温度和转数对GMCSF表达量的影响

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1、本科学生毕业论文论文题目：温度和转数对GM-CSF表达量的影响学 院：生命科学学院年 级：专 业：制药工程姓 名：学 号：指导教师：摘要 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）主要是有体内激活的T细胞、单核巨噬细胞等产生。近年研究发现它是一种有广泛免疫活性的效应银子，在激活免疫反应中起重要作用，参与特异性抗体的产生。GM-CSF主要促进粒细胞、局势细胞的增殖、分化及功能成熟，提高宿主的防御能力，而且可以活化巨噬细胞产生依赖性细胞接到的细胞毒效应（ADCC）和多形性中性粒细胞（PMN）产生补体介导的吞噬作用，以及增强PMN的各种功能，还能提高C3bi及Fcr受体的表达，本文是就温度和转数对

2、GM-CSF表达量的影响作一综述。关键词粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）；粒细胞；温度；转数；表达量Abstract Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is the main body of activated T cells, macrophages and other produce.Recent studies indicate that it is a kind of extensive immunological activity effect of silver, in the activ

3、ation of the immune response plays a role in, participate in the generation of specific antibodies.GM-CSF mainly promote granulocyte, the situation of cell proliferation,differentiation and functional maturation, improves host defense, and can activate macro- phages produce dependent cell receiving

4、cytotoxic effect (ADCC) and poly -morphic neutrophils (PMN) produce complement mediated phagocytosis, and enhances PMN function, can improve the C3bi and Fcr receptor express- ion,this paper is on the temperature and speed of GM-CSF expression amount reviewed the effects of.Key wordsgranulocyte macr

5、ophage colony-stimulating factor (GM-CSF)；granulocytes；temperature；speed； amount of expressionII目录摘要IAbstractII前言11.1 GM-CSF的国外研究进展11.1.1 GM-CSF的名称来源11.1.2 GM-CSF在创面愈合方面的研究概况11.1.3 GM-CSF在促进急性皮肤缺损创面和切口愈合方面的研究11.1.4 GM-CSF在促进静脉性及糖尿病性溃疡愈合方面的研究21.1.5 CM-CSF在压力性和其他原因引起的慢性溃疡愈合方面的研究21.1.6 GM-CSF在促进放、化疗相关创

6、面愈合方面的研究21.1.7 GM-CSF在促进肿瘤治疗相关的粘膜溃疡的修复方面的研究31.1.8 GM-CSF对促进愈合能力受损的肠吻合口愈合方面的研究31.1.9 GM-CSF在促进感染创面愈合方面的研究31.2 国内进展41.3 GM-CSF的作用机制51.3.1 GM-CSF的来源51.3.2 GM-CSF的生物学特性51.3.3 GM-CSF的结构6 1.3.3.1 hGM-CSF基因的结构特点6 1.3.3.2 hGM-CSF蛋白分子的结构特点6 1.3.3.3 GM-CSF的理化性质71.3.4 GM-CSF诱导自身免疫疾病的机制81.3.5 GM-CSF的作用机制81.4 临床

7、应用91.4.1 GM-CSF在不同创面治疗的临床应用101.4.2 GM-CSF在疫苗佐剂中的临床应用11 1.4.2.1 GM-CSF在病毒性疫苗佐剂中的应用12 1.4.2.2 GM-CSF在肿瘤性疫苗佐剂中的应用13 1.4.2.3 GM-CSF在细胞疫苗佐剂中的应用131.4.3 GM-CSF在治疗头颈部肿瘤放射性黏膜炎的应用141.5 GM-CSF的研究内容141.5.1 GM-CSF对创面愈合的研究141.5.2 骨髓抑制化疗141.5.3 GM-CSF协同抗肿瘤作用151.5.4 GM-CSF与慢性阻塞性肺疾病（COPD）的相关性151.5.5 hGM-CSF基因的表达及其调控

8、15第二章 材料与方法162.1 材料162.1.1 菌种162.1.2 培养基162.1.3 药品及试剂162.1.4 仪器及器皿172.2 实验方法172.2.1 配制培养基172.2.2 菌种活化182.2.3 菌体在小摇瓶中的发酵培养182.2.4 菌体在大摇瓶中的发酵培养182.2.5 诱导处理182.2.6 不同转数对蛋白表达量的影响192.2.7 电泳的工作液及操作步骤19第三章 结果和分析203.1 温度对rhGM-CSF表达量的影响203.2 转数对rhGM-CSF表达量的影响213.3 分析21结论22参考文献23致谢28 温度和转数对GM-CSF表达量的影响前言1.1GM

9、-CSF的国外研究进展 1.1.1 GM-CSF的名称来源 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte/macrophagecolony-stimulatIngfactor,GM-CSF)是近几十年来医学研究的一种热门细胞因子。1977年，它由Burgess等在鼠的肺条件培养液中首次发现，因能刺激造血前体细胞形成粒细胞-巨噬细胞集落，故而得名1。 1.1.2 GM-CSF在创面愈合方面的研究概况1985年，首次克隆表达了人类GM-CSF基因（human GM-CSF,hGM-CSF),此后重组人GM-CSF(recombinant human GM-CSF,rhGM-CSF)逐渐应用

10、于临床。1989年,意大利学者Gianni对恶性肿瘤患者进行了自体造血干细胞移植时，意外发现rhGM-CSF能够很好地防治严重口腔黏膜炎，并推测其与创面愈合有关2。从此人们开始将GM-CSF作为促进创面愈合的主要细胞因子试用于临床，以期解决创面难愈问题。1993年，首篇局部注射rhGM-CSF促进慢性创面愈合的报道发表3。随后的研究表明，GM-CSF可被一系列参与创面修复过程的细胞(树突状细胞、活化的T细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞等)合成分泌物体4-5;且GM-CSF可增强多种创面愈合必需的细胞的功能，如活化单核/巨噬细胞功能、促进上皮细胞迁移、中性粒细胞、增殖、调节成纤

