免疫测定技术的最新应用和发展趋势――访李金明教授

《免疫测定技术的最新应用和发展趋势――访李金明教授》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫测定技术的最新应用和发展趋势――访李金明教授（16页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、免疫测定技术的最新应用和发展趋势访李金明教授访谈前言：李金明教授，卫生部临床检验中心临床免疫室主任，研究员，负责全国医院和血站实验室感染性疾病临床免疫学和PCR检验以及自身抗体免疫检验室间质量评价工作，并从事相关方面的研究，研究方向为临床分子诊断方法及标准化。本期临床实验室的主题为免疫，广大读者希望利李教授能将工作与研究中的经验与心得与我们分享，更好的推动免疫测定技术的临床应用与发展。临床实验室：李主任, 您好！您是国内临床免疫检验方面的权威专家，本期临床实验室杂志的专题是免疫，非常荣幸邀请您作为我们本期专家访谈的嘉宾，进行关于免疫测定技术的最新应用和发展趋势的讨论。首先请您介绍一下免疫检验的

2、发展历程。李教授：众所周知，现代免疫学的发展与微生物学尤其是细菌学是密不可分的，临床免疫测定技术的发展亦是如此。临床免疫检验技术的出现最早可追溯至十九世纪末。1896年，Widal发现在一定浓度的伤寒杆菌中加入伤寒病人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验（Widal test）。该试验出现后，一百多年来一直用于临床检验。稍后，1897年Kraus又发现将细菌培养液与其相应的抗血清混合后可发生肉眼可见的沉淀反应，于是，免疫沉淀试验又应运而生。到1900年，维也纳大学病理解剖系的年仅32岁的助教L

3、andsteiner发现一些人的血浆能使另一些人的红细胞凝集，这种同种凝集现象的发现，成为人类血型分类的基础，并由此而衍生了生物科学中的一个特殊分支即免疫血液学，Landsteiner也因人类血型的发现获得了1930年的诺贝尔生理学或医学奖。并且，直至今天，我们仍然在使用基本的红细胞凝集试验鉴定ABO血型。在同一年代，Bordet又发现了补体结合试验（Complement fixation test, CFT），即抗原抗体反应后具有补体结合的能力，如红细胞与溶血素反应后，如有补体存在即可出现溶血现象。因此，利用这种免疫溶血机制做指示系统，可以检测另一反应系统中抗原或抗体的存在与否。1906年W

4、assermann将这种试验用于梅毒螺旋体感染的诊断，建立了著名的用于梅毒血清学诊断的华氏反应。免疫沉淀和免疫凝集试验属于经典的免疫测定技术，现在仍常用的免疫沉淀试验有单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫固定电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫透射比浊、免疫散射比浊、免疫胶乳增强比浊等；常用免疫凝集试验有间接血凝试验、胶乳凝集试验和明胶颗粒凝集试验等。标记免疫测定技术标志着免疫测定技术进入到了高灵敏免疫测定的时代。1941年Coons等建立的荧光抗体技术（Fluorescent antibody technique）为定位组织和细胞中的抗原物质提供了一个直接而又有效的手段。在2

5、0世纪40年代以前，所出现免疫测定技术基本上都是定性或半定量测定方法，到50年代末60年代初，才出现完全的定量测定方法，即放射免疫试验(Radioimmnuoassay, RIA)。1960年，纽约退伍军人医院（the Veterans Administration Hospital）的Berson 和Yalow发表了内源性血浆胰岛素测定的RIA方法。高灵敏放免测定技术的出现，解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题，其发明者之一Yalow 因此而获得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖，Berson因为1972年就已去世，所以没能与Yalow一起分享这个荣誉。尽管放免测定技术的

6、出现是免疫测定技术发展史上的一个里程碑，但由于其有试剂半衰期短，实验废液难以处理，污染环境等缺点，使得其现已逐步退出在临床常规检验中的应用，而采用非同位素标记物建立标记免疫测定技术成为发展主流。1966年，法国巴斯德研究所的Avrameas和Uriel以及美国的Nakane和Pierce同时报道了酶免疫测定技术。其将酶替代荧光素，用于抗原在组织中的定位，可通过光学显微镜和电子显微镜来观察。并且Avrameas报道了将酶通过戊二醛方法标记抗原和抗体的理想条件。60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann、荷兰Organon公司的VanWeeman和S

7、chuurs等以及法国巴斯德研究所的Avrameas等同时发展了一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。Engvall和Perlmann以碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）作为标记物，建立兔血清IgG的定量ELISA测定方法。VanWeeman和Schuurs则以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作为标记物，建立定量检测人尿中hCG的ELISA方法。Avrameas等以酶标记抗原建立了血清IgG测定方法。这种简单方便的免疫测定技术出现后，不但

