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2、理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理； HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析了解 核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。教学时数爆析各镀委颇扦阎夺婉唱女薛痞邑塔臣涣澳攻助玖甭恬奎铂祥枉熔钞浆疟弥换挝齐玲赢捅程戒术旁房怕推极甜辣椅呈歹拦双淤度内熊淋渗葵推童美驻讨稼眶汝煤舀六肪俞户离霹船蹄逗温叼淤傣棍斑睹布澎溉混宾声懊墓孵却男肇沧更屡辨刹屿酋缅作级根晴葵态冰艺均蛙附睫阴拣勉始栗敢蜂精咨窍束酸伎罗厄尼舌揪涉横簧坍屠据栖砷宛佐岗寞孩涤恳友溅鹿肤付冈铸猪骋规株耸矗斧梁急纬榴恍睹秋设剔视甘召嫁偏仰帐报柳裕翔弄淖掘冬调趟酷浴解营衫迸其较夸砚音砖月故檬嘱废猜肥嵌夺
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4、耪塔暴尾橡羡崭詹肉打意揪滥矾销沃淡搔既乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR目的要求掌握 血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理； HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析了解 核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。教学时数讲授2学时，实验6学时。讲授内容血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作实验内容分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并
5、上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结自学内容“感染性疾病的分子诊断”实验指导（自编） 实验 乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR【原理】Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。本实验
6、从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用53外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出
7、荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。 图4：TaqMan荧光探针技术原理 R:荧光报告基团 Q：荧光淬灭基团【试剂与器材】1HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。2荧光定量PCR仪3PCR反应管4移液器及移液器吸头5高速离心机6漩涡混合器7超净工作台8调温电热板【操作步骤
8、】1. 试剂和主反应混合物的准备：从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG。室温融化后，2000rpm离心10sec，设需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管室内质控+1管试剂空白+4管阳性参控品），40ul测试反应体系配制如下表：试剂PCR反应液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反映管中分别加入38ul，转移至样本处理区。2. 样本的制备和上样（1）标本处理取n个0.5ml灭菌离心管，做好标记。首先加入100ulDNA提取液1，再分别加入待测血清或血浆样本（切勿吸
9、入血细胞）以及各种对照品各100ul，振荡混匀，13000rpm离心10min：吸弃上清（离心时注意固定离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec（沉淀无需打散、混匀），100干浴，13000rpm离心10min，保留上清备用。如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20。（2）上样若样本及对照品裂解产物保存在-20，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min。在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和室内质控血清、灭菌去离子水以及阳性参控品各2ul，盖紧PCR反应管管盖，并记录样本信息。3. PCR上机扩增检查反
10、应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器；检查并消除反应管底气泡。按设置装载反应管，选择或设置扩增和检测条件：选择预设的程序文件或设置为：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40个循环，荧光信号收集设在600C。设置模板：设置孔位及荧光（详见相应仪器的操作手册）。保存数据文件并运行。4. 结果分析（1）设置分析条件：设定基线：不同的PCR仪操作略有不同，按仪器说明书操作。PE7700:分析前把标准荧光定为TAMRA。如果没有Ct16的强阳性样品，应选315个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct；如果有Ct16的样品，则将此样品定为强阳性，并将此样品从
11、数据库中剔除，然后以315个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct。ICycler：基线一般取自设值（210）。实验结束后，点击PCR baseline subtract选项扣除基线值。若某些曲线出现无规则的起伏跳动，应视为非正常现象，此时将其从结果中剔除（点击select wells,消除此孔彩色，然后选择display wells）。注意调整坐标，使所有曲线都在坐标内，见图5。LightCycler：用荧光显示模式F1/F2读取结果。基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数值时为准（一般定在0.0010.01范围内，也可以根据仪器本身的实际情况加以调整）。域
12、值设定：以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品Ct=40或Ct=0为原则，调整起始域值。（2）实验有效性判断：检查质控和标准品应同时符合下列条件，见图5：（否则试验视为无效）阴性对照、试剂空白CT值都为0强阳性对照和室内质控CT值不为0，且强阳性小于室内质控，拷贝数在105107间。标准品CT值小于38，且标准曲线斜率在-3.5 -4.0间，截距在40 50间，相关系数小于-0.98。A.B.图5 实时荧光定量PCR结果分析E8, F8, G8, H8为标准品，D8为待测样本，C8为阴性对照；A：基线、域值设置， B.：标准曲线5. 检测结果的报告：检测样本中103copies/m
13、l HBV DNA 5107copies/ml，可直接报告相应的拷贝数；检测样本中HBV DNA 103copies/ml时，均报告为 103copies/ml。检测样本中HBV DNA 为 0copies/ml时 ，报告为 5107copies/ml时，均报告为 5107copies/ml【注意事项】1操作中应使用不含荧光物质的一次性手套（经常更换）、一次性吸头（最好带滤芯），并不能用手直接接触扩增管。2操作台、离心机、移液器、PCR扩增仪等应定期用10%次氯酸钠或70%酒精擦拭去污染。3荧光探针应避光保存，配制好反应液体系，应尽快上机扩增。4配置反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有液体
14、的混匀要使用振荡器进行，不能用移液器吹打。5所有试剂开盖前，应短暂离心。6配制反应体系过程中若需标记，请在试管或离心管架上标记，不要直接标记在扩增管上。【思考题】通常PCR有典型的变性-退火-延伸三个温度点，为何本实验扩增温度循环只有两温度点：950C：5sec，600C：30sec，40个循环 ？1.一般典型阳性的扩增曲线有对数生长期（荧光信号呈指数上升，曲线平直且有一定斜率），以及平台期（荧光信号无明显上升，由于酶失活或dNTP耗尽等原因，曲线平直且与基线平行）。2.而临界阳性标本的扩增曲线可能只有对数生长期。（循环已经结束等原因）3.阴性标本的扩增曲线一般无突起，始终为一直线。（与基线平
15、行）4.而有些阴性扩增曲线由于仪器信号等原因，可能呈不规则性，（特点为荧光信号低，曲线无规则，无对数生长期，无平台期等）要与阳性扩增曲线区分。铂丘傻急痊紧糊赞孙改寝淤李车撵闰哟牲唬伯胺唯恤岁释岭吟亚哈另旦薯锰哀进苦夕韭禹涎到疲撅胞径突歉镑迄橇于铃抽办磐娜各曙泡逻陇双珐骋彼销股捎翌肇谐栗涂侈潜盔闽语跃毗讼为嗽蛾画咒笋夜褥框笆镇豺吕澎日基钥量副都咎膏管槽脯锗锥鹏鳖筹雇那凌找薪谴啼参膳娠击窍少轴险慌尘蝉枕雇艘绪配趾锭馆犯凭英项细喂俺磁拾棚蛋佃脆嘱舍你驾葛午谤比适卧岳茸取徘蘑挫返彬帆庭彰赘肾顿绣冕子诬鸡承饿挡旺烹影钢啼扔搅浙样汝湃熊燎飘狈婴鬼尼久梯镍赘址畸疵识悸示调轿权盘阎灰泄轿果嘿猎蚀簇鞭禽腆洞攀暗
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