11、维细胞表型等6，更激起了人们将其用于促进创面愈合的兴趣。 1.1.3 GM-CSF在促进急性皮肤缺损创面和切口愈合方面的研究1992年，KaPlan等首次把GM-CSF引入急性皮肤创面治疗，最早证实了GM-CSF可以促进急性皮肤缺损创面愈合，并证实创周注射rhGM-CSF可促进麻风患者活检创面的愈合3。在体内，给麻风患者的麻风结节周围注射GM-CSF后，在注射部位以及临近的部位取组织活检，因而观察到注射GM-CSF外止血会更快，并且上皮厚度增加，角质细胞的层数、数目、体积均增加，并聚集朗罕细胞至真皮层，加快创面的愈合。局部滴注还可促进雷诺病患截趾创面的愈合5。在体外，他们发现GM-CSF是诱导

12、朗罕细胞分裂增殖的主要因子,可以刺激角质细胞生长。同时，动物实验也证实了GM-CSF能够促进急性皮肤切口的修复。Jyung等人对单核细胞耗竭所导致的创面愈合能力受损的大鼠创造皮肤的切口，而发现了局部应用GM-CSF可以活化巨噬细胞，并增加切口扩张力的强度，促进其愈合。 1.1.4 GM-CSF在促进静脉性及糖尿病性溃疡愈合方面的研究 1994年，Dacosta等首次将rhGM-CSF应用于慢性下肢溃疡的老年人，溃疡周围皮下注射rhGM-CSF并使其痊愈。之后又进行了随机、双盲、安慰剂平行对照的临床研究，1999年，他们扩大了研究对象，进一步验证了rhGM-CSF能够促进慢性静脉性溃疡的愈合，且

13、不受溃疡存在时间的影响6。Jaschke等7对慢性静脉性溃疡患者的创面局部喷洒rhGM-CSF也得出类似结论，并发现其可明显提高创面愈合率，并减少复发，缩短创面愈合时间，平均愈合时间为19周，且无明显的毒副作用。创面均匀滴用rhGM-CSF也会使糖尿病脂性渐进性坏死患者小腿慢性溃疡愈合局部，而且持续3年以上无复发。注射rhGM-CSF还能促进糖尿病患者足部慢性神经性溃疡的愈合8. 1.1.5 CM-CSF在压力性和其他原因引起慢性溃疡愈合方面的研究1997年，一项临床研究表明对压力性溃疡局部连续喷洒rhGM-CSF,可以使溃疡的体积明显地减少，利于愈合。 EIsaghir等9首次报道，在溃疡周

14、围及底部注射rhGM-CSF能够成功使压力性溃疡愈合，并发现溃疡是从注射部位开始愈合的，随诊9个月无复发。局部应用GM-CSF还可以促进其它原因引起的慢性溃疡愈合，如可促进镰刀性贫血9及中性粒细胞功能不良患者10下肢慢性溃疡的愈合。促进HIV感染者退步慢性溃疡、多发性动脉炎、血红蛋白病、Kippel-Trnaunay-Weber综合征相关性溃疡等创面的愈合。 1.1.6 GM-CSF在促进放、化疗相关创面愈合方面的研究Gulcelik等11实验，给大鼠静脉注射阿霉素14天以后，进行剖腹术，同时给创周多点注射GM-CSF或是生理盐水，观察切口愈合的情况。结果表明，局部注射GM-CSF可以增加切口

15、羟脯氨酸的含量及其抗张力强度，从而促进了因阿霉素抑制创面愈合的副作用和髓系抑制相关，可以抑制单核细胞与血小板的功能，阻碍其愈合。而皮内应用GM-CSF可以增加皮肤角质细胞数量，诱导内皮细胞的增殖和迁移，增加NO的浓度，火花成纤维细胞并刺激胶原的合成，这些因素单独或者联合作用，可以促进受损的切割伤愈合12。Ergn等13认为在因系统性疾病或者药物引起的愈合受损以及需要皮片重建时，给予GM-CSF可以加速创面的愈合并降低其致残率。另外有类似的报道称，局部应用GM-CSF可以活化巨噬细胞，增加抗张力的强度，促进由于甲基强的松龙导致创面难以治愈的大鼠皮肤切口的愈合3。放疗会导致手术的切口愈合受损并且产

16、生氧化物而造成细胞损伤，但放疗后制造皮肤切口，且局部注射GM-CSF可以使放疗引起的手术切口脂质过氧化现象显著降低，促进其愈合。 1.1.7 GM-CSF在促进肿瘤治疗相关的粘膜溃疡的修复方面的研究Masucci等14 在黏膜炎的评分大于（等于）1.5时，给皮下注射GM-CSF可以明显的促进因放疗所大致的严重口部、咽部黏膜炎的恢复。Koc等15认为放疗性食管炎是胸部、头颈恶性肿瘤放疗时最重要的副反应，常常会迫使放疗中断数天。Michael等采用rhGM-CSF口服治疗了36例度放射性食管炎，结果显示有85%的患者明显改善了其吞咽困难的症状。同时发现了被损伤的上皮祖师有血管的形成以及血管内皮生长

17、因子的过度表达，因而他认为，rhGM-CSF可能增强了受损的组织血管生成因子的释放或者直接的血管生成活性16，从而增强了局部治疗放射性食管炎的疗效很显著。 1.1.8 GM-CSF对促进愈合能力受损的肠吻合口愈合方面的研究Cetinkaya等17报道，创周注射GM-CSF可以对抗因撕裂霉素-C腹腔内化疗导致的愈合受损，通过增加切口的羟脯氨酸含量和抗张力强度，促使大鼠肠吻合口正常的愈合。局部给予rhGM-CSF可以纠正术后早期应用5-氟尿嘧啶腹腔内化疗所导致的大鼠巨噬细胞活性降低，促进其受损的吻合口愈合18，并可促进长期应用皮质类固醇引起的难以愈合的肠吻合口的愈合19。根据以上叙述可知，局部应用