8、成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。其后，1972年Rubenstein等又建立了一种无需分离洗涤步骤的均相(Homogeneous)酶免疫测定技术酶放大免疫分析技术(Enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT)，这种测定技术主要限于小分子物质如药物等的测定应用。随着70年代中期杂交瘤技术的发展，出现了单克隆抗体，其应用于免疫测定，极大地提高了免疫测定的灵敏度和特异性，且为不同免疫测定方法的设计提供了广阔的想象空间，各种免疫测定技术相继出现，如一步法双抗体夹心酶免疫测

9、定，各种均相酶标或同位素标记免疫测定方法等。到了80年代，研究人员又发现胶体金可以作为抗体的标记物，建立简便快速的免疫渗滤层析试验，即所谓的金标试纸条。进入90年代，基于不同测定原理不同标记物（酶、发光物、元素化合物等）的各种自动化免疫分析仪，不断应用于临床检验，给我们实验室的日常工作，不但带来了很大的便利，而且其测定较之人工操作更为稳定和准确。自上世纪90年代以来，基因工程免疫测定试剂和基因工程抗体的发展，又一次拓宽了免疫测定技术的发展途径。综观免疫测定技术一百多年的发展历程，可以看出，这种建立在抗原和抗体特异相互作用基础上的临床检验技术，已成为我们认识了解生命未知物质的一个难以替代的手段，

10、其发展的每一步都来自于相关学科研究认识的深入。如果说抗原和抗体特异相互作用，只是免疫测定技术的基本框架，那么标记物、单克隆抗体、固相支持物等等就像是这个框架上最丰富多彩的外装。临床实验室：相对于临床来说，常用的免疫检验项目与临床意义都有哪些？李教授：常用的临床免疫检验项目主要可分为：（1）病原体抗原和抗体。如乙肝“两对半”（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）、抗-HBc IgM、抗-HAV IgM、丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）、人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）、梅毒抗体、风疹病毒抗体（IgM、IgG）、弓形虫抗体（IgM、IgG）、巨细胞病毒抗体（IgM、IgG）

11、、单纯疱疹病毒抗体（IgM、IgG）等。（2）肿瘤标志。如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）、CA19-9、CA125、CA15-3、CA50、CA72-4、CA242、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、组织多肽特异抗原（TPS）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）等。（3）特定蛋白。如C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白及亚类、补体C3和C4、抗链球溶血素O(ASO)、类风湿因子(RF)、前白蛋白(Prealbumin)、白蛋白(Albumin)、微白蛋白(Microalbumin)2微球蛋白(2Microglobulin)、1抗胰蛋白酶 (1

12、AT)、铜蓝蛋白(Caeruloplasmin)、结合珠蛋白(Haptoglobin)、转铁蛋白 (Transferrin)、载脂蛋白A（APO-A1）、载脂蛋白B（APO-B）等。（4）激素。T3、T4、促甲状腺激素（TSH）、皮质醇（Cortisol）、卵泡刺激激素（FSH）、促黄体激素（LH）、孕酮、泌乳素（PRL）、睾酮、雌二醇、C-肽、胰岛素、肾上腺激素等。（5）自身抗体。如类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗ENA抗体、抗组蛋白抗体、抗核小体抗体、抗线粒体抗体、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体（cANCA/pANCA）、抗甲状腺球蛋白抗体等。其他还有治疗药物监

13、测（地高辛、苯妥英、茶碱、丙戊酸、卡马西平等）、肌钙蛋白等。在临床意义上，病原体抗原和抗体的检测主要是用于判断相应病原体的感染状态（急性或慢性感染、病原体携带等），一些如抗-HBs可用于疫苗免疫效果的判断。肿瘤标志由于没有很好的器官特异性，主要用于恶性肿瘤的治疗疗效、复发监测，一般不能用于健康体检肿瘤筛查和诊断，只有个别的项目如AFP、PSA可用于高危人群的健康体检。特定蛋白为血液中具有多种功能的蛋白，如载体蛋白、免疫球蛋白（抗体）、酶、凝血因子等，其含量变化通常与多种疾病有密切关系。如CRP是急性时相反应的一个极为灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸

