒜碱对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血后心肌组织SOD活性及MDA含量的影响小鼠心肌缺血后，模型组与正常对照组比较，小鼠心肌组织总SOD活性下降，MDA含量上升，具有显著差异（P<0.01）。Pro组及DL各剂量组均升高心肌组织总SOD活性，降低心肌组织MDA含量。其中DL 30及60 mgkg-1组SOD活性及MDA含量与模型组比较，差异具有显著性（P<0.01或P<0.05，表3）。表3 DL对异丙肾上腺素致小鼠心肌缺血后心肌组织SOD活性及MDA含量（略） 3 讨论小鼠常压耐缺氧实验是筛选抗心肌缺血药的

15、方法之一。对特异性增加心脏耗氧模型的小鼠，DL能明显延长其生存时间，增强整体动物在缺氧条件下的生存能力，说明DL能改善缺血心肌氧的供求矛盾，推测DL对小鼠心肌缺血可能有保护作用。CK和LDH的活力是评价心肌细胞损害程度的重要指标10。CK和LDH在心肌组织含量较高且分布均匀，当心肌细胞受到破坏时，胞浆中的LDH大量溢出。心肌缺血或心肌受损时，缺血心肌的CK和LDH的释放量增加，导致血清CK和LDH含量增加。观察CK和LDH的活力，有助于评价保护心肌药物的疗效。实验表明，模型组小鼠血清中CK、LDH活性比正常对照组明显增加，说明Iso对心肌细胞的损害导致血清CK、LDH活性增强，阳性对照组Pro

16、对缺血心肌具有保护作用，能明显降低缺血心肌小鼠血清中CK、LDH的活性。DL高、中、低剂量组的小鼠血清CK、LDH的活性明显降低，推测DL对小鼠缺血心肌细胞可能也具有保护作用。Iso是经典的肾上腺素受体激动剂，大剂量Iso可造成心肌收缩力增强，心率增快，心肌耗氧明显超过供氧，导致心肌缺血。目前认为Iso诱导的心肌损伤与心肌相对缺血缺氧、膜通透性改变、氧自由基损伤等有关。氧自由基蓄积可以引起细胞严重的功能障碍和死亡11-12。其损伤作用表现为：氧自由基作用于细胞的膜性成分，不仅消耗膜脂质成分，而且进一步产生脂质自由基、脂质过氧自由基、脂质过氧化物。由氧自由基和不饱和脂肪酸相互作用所引发的这种脂质

17、过氧化（lipid peroxidation）能破坏膜的结构和功能。SOD是心肌组织内重要的抗氧化酶，MDA为脂质过氧化反应的主要终产物，测定其含量可间接反应机体中自由基水平及脂质过氧化反应程度13。本实验表明：小鼠心肌缺血后，模型组与正常对照组比较，小鼠心肌组织总SOD活性下降，MDA含量上升（P<0.01）。DL能剂量依赖性地升高心肌组织总SOD活性，减少心肌缺血后心肌组织MDA生成，说明DL可能通过增强心肌组织清除氧自由基的能力、减少心肌组织脂质过氧化物生成等机制来减轻心肌缺血损伤。 （致谢：郧阳医学院赵国举教授对本课题的最终确立提供了非常宝贵的指导意见，并为本课题无偿提供了二氢石

18、蒜碱药品，在此谨致谢忱。） 参 考 文 献 1 陈必义，杜佐华，曾凡典，等.二氢石蒜碱的降压作用J.中国药理学报，1993,14(1)：45-49. 2 蓝星莲，潘龙瑞，龚新荣，等.二氢石蒜碱对家兔脑血管的选择性作用J.中国药理学通报，2002,18(3)：409-411. 3 邓春江，赵国举，任世兰，等.二氢石蒜碱与加兰他敏对小鼠学习记忆损伤的影响J.郧阳医学院学报，1996,15(2)：61-63. 4 龚应霞，彭仁，赵国举，等.二氢石蒜碱对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用J.中华新医学，2001,2(5)：393-394. 5 蒋诗琴，龙 燕，龚培力. 二氢石蒜碱的降压及抗脑缺血作用

19、J.郧阳医学院学报，2004,23(2)：122-124. 6 蒋诗琴，龚培力.二氢石蒜碱对大鼠乳鼠培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用J.中国药理学通报，2005,21(8)：999-1 002. 7 吴 波，陈思维，王敏伟，等.瓜蒌薤白白酒汤提取物抗心肌缺血缺氧及最佳处方的筛选J.中草药，2001,31（11）：844-845. 8 何建成，刘永玲，李 军，等.心肌康对异丙肾上腺素诱导小鼠心肌缺血的保护作用J.中国中医药科技，2003,10（1）：37-38. 9 吴伟康，谭红梅，罗汉川，等.应用基因表达谱芯片观察小鼠心肌缺血后基因表达的变化以及四逆汤对其影响J.中国病理生理杂志，2003

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