18、GM-CSF可以促进多种不同的原因所导致的愈合能力受到损伤的黏膜的修复。 1.1.9 GM-CSF在促进感染创面愈合方面的研究 Robson等20率先进行了GM-CSF对感染创面应用方面的研究。他们制造了SD大鼠的创面模型，发现了单（多）次局部外用的GM-CSF都能够减少创面的细菌数量，并逆转感染对创面收缩的抑制作用，促进急、慢性细菌感染的皮肤创面的愈合情况。Makik等21报道了29个不同病因（创伤后、血管性、糖尿病等）引起的病程大于3个月以及标准个治疗无效的慢性创伤，在创周单次皮下注射GM-CSF 10微克/厘米2，注射6周后，其中有9例痊愈，11例创面的缩小范围超过了原来的50%，7例有

19、所改善。1999年，Da Costa等22发现了慢性静脉性溃疡的rhGM-CSF治疗组中，在24个细菌培养阳性的溃疡中有11个已经愈合，而对照组则是无一例细菌培养阳性的溃疡愈合。因此，创面对GM-CSF的反应和它是否感染无关，rhGM-CSF对于感染创面也是有治疗作用的。 1.2 国内进展 GM-CSF已成功应用于多个临床领域，如改善放化疗、增强疫苗的免疫原性，严重感染等原因导致的骨髓抑制，促进创面愈合等,是近几十年来医学研究的一种热门细胞因子。在国内，近几年主要研究其在烧伤创面的临床应用。国内学者研究报道开始于2008年以后，局限于深度早期创面的应用，国内生物制药企业率先生产了全球第1支rh

20、GM-CSF凝胶，并于2008年被我国SF-DA批准上市，取得了良好的疗效，并具有较好的安全性。国外学者则未见同类研究报道。国内外无论何种剂型的rhGM-CSF，均没有应用于烧伤后残余创面的报道。而烧伤后残余创面不同于烧伤后早期创面，有着特殊的形成原因和发生机制，本质上属于难愈性慢性创面，因此rhGM-CSF治疗烧伤后残余创面是否也可以取得良好的疗效，需要通过临床试验进行证实。王志勇等23研究人员，应用rhGM-CSF治疗深度烧伤创面，结果也显示出有明显的促进创面愈合的作用，并具有一定安全性。刘波等24人，应用不同剂量的rhGM-CSF凝胶促进大鼠深度烧伤创面的愈合进行了一定的实验研究，结其果

21、显示rhGM-CSF凝胶能够促进痂皮形成和脱落、促进毛囊再生、加快上皮生长，加快烧伤创面修复的速度并且还能够改善修复质量。陈炯等25人，收集多中心研究中的其中的两个单位的资料，并以深度烧伤患者作为试验对象，采用多中心随机双盲对照试验的方法进行试验。其中试验 组60例100cm2创面使用100微克的rhGM-CSF凝胶剂，对照组30例则是使用基质安慰剂，观察其创面愈合情况。实验结果显示，rhGM-CSF凝胶剂可以促进烧伤患者深度创面愈合，而且对于100cm2 的创面使用是相当安全的。 国内外局部应用rhGM-CSF，使用的药物剂型为注射剂或溶液，凝胶剂型则是目前国内外的最新剂型只可检索到其促进深

22、H度烧伤早期创面愈合的报道(国内生物制药企业率先生产了全球第一支rhGM-CSF凝胶，并于200826年被我国SFDA批准上市)。多采用创周注射、局部喷洒、局部湿敷等方法，好的剂型如凝胶剂有助于维护创面愈合湿润的微环境，促进上皮及其它细胞的迁移，促进创面愈合，故局部外用药物剂型的选择很重要。良好剂型的rhGM-CSF应该具有广阔的应用前景。本课题拟采用随机、双盲、安慰剂同体对照研究方法，观察并评价局部应用rhGM-CSF凝胶治疗烧伤后残余创面的临床效果，并进行作用机制的初步研究，以期为治疗烧伤后残余创面提供新的治疗药物，并为新药开发进一步提供实验依据。 1.3 GM-CSF的作用机制 1.3.

23、1 GM-CSF的来源 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)是一种多功能的造血生长因子之一, 具有诱导未成熟的骨髓细胞前体细胞增殖和成熟等功能。它由T细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、B细胞核巨噬细胞等分泌，并且可以通过自分泌和旁分泌方式作用于这些细胞,影响其趋化、增殖和成熟。在正常情况下,血液中的GM-CSF的量是难以检测的,但在脂多糖（LPS）等刺激下,浓度可显著升高。创面上的GM-CSF来源于炎症反应细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞)及角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等,其中角

24、质细胞是产生GM-CSF的主要细胞。 1.3.2 GM-CSF的生物学特性 GM-CSF是相对分子质量 介于15000-35000的一种多功能细胞因子。人GM-CSF（hGM-CSF）的基因全场约为25kh，其中含有4个外显子以及3个内含子，在恒氨酸的水平和鼠类特有70%的同源性。GM-CSF的开放阅读框全场为432bp，共编码144个氨基酸，hGM-CSF的初产物是一个由144个氨基酸构成的多肽片段，在从其氨基酸末端切除一个17个氨基酸片段后，由127个氨基组合成的多肽蛋白便为其成熟的GM-CSF27。它有3个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点，具有4个半胱氨酸构成的2个二硫化键，9条分子量