14、润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病史，有助于随访病程。有研究认为，CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素，其危险程度是血液中过量胆固醇的2倍。CRP含量高的人患高血压的危险率比胆固醇高的人大1倍。如果炎症和过高的胆固醇同时出现的话，那么患心脏病和中风的危险率比正常的人要高出9倍。由此可见，CRP含量高和患心脏病呈正相关。此外有研究发现，血中高浓度的CRP是结肠癌发病的危险因素，并认为CRP可能是结肠癌的一个早期标志物。免疫球蛋白及其亚类浓度在不同年龄段有所差异，在某些疾病情况下，如慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、骨髓瘤、无症状性单克隆病、遗传性或获得性抗体缺乏症、

15、混合性免疫缺陷综合症、选择性缺乏症，蛋白丢失性肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良，免疫抑制剂治疗儿童常见的反复呼吸道感染、经常腹泻、发育迟缓等症状以及经常发生的许多呼吸道疾病如中耳炎、鼻窦炎、肺炎、气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张以及哮喘等，这些指标的浓度将出现升高或降低，从而具有疾病诊断价值。补体含量下降并不一定代表免疫功能障碍或免疫缺陷，因为在缺血、凝固性坏死和中毒性坏死时，组织能释放较多的蛋白分解酶，导致补体溶血活度和补体组分的下降；血补体浓度升高，常见于各种炎症性疾病及阻塞性黄疸、急性心肌梗塞、溃疡性结肠炎、糖尿病、急性痛风、亚急性和急性甲状腺炎、急性风湿热、皮肌炎、多发性肌炎；混

16、合性结缔组织病；结节性动脉周围炎等。其他特定蛋白的临床意义可参考相应专业书籍。激素测定中不同的激素指标则用于各种内分泌疾病的辅助诊断。如T3、T4和TSH用于甲状腺功能的辅助诊断；LH、FSH和TSH用于判断下丘脑-垂体-性腺轴功能；泌乳素升高则与垂体泌乳素瘤、垂体生长激素瘤、原发性肾上腺和甲状腺功能减退、肝病等有关，降低则与垂体前叶功能减退有关。其他激素测定的临床意义可参考相应专业书籍。自身抗体检测主要是用于自身免疫病诊断、疾病状态判断和疗效监测。临床实验室：现在广大临床工作者对免疫检验项目正常值的设立和质控存在疑惑，您对此有何见解？李教授：正常值又称“参考范围”，这个概念属于定量测定范畴。

17、长期以来，我国临床定量测定（包括定量免疫测定）所使用的“参考范围”基本上源于国外教科书，是非黄种人的数据，从严格意义上说不适合于中国人群，但长期以来的使用并没出现大的问题，原因可能有两个：（1）绝大部分指标的“参考范围”在不同人种间的差异不大，再加上较大的“参考范围”，不会影响到临床医疗实践中临床医生的决策。（2）绝大部分定量检测指标其所具有的疾病诊断价值基本上处于辅助诊断的地位，其本身（单独一个指标）对疾病诊断并不具备决定性意义。在临床医学实践中，不管是实验室工作人员，还是临床医生，可能有很多对“参考范围”看得很重，其实之所以称之“参考范围”，其内在含义就是仅供“参考”，对于特定的患者来说，

18、其某一个免疫检测指标的定量值是否正常，最重要是对其这个指标的长期的检测观察，比如说，某个人某个指标稍高于或稍低于“参考范围”，似乎不正常，但如果该人这个指标长期的检测值变化不大，则说明该个体的“正常值”要稍高于或稍低于人群的“参考范围”，其并无任何的疾病指示意义。所以临床检验的“正常值”，从某种意义上说，也是具有个体化特征的。关于免疫检验的室内质量控制，临床实验室工作人员常感到很困惑，不知从何做起。原因主要有以下几个：（1）ELISA测定的手工操作。现今临床生化检验基本上都使用全自动生化分析仪，仪器均带有质控作图软件，实验室工作人员基本上不用怎么费事即可完成质控任务。而免疫测定最为常用的ELI

19、SA多为手工操作，一般没有质控作图软件，需要实验室技术人员自己独立去绘制及确定判断失控的规则，所以难免会觉得有难度。（2）对室内质控的意义理解不够。可能有相当部分的实验室做室内质控，只是当做一件任务去完成，按规则在控即万事大吉，而缺乏对室内质控的定期充分分析，从分析中发现测定中可能存在的质量问题。（3）免疫测定的特点。免疫测定可分为定量和定性两类，对定量测定，采用生化检验常用的统计质控方法如L-J质控图方法，觉得比较容易理解。对定性测定，由于不同批试剂盒间对同一份质控样本的测定的S/CO值差异可能会较大，感到很难使用类似定量测定的L-J质控图方法，对“即刻法”了解不多，不知如何应用。（4）快速

