铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析毕业论文

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1、安 徽 农 业 大 学毕 业 论 文（设计） 论文题目 铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析 姓 名 学 号 学 院 生命科学学院 专 业 生物技术 中国合肥二零一四 年 五 月目录中文摘要1关键词11.材料与方法21.1 试验材料21.2 试验试剂21.3 试验方法21.3.1 铁皮石斛总RNA 的提取与cDNA 第一链的合成21.3.2 引物设计21.3.3 铁皮石斛4CL基因cDNA核心片断的获得21.3.4 5RACE 和3RACE 扩增21.3.5 铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆31.3.6 序列分析32. 结果与分析32.1 铁皮石斛总RNA提取质量的检测32.2 铁皮石斛4C

2、L基因核心片段的克隆与鉴定32.3铁皮石斛4CL基因的RACE扩增与序列鉴定42.4 铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆与鉴定52.5 氨基酸序列序列比对和进化分析53. 讨论7参考文献8Abstract9Keywords9致 谢9铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析摘要：本试验采用同源扩增技术和cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends RACE）技术对铁皮石斛（Dendrobium officinale）中的4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-Coumarate:Coenzyme A Ligase 4CL）基因进行克隆。根据基因的保守性，利用NCBI数

3、据库中其他植物的4-香豆酸：辅酶A连接酶的氨基酸保守区设计简并引物。序列分析表明，该基因全长为1650bp，编码549个氨基酸，具有4CL基因家族的特异序列。系统进化树分析显示，4CL的氨基酸序列进化方向与植物基本保持一致，符合从低等到高等、从简单到复杂的演变过程。对铁皮石斛4CL 基因的克隆，为进一步研究4CL基因参与的植物次生代谢途径奠定了基础。关键词：铁皮石斛；4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）；基因克隆 铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属多年生附生草本植物，因表皮呈铁绿色而得名。按形态、产地等分类，石斛属植物可分为铁皮、金钗

4、、霍山、黄草、环草、马鞭等数十个品种，其中以铁皮石斛最为珍贵。研究表明铁皮石斛具有生津养胃、滋阴清热、护肝利胆、明目强腰的功效，此外还具有抗肿瘤、降血糖、增强机体免疫力、抗氧化衰老等疗效。在植物界，铁皮石斛素有“软黄金”“千金草”之盛誉，是民间传说中的“救命仙草”，国际上称其为“药界大熊猫”。野生铁皮石斛多生于海拔1003000m之间的山地半阴岩石或树皮上，喜温暖湿润气候和半阴湿的环境，不耐寒1。由于它生长及繁殖条件十分苛刻，自然产量极为稀少，更因环境破坏，过度采挖，致使野生资源濒临绝种。 研究铁皮石斛的代谢途径与调控，有助于更好地开发利用铁皮石斛的市场价值。 苯丙烷类化合物生物代谢途径是一条

5、与碳循环有关的最主要的次生代谢途径之一。在植物中，该途径的各种分支途径可以产生许多天然产物如黄酮、类黄酮、木质素、色素、芪类、酚酸类化合物等2。作为该代谢途径中关键限速酶之一的4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-Coumarate:Coenzyme A Ligase 4CL），控制着苯丙烷类化合物代谢途径向不同的方向进行，处在总途径向各分支途径的转折点。前人的研究结果表明，4CL基因在植物与环境的相互作用中也起着重要作用。经研究证实，除了多糖外，铁皮石斛中的酮类、芪类物质也具有重要的药理活性，如-紫罗兰酮具有抑制肿瘤生长的作用3；芪类化合物是一种抗菌的植物抗毒素，具抑菌抗氧化抗肿瘤等多种生物活性4，

6、Li Yan 等5,6曾从铁皮石斛茎中分离得到27个芪类及其衍生物。因此，研究铁皮石斛中的4CL基因，对解析铁皮石斛次生物质代谢调控及人类健康事业具有重要意义。 本文主要研究铁皮石斛4CL基因的克隆及其序列分析。以铁皮石斛为实验材料，参考其它植物4CL基因的序列，利用DNAstar软件设计简并引物，克隆铁皮石斛4CL基因cDNA片段，利用RACE ( rapid amplification of cDNA ends )技术获得该基因的3和5末端序列，进而获得该基因的全长cDNA。同时利用GenBank数据库和Blast软件等对所得序列进行分析，为进一步研究4-香豆酸：CoA连接酶在石斛次生代谢

7、途径中的作用提供理论依据。1.材料与方法1.1 试验材料铁皮石斛茎叶，取自安徽农业大学生命科学学院。1.2 试验试剂 RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司），Taq 酶、PMD18-T vector、 dNTPs和RACE cDNA Amplification Kit（均购自TAKARA 公司），Escherichia coli DH5 （由实验室制取培养），柱式胶回收纯化试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）；引物合成以及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。1.3 试验方法1.3.1 铁皮石斛总RNA 的提取与cDNA 第一链的合成 称取0.1g铁皮石斛叶片在液氮中研磨, 按