25、从14.5-32kd不等的蛋白质组成，糖基化程度上的差别造成了分子量的不同。 GM-CSF属于糖蛋白因子家族中的一员, 也是一个具有多项潜能的造血生长因子。作为一种特殊的生长因子，GM-CSF不仅能够刺激造血祖细胞的增殖形成粒细胞、树突细胞和单核细胞。在体外，它还可以对骨髓细胞，单核-巨噬细胞、内皮细胞、急性单核细胞性白血病细胞、淋巴细胞的增殖产生刺激，在细胞因子网络中占有很重要的地位；GM-CSF能延长嗜酸性细胞的存货，使其产生细胞毒性杀死病原体等28；并且能够增强嗜中性粒细胞细胞因子的分泌、聚集等功能；具有增多嗜酸粒细胞、降低血清中的胆固醇等的作用29，也能够通过提高免疫细胞的吞噬活性来杀

26、灭病原体，刺激嗜酸性粒细胞的功能,提高NK细胞的活动能力,以及诱导单核细胞产生IFN-,IL-12和IL-15；GM-CSF也会参与炎症反应的形成27，并且具有免疫调节的特性；GM-CSF在免疫反应中能促进体液免疫及细胞免疫的建立,因此,目前它作为DNA疫苗免疫佐剂已被大量应用；GM-CSF也参与动员骨髓细胞释放,并参与免疫炎症反应和损伤组织器官修复的进行。另外,GM-CSF可作为巨噬细胞和中性粒细胞的趋化因子,调节其分化、增殖,并活化其功能。同时，GM-CSF是一种安全佐剂，作为佐剂对身体是没有毒害作用的。 1.3.3 GM-CSF的结构 下面以人GM-CSF（hGM-CSF）为例子介绍其结

27、构特点： 1.3.3.1 hGM-CSF基因的结构特点hGM-CSF基因长度约2.5kb,含有4个外显子(分别编码14,42，35和53个氨基酸)和3个内含子，为单基因编码，位于第5号染色体长臂的IL-3基因的下游。GM-CSF的mRNA中含有17个氨基酸信号肽，mRNA为长0.7kb编码144个氨基酸的前体蛋白(16.3kDa)。hGM-CSFmRNA的3端的非编码区内有与加速mRNA的降解相关的8个串联的AUUUA结构。hGM-CSF在5端的翻译区域有可能控制着mRNA的降解的最保守的核苷酸序列30。图1-1是hGM-CSF基因编码序列31。 图1-1 hGM-CSF 1.3.3.2 hG

28、M-CSF蛋白分子的结构特点从图1-1中可看出hGM-CSF具有2个N-糖基化部位，即28-30(Asn-Leu-Ser)和38-40(Asn-Glu-Thr)和3个O-糖基化部位,由127个氨基酸残基组成的一种糖蛋白分子,含4个半胱氨酸并可组成2个二硫键。天然的hGM-CSF的相对分子量因为糖基化程度的不同而介于14.5-32kd30而真核细胞表达时相对分子量一般为22kD，糖基化程度高的则比活性反而是降低。hGM-CSF的分子整体呈非球形，由4个反向平行的a-螺旋和2个反向平行的-折叠组成。另由2个二硫键分别与-折叠和螺旋B的第二条链、螺旋C和羧基末端连接,43-54位残基形成的环穿过羧基

29、末端二硫键而形成的环,形成了罕见的“穿线”拓扑学。图1-2是hGM-CSF的蛋白立体结构。 图1-2 hGM-CSF的蛋白分子结构示意图通过对hGM-CSF的功能与其一级结构之间相互关系的研究表明,缺失N末端前13个氨基酸与C末端的第122-127位的6个氨基酸对其造血的活性并无影响。97-121位氨基酸之间的结构在维持hGM-CSF的造血活性方面是必要的,而第16-18位氨基酸的残基对保持GM-CSF的生物学活性是至关重要的30。 1.3.3.3 GM-CSF的理化性质编码人类GM-CSF的基因位于5号染色体5q21-5q32。鼠和hGM-CSF通过与靶细胞膜上的受体(hGM-CSF rec

30、eptor,hGM-CSFR)结合,发挥其多种生理作用。人和小鼠GM-CSF受体均由、两条链组成32,而其中链是连接亚单位,负责和配体部分的结合,而链主要和信号转导有关,其细胞的内部结构是多种信号传导途径的关键。单独链与配体的结合为低亲合力,链单独是不结合配体的,但与链共同组成了一种高亲和力受体,在信号转导中起了主要作用。GM-CSF它对骨髓中的造血祖细胞有显著性影响，从而对免疫系统产生各种效应；增强树突状细胞成熟和迁移；引起在疫苗注射部位产生炎症反应；能诱导MHC分子抗原在巨噬细胞表面表达。GM-CSF通过促进DC的聚集与存活，从而诱导对病原体的防护免疫应答并能够间接协助免疫系统对肠道病原体

31、的有效清除达到增强和调节免疫应答的功能。GM-CSF作为佐剂，能增强疫苗的免疫原性。由于DNA疫苗所诱发的免疫应答效果的局限性，在DNA疫苗的免疫策略中，GM-CSF作为佐剂能够显著增强DNA疫苗的免疫应答。GM-CSF已作为佐剂在各种疫苗中与抗原共同参与免疫反应，并对免疫应答的增强起积极作用。当然GM-CSF作为佐剂应用时，也受到剂量、免疫方式和其他细胞因子的影响。rhGM-CSF在临床上已经被用于骨髓抑制患者(肿瘤放疗、造血干细胞移植后等)促进骨髓细胞恢复；GM-CSF在整个免疫调控网路中发挥了重要作用，GM-CSF能活化APC并促进其捕获外来抗原以及对它进行加工处理。 1.3.4 GM-