20、免疫测定如胶体金（硒）试纸条检测的质控问题。这种“床边”测定方法不需要采用室内质控品进行即时检测的室内质控，因为试纸条本身已有质控，如通常的“质控或对照线”。实际上，免疫测定，不管是定性还是定量，如采用统计学质控方法，同生化及其他检测是相通的，统计质控方法的基本依据是一件事情发生的概率，如一件发生概率很小（如0.27%或5%）的事件发生，我们就将其视为有可能是测定错误所致（即视为失控），此时就需要分析原因，确定是否有错误发生，必要时对全部或部分样本进行重新检测。L-J质控图方法的13S规则，其内在统计学含义就是出现了概率0.27%的事件，12S规则就是出现了概率5%的事件，后者，显然假失控的概

21、率太大，所以，我们通常将12S作为告警规则。限于篇幅，这里只是对有关质控问题进行一个简单的解释，具体可以参考相关的专业书籍，如全国临床检验操作规程（第三版）和临床酶免疫测定技术（李金明编著，人民军医出版社 2005）。临床实验室：免疫测定技术的临床应用发展最快、最具前途，请您介绍一下免疫测定技术的最新应用。李教授：在临床检验中，可以说免疫测定技术的应用非常广泛，这主要是因为免疫测定技术中的抗原和抗体的结合特点所致，换句话说，只要是能得到某物质的特异抗体，就可以建立该物质的免疫测定方法，反之亦然。所以，一些以前需要采用复杂的化学方法和物理方法如高效液相层析、色谱和质谱等检测的物质，现在有很多都可

22、以使用简单价廉的免疫学方法检测，如糖化血红蛋白（HbA1c）、小分子药物和激素等。我们说，免疫测定技术很具有发展前景，与单克隆抗体技术、基因工程技术乃至物理学、化学和材料科学的发展是分不开的，也得益于其测定模式相互结合。如四代丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）测定ELISA方法的发展、可测出HBsAg变异体的ELISA试剂盒的出现、结合液相抗原抗体结合磁性微球固相分离的全自动免疫分析方法（较固相ELISA方法的测定时间大大缩短）、利用胶乳凝集增强敏感性的胶乳增强散射免疫比浊法、均相的克隆酶供体免疫测定(cloned enzymedonor immunoassay，CEDIA)、西门子公司的均相免疫

23、测定方法发光氧通道试验（The luminescent oxygen channeling assay，LOCITM)、流式荧光免疫测定技术（Luminex，又称液相芯片）、蛋白芯片技术等。 临床实验室：以上免疫测定技术与临床相结合时存在哪些难点？如何突破呢？李教授：免疫测定技术多种多样，免疫测定新技术仍层出不穷，以上免疫测定技术绝大部分都较为成熟，可以很好的用于临床实验室实际检测应用，一些免疫测定技术目前仅限于研究，如免疫PCR、纳米颗粒标记免疫技术、量子标记免疫测定技术以及一些免疫传感器等。免疫测定技术的发展，要做到可以在临床实验室常规实际应用，必须达到以下基本要求：（1）简便易行；（2）

24、特异灵敏，结果准确；（3）有可重复性。在研发新的临床免疫测技术或方法前，不能只是追求“概念”新奇，使本来可采用简单方法解决的问题复杂化，以及一些只能用于科研的方法去尝试用于临床常规检测，如目前仍有很多人关注的一些蛋白芯片测定方法、蛋白质组学方法等。这些方法通常较常用常规方法复杂很多，最大的问题是通常没有可重复性，临床无法应用。因此，有关的试剂和/或仪器生产厂家，在将某种新的免疫测定技术用于临床检验前，首先要思考的一个问题是，新技术与现有方法之间相比，有什么样的优点，是更为简便快捷，还是更灵敏特异，以及试剂成本价格是否更低廉。其次要考虑的，就是这种技术或方法的成熟程度，也就是能不能实际应用。临床

25、实验室：根据上述免疫测定技术的最新应用，您认为临床免疫检验的发展趋势是什么？李教授：免疫测定技术不存在落后和先进之分，经典的免疫沉淀和免疫凝集试验，我们至今乃至以后相当长的一段时间，都是临床实验室的常规免疫检验方法，有其独特的应用领域，如不需要高灵敏方法的体内含量较变的物质的测定，如特定蛋白、一些感染性疾病的抗体等。标记免疫测定技术的发展主要在于各种新标记物的出现，如纳米粒子标记、量子标记、荧光素及其淬灭剂标记（利用于荧光共振能量转移原理的均相免疫测定方法）等。随着抗体制备技术、基因工程技术、物理学、化学和材料科学的发展，临床免疫测定技术将不断发展，从可以准确预测来看，无疑是自动化，利用各种测