8、照RNA 提取试剂盒说明书进行总RNA 的提取,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量。 取2gRNA，根据cDNA 第一链合成试剂盒操作说明书，合成cDNA 第一链。1.3.2 引物设计利用DNAMAN 6.0软件，根据NCB I数据库中其他植物的4CL 基因的保守区设计引物 (表1)。表1 引物名称及序列Table1. Names and seqences of the primers引物用途引物名称引物序列（5-3）核心片段4CL-SGTNGCNCARCARGTNGAYGGNGA4CL-ASTCNGCNGGGNGSNACYTGRAANCC3 RACE3-inTTTGACCTCGTGAA

9、GTTGATGG3-outATGTTCTGCTCTGCGTGCTT5 RACE5-inTTAGCCGTAAGCGTATCCTG5-outCTATGGGAGGCACAAATGGCCDS 全长CDS-SATGGGCTCAATTTCGCCGGAATTCCDS-ASTCACTGTGTCAGACCATTCTGGAC1.3.3 铁皮石斛4CL基因cDNA核心片断的获得 以所得到的铁皮石斛cDNA第一链为模板进行PCR 扩增，产物经回收、纯化后连接到pMD18-T 载体上，转化后，选择阳性克隆菌液送到公司测序。利用NCBI 的BLAST 工具对所测序列进行同源性比对，确认所获序列是否为目的基因片段。1.3.

10、4 5RACE 和3RACE 扩增 根据4CL基因cDNA核心片段的测序结果设计5RACE 和3RACE 的基因特异引物(表1)。利用通用引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）和特异引物分别进行5RACE和3RACE 扩增。将扩增的产物经回收、纯化后连接到pMD18-T 载体上，送到公司测序。1.3.5 铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆 根据所获得的铁皮石斛4CL基因的保守区片段、5和3 端序列，进行序列拼接，得到4CL基因全长cDNA 的拼接序列。根据拼接序列，分别在5 端和3 端设计引物(表1)，然后进行PCR 扩增，获得全长cDNA的 克隆，送到公司进行双向测序。1.3.6 序列分

11、析 利用DNAman 6.0软件进行序列比较和构建进化树。2. 结果与分析2.1 铁皮石斛总RNA提取质量的检测 利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。如图1所示，使用改良RNA提取法所提取的铁皮石斛总RNA质量较好，28SrRNA和18SrRNA两条带比较清晰，亮度对比鲜明，无其他明显杂带，点样孔干净，说明总RNA在提取过程中没有被降解，大小完整，也没有蛋白质、DNA等其他杂质的污染，可以满足后续实验。 图1 铁皮石斛总RNA凝胶电泳图Fig.1 Gelelectrophoresis of RNA extracted from D.officinale2.2 铁皮石斛4CL基因核心片段的

12、克隆与鉴定 如图2所示，通过RT-PCR扩增技术，从铁皮石斛的cDNA 中扩增预期片段，目的片段大小约400bp，与Marker的比对可以看出扩增出的条带大小符合预期片段大小。胶回收产物经TA克隆和测序后得到该基因核心片段长度为356bp， 利用NCBI数据库中的Blast工具，对该基因核心片段进行同源性比对分析， 发现该序列与其他植物的4CL的核酸序列相似度较高， 说明所获片段为铁皮石斛4CL基因的核心片段。 1 2 3 4 5 6 7 M 图2 铁皮石斛4CL基因核心片段的扩增产物 Fig.2 The amplification products of 4CL gene core frag

13、ment from D.officinaleM: DNA 标准分子量; 1-6. PCR 扩增产物;M: DNA Marker; 1-6. PCR products2.3铁皮石斛4CL基因的RACE扩增与序列鉴定 用琼脂糖凝胶电泳进行检测3 RACE 扩增片段，电泳结果如图3所示，通过与Maker比对，可以看出3RACE扩增片段大小约为1kb。将扩增片段进行胶回收后，用PMD18-T vector连接转化，克隆测序，得到一条大小为1140bp 的片段。利用Blast工具将所得片段进行同源性比对，发现该片段与多种植物的4CL基因核酸序列相似性达80%以上，且含有终止密码子，说明3端序列完整。 用