32、CSF诱导自身免疫疾病的机制 GM-CSF在自身免疫疾病中至关重要35。如图1-3所示，由病原体相关分子模型（PAMPs）诱导DC的活化及成熟，并能够促进细胞因子IL-23、IL-6和GM-CSF的分泌。巨噬细胞与PAMPs相互接触后就会产生GM-CSF。GM-CSF再进一步增强DC和巨噬细胞产生IL-23和IL-6。IL-6一方面增强Th17和Th1的存活能力，一方面与TGF-共同促进转录因子ROR-t表达，并使Th17进一步分化。Th17是诱导自身免疫病的细胞，因此IL-23在促进Th17细胞维持或致病性方面发挥着很重要的作用。 实箭头:表示刺激;虚箭头:表示分泌（引自Sonderegge

33、r等，JExp Med，2008) 图1-3 GM-CSF介导的自身免疫病模型 1.3.5 GM-CSF的作用机制 GM-CSF对DC的成熟具有非常明显的作用，是主要的DC活化因子。细胞表型分析显示，当GM-CSF基因转入到DC时，能够刺激DC持续分泌GM-CSF，转染前DC、MHC类分子、CIM0、CD80和CD86呈中度表达，而转染后的DC细胞表型也会随之发生相应的改变，其中包括细胞呈细胞核大而深染，悬浮状，细胞体积大而形态不规则，细胞形成树突状在形态上更加趋向成熟。转染24 h后的DC，大部分细胞更加聚集，细胞表面呈现突起的状态，呈现簇状，细胞核分裂更加明显，呈枝状，形似于蟹足。同时MH

34、C 类分子、CD86和CD80表达明显上调，CD40则呈现中度表达，更具有成熟DC表型的特征，抗原递呈及活化T细胞的能力显著增强，并显示出其更强的刺激T细胞增殖的能力33。 GM-CSF的免疫增强作用是通过提高APC的，特别是DC的抗原递呈能力来实现的，GM-CSF诱导APC到免疫反应部位，促进抗原被APC捕获。GM-CSF与外源疫苗预先或者一起注入体内作为免疫原，刺激并聚集DC，增强其捕获、递呈和加工抗原的能力；与此同时会诱导脾细胞分泌IFN-，并增强巨噬细胞、T细胞、NK细胞和TC细胞的活性；同时IFN-又继续诱导MHC和类分子的表达，分布在巨噬细胞表面的MHC分子能够促进巨噬细胞更有效地

35、递呈抗原；活化的DC开始进一步趋向成熟并迁移，使其免疫调节能力加强，在疫苗注射的部位产生炎症。综上所述的一系列活动的结果便会导致静止的T细胞和B细胞被激活，包括CD 4+T细胞的激活，并且使其分泌抗体的能力增强，同时也会增强CD8+T细胞的功能，从而诱导强烈的细胞免疫34。GM-CSF能够增加抗原呈递细胞(APC)表面的MHC-类抗原和T细胞共刺激分子B7-2和B7-1的表达,趋化APC在注射部位聚集和增强巨噬细胞等细胞因子的分泌,并且调节免疫反应。现在认为在T细胞和抗原作用的开始阶段，树突状细胞(DC)是最重要的APC之一,有效的辅助T细胞对抗原的应答，起到了决定性的作用,而GM-CSF则能

36、够增强巨噬细胞、DC、朗格汉斯(Langerhans)细胞的生长和分化,增加DC细胞数量的同时增强DC的活力和功能。DC细胞本身作为一种良好的疫苗佐剂,在和抗原一起注射时能够明显的增强免疫反应应答36。Disis等37对GM-CSF在蛋白疫苗和多肽方面的佐剂作用进行了研究,表明将GM-CSF皮内或皮下注射后能够明显增加局部淋巴结内表达MHC-类细胞的比例,皮内注射是在4-5d达到高峰,皮下注射是在2d达到高峰。GM-CSF增强抗体反应的作用不仅是体现在先用GM-CSF注射调理局部微环境后注射疫苗,在和疫苗同一时间使用时也很有效,显示出其佐剂作用事有实际意义的。 1.4 临床应用目前，已经有3种

37、不同的重组人生长调节因子：巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)获得确证和分子克隆，并在世界各国获准用于临床。这些生长因子能影响骨髓造血细胞的功能活性、存活、增殖和分化。GM-CSF主要影响定型祖代中性白细胞的增殖，功能性刺激和分化作用。GM-CSF的活性类似于G-CSF，具有使前祖细胞群分化为单核细胞、中性白细胞或粒细胞系的能力。M-CSF主要影响单核细胞和巨噬细胞的增殖、功能增强和分化作用。G-CSF和GM-CSF均能刺激多潜能祖细胞核肝细胞从骨髓移行进入循环系统。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）主要是

38、由体内的单核巨噬细胞、T细胞等产生，是诸多造血因子中重要的一员。自90年代应用于临床以来，特别是肿瘤放疗、化疗所致的白细胞减少、骨髓移植、骨髓异常增生综合征、再生障碍性贫血等治疗取得了一定疗效。近几年发现GM-CSF是一种具有广泛免疫活性的效应因子，在激活免疫繁重起着重要作用。GM-CSF主要促进粒、巨噬细胞的增殖、分化及其功能的成熟，提高宿主的防御能力，而且可以回话巨噬细胞产生依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC)和多形性中性粒细胞（PMN）产生补体介导的吞噬作用，以及增强PMN的各种功能。GM-CSF还能提高C3bi及Fcr受体的表达，并且对放、化疗所致的黏膜炎、真菌感染、病毒性肝炎、糖尿