26、定原理的全自动免疫分析仪将不断地用于临床检验，这是与临床检验要求结果准确、重复性好、操作简便、结果报告快速分不开的。免疫测定新进展(陶义训）作者：上海市临床检验中心 陶义训教授 免疫测定（immunoassay，IA）是利用抗原抗体反应检测标本中微量物质的方法。基于抗原抗体反应的特异性和敏感性，免疫测定的应用范围遍及医学检验的各个领域。任何物质只要能获得相应的特异性抗体，即可用免疫测定进行检测。可测定的对象包括：具有免疫活性的免疫球蛋白、补体、细胞因子等；微生物的抗原和相应的抗体；血液凝固因子；以及临床化学测定中微量而难于分离的物质，如蛋白质、同工酶、激素、药物、毒品等。 由于免疫测定在医学检

27、验中的地位日益重要，近年来新方法、新技术不断出现。从总体上说，其进展主要在自动化和简便化两个方面。1 免疫测定自动化1，2，3 随着检验医学的发展，检测项目和标本量急剧增加，在大型实验室中自动化系统取代手工操作是必然的趋势。20世纪50年代生化自动分析仪即取得实际应用。免疫测定在技术上有其特殊性，自动化发展较迟，20世纪80年代后才有自动化分析系统问世。目前除放射免疫测定外，几乎所有的免疫测定方法均可进行全自动分析。 按分析过程的不同，免疫测定可分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两大类。标本中的抗原与试剂抗体反应后，形成结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗体；测定

28、两者之一即可计算出标本中抗原的含量。在一般情况下需将结合的（B）和游离的（F）分离后再进行测定，此为异相。在特殊情况下，B和F具有不同的特性，不必分离即可进行测定，此为均相。均相和异相两种免疫测定在自动化系统的设计中具有各自的特点。1.1 均相免疫测定1.1.1 免疫浊度测定 这是最简单的免疫测定方法。标本中待测抗原与试剂抗体（一般为特异性抗血清，也可用抗体包被的微粒以提高敏感度）混合，反应后形成颗粒性的抗原抗体复合物而导致反应液混浊，而剩余的游离抗体不产生浊度。因此不必进行B和F的分离即可通过浊度测定而计算出标本中抗原的含量。 免疫浊度可以采用临床化学中的透射浊度法（turbidimetry

29、），通过测量透射光的减弱而进行测定。因此只要有合适的试剂，可以在生化分析仪中作全自动分析。另一种方法为散射浊度法（nephelometry），通过测量颗粒的散射光以反映浊度的强弱。散射浊度仪一般与试剂配套供应。全自动分析系统有Beckman-Coulter公司的Array和Immage，以及Dade-Behring公司的Nephelometer 100和BN ProSpec等。Array和Nephelometer 100已被广泛应用。新型的Immage 和BN ProSpec将于2002年在我国推出。免疫浊度测定的敏感度约为50ng/ml，最适用于测定血浆蛋白的含量。1.1.2 均相标记免疫测

30、定 用于小分子物质特别是药物浓度的测定。模式为竞争法，即标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体，然后进行标记物的测定。在特定的情况下，与抗体结合的标记物失去其特性，因此不需将B与F分离即可直接测定F中标记物的量。1.1.2.1 均相酶免疫测定 1972年Syva公司开发的酶扩大免疫测定技术（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）和1992年Microgenics公司开发的克隆酶供体免疫测定（clone enzyme donor immunoassay，CEDIA）均属均相酶免疫测定，酶标记的抗原与抗体结合后，其中的酶就失去其活性。酶活力的

31、测定方法与临床化学法相同，因此应用这两种方法的试剂在生化自动分析仪即可进行标本的检测。也有专用于EMIT和CEDIA的全自动分析仪。1.1.2.2 荧光偏振免疫测定 在荧光偏振免疫测定（fluorescence polarisation immunoassay，FPIA）中，荧光素标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体，反应后用单一平面偏振的光源照射，荧光素被激发产生偏振荧光。偏振荧光的强度与分子转动的速度成反比。标记抗原与抗体的复合物分子量大，旋转慢，偏振荧光强；游离标记抗原的分子量小，偏振荧光弱。因此不需进行B和F的分离即可进行测量。这一技术在20世纪80年代即被Abbott公司用于药