14、琼脂糖凝胶电泳进行检测5 RACE 扩增片段，电泳结果如图4所示，通过与Maker比对，可以看出5RACE扩增片段大小约为800bp。将扩增片段回收后，克隆测序，发现该片段与核心片段有重复序列，与引物设计相符，说明这个序列为铁皮石斛4CL基因的5端序列， 测序长度为823 bp。 图3 4CL基因cDNA3端的扩增产物 Fig. 3. 3RACE product by agrose geleletrophoresis 图4 4CL基因cDNA5端的扩增产物 Fig. 4 . 5RACE product by agrose gel eletrophoresis2.4 铁皮石斛4CL基因全长cDN

15、A的克隆与鉴定 将获得的4CL基因的3、5 端序列分别和核心片断序列拼接起来。通过ORF 软件分析，结果显示拼接序列具备完整基因的序列。为进一步确认该拼接序列的可靠性，根据拼接序列分别在3、5 端设计特异引物（表1） 以铁皮石斛的cDNA 为模板进行4CL基因的全长扩增，得到1 条大小在1.6kb 左右的特异性条带，与预期拼接序列大小一致( 图5) 。克隆测序与序列比对显示，所获得的铁皮石斛4CL基因拼接序列是正确的。图5铁皮石斛4CL基因全长cDNA的扩增产物 Fig. 5 Electrophoresis analysis of the RT-RCR product of the compl

16、ete sequence2.5 氨基酸序列序列比对和进化分析 将4CL基因编码的氨基酸序列在NCBI上进行Blast分析，然后利用DNAMAN软件将铁皮石斛与其他植物的4CL氨基酸序列进行比对，结果表明它与多种植物如洋葱、大蒜、葡萄的4CL具有较高的相似性（图6）。 利用DNAMAN软件对上述氨基酸序列进行进化树分析（图7）。从分析结果可以看出，4CL的氨基酸序列进化与植物进化基本保持一致，符合从低等到高等、由简单到复杂的演变过程。不同植物4CL氨基酸序列的差异反映了物种间亲缘关系的差异。从系统进化树可以看出，除了多年生黑麦草外，这十几种植物的4-香豆酸：CoA 连接酶有着较高的同源性和较近的

17、亲缘关系，预示着植物4CL在进化过程中维系着较为保守的结构和功能。 图6 铁皮石斛4CL的氨基酸序列与其它植物4CL的氨基酸序列比对Fig.6 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of the D. officinale with other plant species图7 多种植物的4CL 氨基酸序列的进化关系 Fig.7 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of 4CL from different plants3. 讨论 本试验的关键之处是提取高质量的石斛总R

18、NA。石斛是多年生的药用植物，次生代谢产物积累丰富，多糖含量较高，这些特点给提取总RNA带来了很大的阻碍。在试验的预试验阶段，尝试了多种植物总RNA提取方法，如Trizol法、CTAB-LiCl法、热酚法等，但都有缺陷，得到的石斛总RNA不能满足后续试验的需要。最后选用了天根生化科技有限公司的RNAprep pure Plant Kit ，采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱，同时结合CTAB提取缓冲液，获得了较好的RNA提取效果。 4-香豆酸：辅酶A连接酶是苯丙烷类化合物生物代谢总途径中的最后一个酶，4CL 基因家族具有结构和功能完全不同的成员，各成员对几种常用的不同底物表现出不同的亲和催化活

19、性，从而控制着不同天然产物的生物合成2。现代研究认为4CL基因家族可分为两组，组I：拟南芥At4CL1、At4CL2，杂种杨Ptd4CL1、 Ptd4CL2 和 Pt4CL1；组II：拟南芥At4CL3，杨树 Pt4CL2。组I的4CLs主要参与木质素、细胞壁内酚酸类化合物和其它苯丙烷类衍生物的生物代谢途径；而组II的4CLs主要和类黄酮、芪类化合物的生物合成有关7。因此，在设计引物时，注意选择其他植物具有相应功能的4CL氨基酸保守区域进行引物设计。根据已登录在GenBank中其它植物4CL基因的氨基酸序列，找出连续8-9个保守的氨基酸序列，按照中心法则，遵循简并度尽可能低、退火温度尽可能相近

20、的原则设计简并引物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，在目标位置只出现了一条特异性条带。 铁皮石斛具有广泛的经济用途和优良保健作用，近年来以铁皮石斛为原料生产的高级保健品越来越多，畅销欧美及东南亚沿海发达地区。但由于野生铁皮石斛特殊的生长环境和自身繁殖极为困难8,9，再加上经济价值极高，长期无限制地采挖和不合理地开发利用导致资源越来越少，现已成为国家二级保护植物10。研究铁皮石斛的生长习性、种植方法、代谢途径、基因调控等，可以为铁皮石斛资源保护以及开发有保健价值的天然产物提供科学依据和理论基础。苯丙烷类化合物生物代谢途径是产生许多药理活性物质如黄酮类、芪类的重要代谢途径，而4- 香豆酸:辅酶A 连接