39、病合并脂肪渐进性坏死的不愈性小腿溃疡和肺泡蛋白沉积症等也有很好的疗效。 1.4.1 GM-CSF在不同创面治疗的临床应用 基本创伤愈合与组织修复病理生理过程可以分为:局部炎症反应期、细胞增殖分化及肉芽组织形成期(即增生期)和组织重建塑形期(塑形期)3个阶段。其中炎症反应期，是指伤后开始至伤后第3天或第6天,增生期是在伤后第4-14天,塑形期是在伤后第8天至1年的时间,在各个阶段彼此之间有区别却又是相互重叠的。研究发现创伤刺激可以上调创面GM-CSF的表达, 作为一种有丝分裂剂和免疫增强剂38，GM-CSF成为创面愈合过程中的启动因子39,GM-CSF能够作用于创面愈合必经的每一个阶段而发挥其重

40、要作用,促进创面的愈合。目前，令临床医生感到困扰的问题之一便是慢性难愈性创面。慢性难愈性创面主要分四类:糖尿病性溃疡、压力性溃疡、静脉性溃疡和缺血性溃疡等。其中糖尿病创面及溃疡是很具有代表性的难愈创面,也是目前医学界面临的重大难题之一。GM-CSF已经被试用于对此类疾病的治疗,效果也十分理想。糖尿病主要由于血管病变导致局部缺血、巨噬细胞和中性粒细胞的功能受损、成纤维细胞增殖能力降低、血管病变及内皮细胞异常、易感染等,致使创面很难完全愈合40。局部注射GM-CSF可促进糖尿病患者的足部慢性神经性溃疡愈合41;使糖尿病脂性渐进性坏死者的小腿慢性溃疡进行愈合,可以均匀地在创面滴用GM-CSF，并且能

41、够持续3年以上不会复发42。因此一种极其有效地治疗糖尿病患者伴发慢性迁延不愈创面的方法便是推出局部应用GM-CSF。国外曾经有一系列应用rhGM-CSF促进静脉性溃疡愈合的报道。长期存在的下肢肢端静脉性溃疡是最为常见的一种慢性溃疡,它会严重影响患者的正常日常生活,并加重社会负担,但是目前尚无理想疗法。DaCosta等43研究者，于1994年采取随机双盲对照试验，实验对象首次选取为60个慢性静脉性溃疡的病人，分别在其病变的周围注射了安慰剂和浓度分别为200微克、400微克的GM-CSF，将其分别在注射后的5、9、13周和6个月时再观察创面，并且发现注射13周后，400微克组、200微克组、对照组

42、的溃疡愈合率分别为61%、57%、19%。式样还发现GM-CSF注射组的晃着在愈合后的6个月内均无复发现象;同时还有一些临床报道，GM-CSF可以治疗压力性溃疡及缺血性溃疡，对压力性溃疡局部连续喷洒rh-GM-CSF,可使溃疡体积明显减小,利于愈合,并且已取得了令人满意的疗效45-46。1997年ElSaghir等研究者，首次报道在溃疡周围及底部注射rhGM-CSF，并且成功地使压力性溃疡愈合,同时也发现溃疡是从注射部位开始愈合的,随诊9个月也并无复发。Wang等44在一部分为深度烧伤的病人的创面，运用了GM-CSF凝胶进行涂抹，发现其创面愈合一般需要的时间对于对照组明显要少，实验得出结论为，

43、GM-CSF凝胶能够明显加速深度烧伤创面的愈合，并且临床运用的安全性也很好。DanielA等人,使用了局部皮下注射GM-CSF治疗法，对由于不同病因导致的中性粒细胞功能障碍而引起的难愈性创面进行治疗时,发现创面在4周内全部愈合，且局部应用的副作用相对较小,而且也相应的降低了治疗费用;Raderer等人，使用了相同的办法来治疗10例癌症病人由于手术和褥疮而产生的慢性创面,在治疗的五天之后创面即发现有所好转,经过一段时间治疗后所有病人的创面都全部愈合,除了1例病人由于浓度过高(200ug/ml)局部有灼烧感外,其余病人(4ug/ml)均无副反应,并且局部应用GM-CSF还不会影响外周血细胞的数量。

44、 Symonds等47人，声明rhGM-CSF对于预防及减轻药物所引起的黏膜炎具有较好的疗效，并且能够缩短切割伤和烧伤的愈合时间。研究结果显示，外用rhGM-CSF可以显著促进烧伤小鼠度创面和大鼠皮肤烫伤创面的愈合，并缩短创面愈合的时间，与此同时还可以降低度烧伤小鼠的感染率和死亡率48。有学者曾观注意到，rhGM-CSF与重组人生长激素（rhGF）两者合用，其效果比单一使用一种更能促进大鼠深度烫伤创面的愈合49。深度烧伤的创面处理一直是临床关注的重点，偏深的深度烧伤为深度烧伤，需要3周以上时间来愈合，或者通过植皮手术才能愈合，处理原则为早期手术50。偏浅的深度烧伤则为浅度烧伤，普遍的愈合时间为

45、15d-20d，处理的标准即为经换药后自行愈合。但部分烧伤患者会惧怕手术，尤其是中小面积的深度烧伤患者普遍不愿接受手术治疗，给临床医师带来了很多困难。目前，有通过全身使用湿性敷料、局部使用各种生长因子、生长激素等促进创面愈合的方法，并且也取得了一定的效果，但这种方法还是存在一定的缺点，譬如湿性敷料存在一定的感染风险，各种生长因子对深度烧伤创面早期的效果并不理想，全身使用生长激素也不适合肿瘤和糖尿病的患者等。烧伤患者常伴有集落刺激活性的降低的症状，并导致感染概率增加。体内外的临床试验结果表明，rhGM-CSF能够促进烧伤感染创面的愈合并且调节机体的免疫系统，增加机体的免疫能力以预防感染51，故而