32、物浓度的测定，其开发的自动分析系统名为TDx。1.2 异相免疫测定 大部分标记免疫测定均属异相。最常用的B和F的分离手段为固相载体的洗涤，但在临床化学测定中无此步骤。因此异相免疫测定的自动化不能借助于生化自动分析仪，各种方法均有其特殊的自动分析系统。1.2.1 固相酶免疫测定 通用的名称为ELISA，即酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay）。在ELISA中通常用聚苯乙烯为固相载体，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等类型。不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置。 1.2.1.1 微孔板式自动分析仪 不同厂家生产的板式ELISA试剂种类繁多，但均

33、采用规格统一的812的96孔微板。因此仪器厂生产的板式ELISA自动分析仪均为开放式的，即适用于各家的试剂产品。微孔板每一孔的彻底清洗是ELISA的关键，亦是自动分析的难点。因此直至近年才有全自动的板式分析仪问世。Bio-Rad公司的CODA自动酶免疫分析仪和Dynex公司的DIAS型微孔板自动处理系统均可同时进行多块微板的全自动测定。1.2.1.2 其他形式固相载体的自动分析仪 微孔板以外的固相载体形式，其自动分析系统均为试剂与仪器配套型的。 管式载体的特点是小管可同时作反应和比色的容器。Boehringer Mannheim公司开发的ES300型分析仪是管式的配有专用试剂的全自动分析系统，

34、在国内曾被不少单位采用。但自该公司并入Roche公司以后，各型ES仪器已停止生产。 Abbott公司最早采用0.6cm直径的小珠作为载体，小珠放在相应大小的塑料孔盘中滚动冲洗，属半自动类型。Roche公司的COBAS CORE自动分析仪则采用粒径较小的小珠，为全自动的分析系统。 Abbott公司应用胶乳微粒作为载体的MEIA（微粒子酶免疫测定）自动分析系统较小珠型更为先进，胶乳微粒可吸附在玻璃纤维膜上进行洗涤。这种自动分析系统称为IMx，现在与TDx（见1.1.2.2）合并组成全能型的Axsym系统。 磁性微粒表面积大，可用磁铁吸引进行分离，是较为理想的载体。瑞士Serono公司的酶免疫分析仪

35、属此类型。这种载体已被其他标记免疫测定所采用。1.2.2 时间分辨荧光免疫测定 早在1941年荧光抗体已应用于免疫组化技术。但荧光免疫测定则发展较迟，作为定量分析必须克服荧光本底高和荧光猝灭的难点。1983年Soini和Kojola用新型的荧光物质作为标记物，建立了时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay）。其基本原理是镧系元素铕螯合物被激发后产生的荧光寿命比一般的荧光长，因此可待短寿命的本底荧光衰退后再进行测量。以此原理开发的自动分析仪称为DELFIA（dissociation-enhanced lanthanide fluoresc

36、ence immunoassay），现在由芬兰Wallac公司生产。固相载体亦为微孔板。与板式ELISA分析仪的主要不同点为采用特殊的时间分辨荧光计进行测量。1.2.3 化学发光免疫测定 化学发光免疫测定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是近年来发展的标记免疫测定。化学发光底物在化学反应后发出的光子可通过发光光度计（luminometer）进行测量。化学发光免疫测定分三种类型，均有自动分析仪器供应。1.2.3.1 化学发光酶免疫测定 这是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。Amersham公司早期开发了以过

37、氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性的化学发光酶免疫测定系统AMERLITE，经Johnson & Johnson 公司改良后商品名为VITROS Eci。Beckman Coulter公司生产的ACCESS应用的标记酶为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒。特殊的试剂组合保证了测试的稳定性和重复性。类似的分析系统有Diagnostic Production Corporation 公司的IMMULITE。1.2.3.2 化学发光免疫测定 这是以化学发光底物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱

38、性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。Chiron公司生产的ACS180是以吖啶酯为标记物、以磁性微粒为载体的自动分析系统，可作为这一类型的代表。该仪器现由Bayer公司生产，新的型号ADVIA CENTAUR将于2002年在我国推出。应用一种性能优良的吖啶酯衍生物，Abbott公司开发了新型化学发光免疫测定系统ARCHITECT，亦将于2002年在我国上市。1.2.3.3 电化学发光免疫测定4 电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）的原理为：发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价

39、钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。 Boehringer Mannheim 公司利用电化学发光原理开发的免疫测定系统称为ELECSYS，1997年投入大量生产。在该系统中并采用链霉亲和素包被的磁性微粒，配以生物素结合的抗原或抗体，使反应几乎在液相中进行，具有敏感、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。ELECSYS有1010和2010两种型号，现由Roche公司生产。新产品为模块式的E170仪器，将于2002年在我国推出。2. 免疫测定简便化 免疫测定另一方面的进展为简便化。简便