21、酶是该代谢途径的重要限速酶之一，因此对4CL基因的研究可对进一步研究芪类、黄酮类物质代谢途径提供一定依据。随着植物基因工程的发展，深入展开4CL基因的研究，不仅能揭示 4CL 的生物学功能，还将为改造 4CL 参与的生物代谢途径的基因工程提供理论依据。参考文献：1 聂少平, 蔡海兰. 铁皮石斛活性成分及其功能研究进展J. 食品科学, 2012, 33(23): 356-361.2 赵淑娟, 刘涤, 胡之璧. 植物 4-香豆酸: 辅酶 A 连接酶J. 植物生理学通讯, 2006, 42(3): 529-538.3 刘家仁, 杨艳梅, 董宏伟, 等. -紫罗兰酮对人乳腺癌细胞 (Er-) MAPK

22、 途径的影响J. 卫生 研究, 2006, 34(6): 706-709.4 孟旭辉, 张评浒, 张朝凤. 芪类化合物及其合成酶的研究进展J. 中国野生植物资源, 2010, 2 9(3): 15-20.5 Li Y, Wang C L, Wang Y J, et al. Three new bibenzyl derivatives from Dendrobium candid umJ. Chemical & pharmaceutical bulletin, 2009, 57(2): 218-219.6 Li Y, Wang C L, Wang Y J, et al. Four new bib

23、enzyl derivatives from Dendrobium candidu mJ. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 2009, 57(9): 997.7 Hamberger B, Hahlbrock K. The 4-coumarate: CoA ligase gene family in Arabidopsis thalian a comprises one rare, sinapate-activating and three commonly occurring isoenzymesJ. Procee dings of th

24、e National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(7): 2 209-2214.8 高学敏. 中药学M. 北京: 中国中医药出版社, 2002: 553.9 VELLUPILLAI M, SWARUP S, CHONG J H. Histological and protein change during early stages of seed germination in the orehid, Dendrobium crumenatumJ. J Hort Sci, 1997, 72(6):

25、941-948.10 陈立钻, 孙继军. 珍稀濒危物种铁皮石斛的保育与开发利用J. 中国林业, 2004 (11B): 34-34.Cloning of a 4-Coumarate:Coenzyme A Ligase Gene from Dendrobium officinaleAuthor: Zhang Xinyu Supervisor: Fan Honghong (School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei, 230036,China)Abstract : The study was aimed to clon

26、e and characterize a 4-Coumarate:Coenzyme A Ligase gene in Dendrobium officinale.The degenerate primers were designed according to the conservation of gene . The partial sequence with 356bp for 4CL gene was amplified by using RT-PCR technique. The completed sequence was cloned by using 3-RACE and 5-

27、RACE technique. After sequencing, the results indicate that the full cDNA length of 4CL gene is 1650bp, which encodes 549-aa protein. By blast analysis in NCBI, the deduced amino acids show highly identical with 4CL in other plants.The phylogenetic tree shows that the evolution direction of amino ac

28、id sequence for 4CL are almost consistent with plants whose evolution process is from the low to the high, from simple to complex .The cloning of a 4-Coumarate:Coenzyme A Ligase Gene provides a theoretical foundation for the further research and transformation in plants secondary metabolic pathways

29、in which4CL is involved .Keywords: Dendrobium officinale ; 4-Coumarate:Coenzyme A Ligase ; gene cloning致 谢本实验的进行及毕业设计是在樊洪泓老师的细心指导下完成的。在实验时，每次遇到不懂的问题，樊老师都是热情的帮我解答疑惑。在做毕业设计时，也有许多事情需要樊老师的指导，总之整个过程花费了樊老师很多的时间和精力，在此向樊老师表示衷心地感谢！本实验让我获益匪浅，樊老师能让我亲自参与此次实验，让我感到很荣幸，也很感激樊老师！樊老师渊博的知识、严谨的治学态度、开拓进取的精神和高度的责任心也使我受益良

30、多。在此我还要感谢实验室的吴秋菊师姐，因为在整个实验设计的过程中，吴师姐像导师一样辅导我，她的乐于助人以及热情让我感到很荣幸有这样一位好师姐。本论文的完成还受到许多其他同学的帮助，在此论文完成之际，特向他们表示感谢！我还要感谢我的父母，感谢他们用自己的辛勤汗水供我读了四年的大学！感谢我的亲朋好友、大学同学，感谢他们陪我度过四年美好的大学生活！最后，我要感谢安徽农业大学，母校为我提供了增长见识、健康成长的平台，并且感谢本篇论文中引用文献的作者们，没有他们辛苦难得的研究成果，这篇论文也不可能完成。毕业实习让我将理论知识直接转化为现实成果，使我明白动手的重要性。谨以此文献给所有关心和帮助过我的人。11