46、，rhGM-CSF的活性及数量在烧伤后免疫功能的改变中扮演着及其重要的角色。rhGM-CSF局部外用于烧伤创面时能够启动创伤修复的连锁反应，调节在创伤修复过程中发挥重要作用的内皮细胞、上皮细胞、成熟的巨噬细胞、中性粒细胞及成纤维细胞的增殖和活化。rhGM-CSF还能够吸诱导炎性细胞和内皮细胞，阻止其从伤口处逃逸，诱导角质细胞增殖和发育，使朗格罕细胞进入真皮，促进伤口的修复52。 1.4.2 GM-CSF在疫苗佐剂中的临床应用 1.4.2.1 GM-CSF在病毒性疫苗佐剂中的应用作为一种传统疫苗佐剂,GM-CSF与疫苗一般会按照不同的比例及先后顺序注入机体内。其中,GM-CSF在乙肝疫苗佐剂方面

47、的研究成为当今的热点,研究者主要从预防及治疗乙肝方面对GM-CSF的作用进行尝试。在预防方面,Kim等53随机对60名乙肝免疫无应答志愿者进行了实验，试验中将其分为年龄、体重、性别、吸烟状况等大致相同的两组，一组每人每次注射40微克乙肝疫苗，另一组则首先注射125微克的GM-CSF，然后立刻在同一部位注射标准的10微克乙肝疫苗，两组其他实验条件与程序均相容。实验结果显示，GM-CSF与10微克乙肝疫苗共同注射组和40微克乙肝疫苗注射组志愿者的血清抗体都有很大的上升，且相差不大，表明GM-CSF有效地提高了乙肝免疫无应答者的血清保护抗体，能够替代大剂量的疫苗注射产生的血清来保护抗体；作为佐剂GM

48、-CSF可以明显地提高疫苗在机体中的免疫作用,特别是对T细胞功能受损的个体中乙肝疫苗无/或低反应患者更有意义。在治疗方面的研究中,王建设等54人在以GM-CSF增强APC的功能，并且消除免疫耐力的设想下，研究了27名母亲为HBV携带者，出生时乙肝表面的抗原（H BsAg)阳性经乙肝疫苗免疫仍发展为慢性无症状携带儿童分为两组进行了实验，14名使用GM-CSF50微克和乙肝疫苗10微克在相同部位进行肌肉注射，令13名则在不同部位肌肉注射乙肝免疫球蛋白200IU和乙肝疫苗10微克。治疗结束后1个月进行复查，结果显示，恋足各有12名儿童完成研究，第一组有3例，第二组有4例，治疗后均有2例恢复正常。实验

49、表明，GM-CSF和乙肝疫苗共同免疫能够显著地抑制HBV的复制,并加快肝功能的恢复,对乙肝疫苗免疫失败的慢性HBV携带儿童具有一定的治疗作用。、作为分子疫苗佐剂,编码GM-CSF的质粒随着新型病毒DNA疫苗的发展也也被应用于DNA疫苗的研究中。GM-CSF增强DNA疫苗免疫效果,主要是通过促进包DC在内的APC的增殖分化,将其吸引到注射部位,增强抗原呈递能GM-CSF增强DNA疫苗免疫效果,主要是通过促进包DC在内的APC的增殖分化,将其吸引到注射部位,增强抗原呈递能力,从而达到佐剂作用。实验研究表明用DNA疫苗与质粒GM-CSF共注射与单独用DNA疫苗注射比较,前者抗体水平、IFN-分泌水平

50、及CTL活性均较后者高。单独注射编码丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原DNA疫苗的抗体阳转率仅为40%，Geissle等8把表达GM -CSF的质粒与该疫苗一起注射后,小鼠的抗体阳转率为80%,同时还检测到特异性CD4+T细胞增殖和CTL活性均增强。Kusak-abe等10研究GM-CSF表达质粒对HIV DNA疫苗诱导的Th1和Th2反应类型的影响,在注射DNA疫苗前3 d注射GM-CSF,诱导的免疫反应以Th2为主,认为可能是注射GM-CSF后诱导大量Th2型细胞因子的DC扩增产生的结果;若在注射DNA疫苗后3 d注射GM-CSF,诱导的免疫反应以Th1为主,其机制尚不清楚;若同时注射两种质粒

51、,可使Th1和Th2反应均增强。Barauch等9的研究表明表达gp120和GM-CSF的双顺反子HIV DNA疫苗可以诱导很强的CD4+T反应,使单顺反子gp120 DNA疫苗在低于使用剂量100倍情况下诱导出gp120特异的脾细胞增殖反应。 1.4.2.2 GM-CSF在肿瘤性疫苗佐剂中的应用作为肿瘤细胞疫苗的佐剂，瘤细胞免疫原性弱，肿瘤疫苗的作用机制为利用肿瘤抗原物质或者肿瘤细胞诱导机体的体液免疫应答和特异性细胞免疫,增强机体的抗肿瘤能力，将可溶性的GM-CSF作为佐剂转入肿瘤细胞内能诱导针对于肿瘤抗原的蛋白或多肽疫苗的免疫应答，并通过主动免疫的治疗方式能够发挥更佳的抗肿瘤作用。 1.4

52、.2.3 GM-CSF在细胞疫苗佐剂中的应用细胞疫苗一般为分离出单核细胞从病人外周血和骨髓中,再在体外分化成APC后在外源性抗原的刺激下分化成成熟的APC。通过分子技术将细胞因子基因转染DC制备DC疫苗,因GM-CSF本身具有很强的免疫佐剂功能,从而成为DC疫苗中常用于的转染的细胞因子。另外GM-CSF还与其他类型的抗肿瘤疫苗联合应用,如多肽瘤苗、带有肿瘤抗原的重组痘苗病毒、肿瘤DNA疫苗,均取得了良好得效果。但目前较为深入，也较多的依旧是肿瘤细胞疫苗,并且有很多GM-CSF修饰自体肿瘤细胞的疫苗已经进入了临床I、II试验。 1.4.3 GM-CSF在治疗头颈部肿瘤放射性黏膜炎的应用GM-CS