40、化的特点是：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定。近几年发展的固相膜免疫测定5完全符合以上要求，成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT）6中广为应用的方法。 固相膜免疫测定的特点是以硝酸纤维素膜为载体和有色微粒作为标记物。最常用的标记物为红色的胶体金，因此一般称为金免疫测定。在这种测定中，B和F的分离有渗滤和层析两种形式。2.1 金免疫渗滤试验 免疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）始创于1985年，最初以酶作为标记物。1989年Du Pont公司推出了用于检测

41、抗HIV抗体的金免疫渗滤试验（GIFA），确立了GIFA的基本技术。 GIFA是只需试剂，不需仪器的检测方法。试剂盒有两个主要组份：一个为金标记的抗体，另一为渗滤装置。该装置为一充满吸水垫料的塑料小盒，盒盖中央小孔下放置硝酸纤维素膜一片，膜上包被抗体或抗原。试验时将标本滴加膜上，通过渗滤抗原抗体在膜上反应；然后滴加金标抗体，渗滤反应如上。阳性结果在膜上出现红色斑点。全过程在数分钟内完成。 90年代初期GIFA展开了多方面的研究和开发，用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。国内1991年即有GIFA试剂生产，用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂取得了广泛应用。 2.2 金免疫层析试验6 1

42、990年Oskiowicz等建立了免疫层析试验（immunochromatography assay,ICA），其原理与IFA相同；不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流（flow through），而是基于层析作用的横流（lateral flow）。Oskiowicz应用的标记物为胶体硒，其后一般均采用简便的胶体金，称为金免疫层析试验（GICA）。 GICA试剂为试纸条形式。在一塑料片条上依次粘贴如下组份：（1）吸水纸；（2）玻璃纤维膜，膜上固定着干燥的金标抗体；（3）硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状的抗体；（4）吸水纸。以上各组份首尾互相衔接，因此在（1）处滴加液体标本，液流即向（4）处移动

43、。当液体到达（2）处时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应而形成复合物。液流继续前移至（3），金标记的复合物再与膜上的抗体结合而呈现红色的线条，多余的金标抗体继续前移至（4）处。 GICA的特点是单一试剂，一步操作。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。 GICA试剂结构简单，小型实验室即有条件开发生产。近年来发展生产GICA试剂的单位如雨后春笋，目前试剂的品种已多达数十种，测定项目包括HCG、LH等激素，肿瘤标志物，传染病的抗原和抗体，心血管病标志物等，并有继续发展的趋势。 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制7。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定

44、一般只能用于定性试验。最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求7。另一种类似的定量测定心肌标志的免疫层析测定系统，应用荧光物质作为标记物，由美国Biosite公司生产，商品名TRIAGE Cardiac Panel6。3 结束语 随着免疫学技术和自动化技术的发展，免疫学测定取得了突飞猛进的发展。值得注意的是，不论自动化还是简便化，直接的研究和开发几乎全部由生产单位所推动。回顾国内，国产自动分析仪尚属空白；

45、国内免疫测定试剂的生产正在向高质量和稳定性方面努力，创新产品凤毛麟角。可喜的是进入新世纪以来，在简便化的领域中国内已研发出与国际同步的检测系统，如AFP和HCG的金标定量测定系统和测定肿瘤标志的蛋白芯片系统均即将问世。相信在不久的将来在免疫测定的领域中我们一定能跻身于国际先进行列。 参考文献1陶义训主编.免疫学和免疫学检验.第2版.北京:人民卫生出版社,1997,140-180 2Gorman EG,Arentzen R,Bedzyk W,et al.An overview of immunoassay automation.In:Price CP,Newman DJ,eds.Principl

46、es and practice of immunoassay.2nd ed.U.K.:Macmillan Reference Ltd,1997,300-3233. Chan DW.Automation of immunoassays.In:Diamandis EP, Christopoulos TK, eds. Immunoassay. San Diego:Academic Press,1996,483-5044郑佐娅,陶义训.电化学发光免疫测定.临床检验信息,1998,5:10-125陶义训.固相膜免疫测定.上海医学检验杂志,2000,15:258-2606Price CP,Hicks JM

47、,(eds).Point-of-Care Testing.Washington:AACC Press,1999 7. Muller-Bardorff M,Rauscher T,Kampmann M,et al.Quantitative bedside assay for cardiac troponin T:A complementary method to centralized laboratory testing.Clin Chem,1999,45:1002-1008ELISA实验原理: 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中依次加入标本或者标准品、生物素化的抗体、HR

48、P-标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物显色。底物在过氧化物酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的目标蛋白呈正相关。用酶标仪在(450nm)波长下测定测定O.D.值(吸光度)，计算样品浓度。 ELISA Test principle: The microtiter plate provided in ELISA Kit has been precoated with an antibody specific to the target protein. Standards or samples are then added to the appropria

49、te microtiter plate wells with a biotin-conjugated specific polyclonal antibody preparation,and Avidin conjugated toHorseradishPeroxidase(HRP) is added to each microplate well and incubated. Then a TMB substrate solution is added to each well. Only those wells that contain target protein, biotin-con

50、jugated antibody and enzyme-conjugated Avidin will exhibit a change in color. The enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm 2 nm. The concentration of the samples is then dete

51、rmined 为了获得更理想的ELISA实验结果，请您 1、在ELISA实验过程中，请精确配制标准品及工作液A和B，以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差； 2、在ELISA实验过程中，酶标板在温育时应加膜覆盖以避免液体蒸发； 3、在ELISA实验过程中，检测液 A 和检测液 B，以及底物溶液在使用前，应置于37温育30分钟待用； 4、在ELISA实验过程中，洗板后应尽快进行下一步操作，避免酶标板长时间处于干燥状态。 In order to obtain the optimalELISA results 1During ELISA assay operation, Please carefull

52、y reconstitute Standards or working Detection Reagent Aand B according to the instruction and avoid foaming and mix gently until the crystals have completely dissolved; 2During ELISA assay operation, Proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary; 3During ELISA assay operation

53、, Substrate, Detection Reagent Aand Detection Reagent B should be incubate for 30 min at 37 before use;4During ELISA assay operation, After the every step of aspiration / wash, please do not delay entering into the next step in order not to let the assay plate too dry.在一般的概念里，ELISA技术的可操作性强，不需复杂设备，甚至

54、完全手工加样、洗板和肉眼判读结果，便可完成该技术的操作。随着人们对质量控制意识的加强，尽可能做到最低限度的减少系统误差，以及减少劳动强度等观念的不断改进，解决ELISA技术中加样、温育、洗板及判读结果过程的系统误差问题及高效率运作问题导致了自动化概念的形成。ELISA技术的加样、温育、洗板及判读结果过程的科学地、有机地、系统地结合，尽可能地减少各环节的人为因素的影响，便成为自动化ELISA技术的理论基础。 在自动化ELISA技术中，可以将整个体系分成加样系统、温育系统、洗板系统及判读系统、机械臂系统、液路动力系统及软件控制系统等几种结构，这些系统既独立又紧密联系。加样系统包括加样针、条码阅读器

55、、样品盘、试剂架及加样台等构件。加样针有两手中，一为有TEFLON涂层的金属针，另一为可更换的一次性加样头(Tip) 0有些仪器的加样针只配金属针，无一次性加样头，有些是两种针都配备。加样针的功能主要是加样品及试剂，它是靠液路动力系统提供动力，通过注射器样的分配器进行精确加样的。加样针的数量在各型号仪器上是不同的，有一根的、两根的或多根的O条码阅读器是帮助识别标本的重要工作，目前的仪器均配有此装置。样品盘除了放置标本外，还能放置稀释标本用的稀释管，供不同检测目的使用。试剂架是供放置酶标记试剂、显色液、终止液等试剂用的，有些型号的仪器这一部分是独立的，有些是并在样品盘上O加样台是酶标板放置的平台

56、，有些仪器在台上设置温育装置，让温育在台上进行O整个加样系统由控制软件进行协调操作。 温育系统主要由加温器及易导热的金属材料板架构成O有些是盒式的，有些是台式的O一般控制的温度可在室温- 50C之间。温育时间及温度设置是由控制软件需确调控的。 洗板系统是整个体系的重要组成部分，主要由支持板架、洗液注入针及液体迸出管路等组成。洗液注入针一般是8头的。每项洗板的洗板残留量一般控制在5L以内。最好设备可控制在2L内。洗板次数可通过软件控制实现并可更改次数。 读板系统由光源、激光片、光导纤维、镜片和光电倍增管组成，是酶促反应最突结果客观判读的设备。各型号仪器的比色探头配置不一样，有单头的3也有8头的。控制软件通过机械臂和输送轨道将酶标板送入读板器进行自动比色，再将光信号转变成数据信号又回送到软件系统进行分析，最终得出结果。 酶标板的移动靠机械臂或轨道运输系统来完成。机械臂的另一重要功能是移动抽样针O机械系统的运动受控子控制软件，其运动非常地精确和到位。