53、F应用在放射治疗中，能够调节细胞因子和生长因子的产生,它们很可能介导黏膜的炎性过程；增加粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及巨噬细胞的数量并提高其活性；并且存在促进上皮修复的可能性。因此可以减轻放疗所致的黏膜损伤。GM-CSF可以通过细胞因子诱导成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞的增殖,增加郎格罕细胞的产生,从而控制局部感染。GM-CSF可以有效地控制随着放射剂量的增加黏膜损伤进一步加重的趋势;有利于放射治疗的顺利进行,减少了因中断放射治疗而延长疗程的几率，同时GM-CSF加快了口腔黏膜溃疡的愈合,愈合时间明显缩短,从而极大地减轻了患者痛苦,减少了局部继发感染。几乎无不良反应,及时有也是很轻微的，经对症处理

54、后并不影响放疗的进行。总之, GM-CS口腔含漱和皮下注射的方法是很值得临床推广应用的，均能够有效地促进口腔溃疡愈合。 1.5 GM-CSF的研究内容 1.5.1GM-CSF对创面愈合的研究 GM-CSF是一种多功能的造血生长因子，具有恢复骨髓造血和增强机体免疫功能的生物学作用。目前有研究表明GM-CSF能加速创面的愈合，并在临床治疗慢性创面中取得了很满意的效果，肯定了其对于慢性不愈创面的促愈作用，但怎样使其不影响后续皮肤组织再生，并将作用发挥到最大的抗异物、抗菌效应；在局部用药时，使其不会增加外周血GM-CSF的浓度和血细胞数量而产生副作用，以及创面用药时间及剂量、剂型、用药的最佳时机等，还

55、需进一步研究。 1.5.2 骨髓抑制化疗 GM-CSF可减少接受骨髓抑制化疗病人的中性白细胞减少症和感染，并缩短住院期，但骨痛和腹痛、低度发热、肌痛等不良反应稍大，故对其在骨髓抑制化疗中的应用应需要进一步研究。 1.5.3 GM-CSF协同抗肿瘤作用 GM-CSF强烈激活特异免疫反应这一突出作用可用于肿瘤治疗。 GM-CSF是一种重要的免疫调节分子，不仅可以诱导DC细胞成熟、分化，而DC细胞在T细胞免疫反应中起到关键作用，而且GM-CSF在免疫治疗中还能够增强主要和次要的抗体反应。这也为临床肿瘤的治疗提供了新的思路和策略。故要利用GM-CSF的协同抗肿瘤作用，配合手术、放疗和化疗必将提高肿瘤的

56、整体治疗水平，还有许多问题仍需要解决。 1.5.4 GM-CSF与慢性阻塞性肺疾病（COPD）的相关性GM-CSF由呼吸道病原体及有害气体刺激气道上皮细胞及其他细胞产生，对COPD起到关键效应细胞的中性粒细胞和巨噬细胞的存活与活化具有重要调节作用，在COPD的形成与发展中充当了一定的角色，起着极其重要的作用，但GM-CSF与COPD严重程度的相关性还需进一步明确。 1.5.5 hGM-CSF基因的表达及其调控 目前虽然对hGM-CSF及其受体的信号传导与细胞分化、存活和增值、凋亡及其功能的关系已经有了一定的认识，但仍然存在许多值得探讨的问题，如其是否还存在其他的信号传导通路，是否可以找到其最优

57、化表现体系，随着其的临床一按就日趋成熟，其应用前景将更为广阔。第二章 材料与方法 2.1 材料 2.1.1菌种 经重组后产GM-CSF的大肠杆菌 2.1.2培养基LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

58、由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 LB的配方为： 氯化钠10g 酵母膏5g 蛋白胨10g 蒸馏水1升 调PH为7.0 2.1.3 药品及试剂重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）购自：卫生部制品所；染色剂 脱色剂 酵母粉 蛋白胨 琼脂 氯化钠 氢氧化钠 葡萄糖 甘油 蔗糖 牛肉膏 电泳液 氨苄西林钠 PH试纸 1mol/L NaOH 1mol/L HCl； 染色剂1升: 考马斯亮蓝R-250 1g 甲醇450ml 蒸馏水450ml 冰醋酸100ml脱色剂1升:甲醇 100ml 冰醋酸100ml 蒸馏水 800 ml

59、电泳液：（1）A液： 丙烯酰胺储存，100ml 30%丙烯酰胺 0.8%双丙烯酰胺 29.2克丙烯酰胺 0.8克双丙烯酰胺 （2）B液：100ml 75ml 2mol/L Tris-HCl(PH8.8) 4ml 10%SDS 21ml蒸馏（3）C 液：50ml 1mol/L Tris-HCl(PH6.8) 4ml 10%SDS 46ml蒸馏水（4）10%过硫酸铵，5ml 0.5g过硫酸铵，5ml蒸馏水（5）电泳缓冲液，1升 3 g Tris碱 14.4 g甘氨酸 1 gSDS 加蒸馏水至1升 PH在8.3左右 2.1.4仪器及器皿恒温振荡器 烘箱 压力蒸汽灭菌器 超净工作台 分光光度计 高速离

60、心机 电泳仪 培养皿 小三角瓶 大三角瓶 移液枪 烧杯 移液管 试管 三角烧瓶 量筒 玻棒 培养基分装器 天平 牛角匙 高压蒸汽灭菌锅 pH试纸（pH 5.59.0） 棉花 牛皮纸 记号笔 麻绳 纱布 2.2 实验方法 2.2.1配制培养基a.称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。b.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如

61、果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。c.调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.0。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。d.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以试管高度的1/4左右

62、为宜。固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。e.加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。f.包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。g.灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。h.搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。i.无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。 2.2.2 菌种活化 在超净台的工作条件下，挑取初发菌种到加有氨卞的小摇瓶中。 37恒温振荡器中，过夜培养。 用